本發(fā)明涉及一種中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白測定試劑及制備方法，屬于借助于測定材料的化學或物理性質(zhì)來測試或分析材料
技術領域：
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背景技術：
：中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，NGAL)在生理條件下少量合成于骨髓中性粒細胞的中幼及晚幼階段，炎癥反應和惡性腫瘤可誘使其在多組織(如前列腺、唾液腺、肺、腎、氣道及消化道上皮等)中大量生成。NGAL是在包括腎小管在內(nèi)的一些組織器官的中性粒細胞和上皮細胞中表達的小分子蛋白。NGAL蛋白通過受體介導的內(nèi)吞作用入胞，其β-折疊桶結(jié)構(gòu)可結(jié)合并運輸鐵離子。NGAL入胞后一方面競爭性抑制細菌的鐵攝??；另一方面與細菌來源趨化物N-甲?；傲帘奖慕Y(jié)合，促進細胞釋放趨化因子、白介素，對炎癥反應起負反饋作用，參與體內(nèi)的炎癥反應。同時NGAL-鐵離子復合物可減輕缺血再灌注損傷中的氧化應激損傷，保護腎組織。NGAL在腎臟中的表達會因不同原因的腎損傷而顯著升高，并且釋放到尿液和血液中。NGAL水平可在腎損傷的2小時內(nèi)升高，因此被作為早期敏感的腎損傷生物標志物。臨床證明：腎損傷的生化指標中NGAL比BUN、CREA等試驗更敏感，具體如下：(1)NGAL與狼瘡性腎炎腎臟是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)最常受累的器官，幾乎所有的SLE患者均有不同程度的腎臟病變，表現(xiàn)為狼瘡性腎炎(LN)。血清NGAL在LN加重之前而不是在腎外疾病加重前就升高，提示LN在血清NGAL升高中的重要作用。同時由腎損害導致的GFR下降減少了對循環(huán)中NGAL的清除，使更多的NGAL在循環(huán)池中積聚，從而引起血清NGAL的升高。(2)NGAL與急性腎損傷正常情況下，NGAL在腎組織少量表達，缺血、再灌注腎損傷，血、尿中NGAL升高數(shù)百倍。在腎移植手術中，尿及腎組織中的NGAL高表達均與術后腎功能延遲恢復(DGF)相關，尿NGAL每上升100ug/L,DGF風險相應上升20％，而血清NGAL的變化則有助于判斷患者是否需要透析治療。(3)糖尿病腎病的診斷往往根據(jù)mALB，血清、尿NGAL水平在1型、2型糖尿病腎病患者尿mALB升高前已顯著增加，是診斷糖尿病并發(fā)腎損傷的靈敏指標。目前國內(nèi)測定中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白的方法主要有：(1)ELISA法，該方法操作時間長，自動化程度低。(2)化學發(fā)光法，該方法雖然靈敏度高，但不穩(wěn)定?；诖?，做出本申請。技術實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白在測試過程中存在的上述缺陷，本發(fā)明首先提供一種快速靈敏、準確性好、特異性高、穩(wěn)定性好、液體雙試劑操作簡便，采用國內(nèi)外先進的膠乳增強免疫比濁法，適用于臨床全自動或半自動生化分析(手工加樣品、試劑)的中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白測定試劑。為實現(xiàn)上述目的，本申請采取的技術方案如下：一種中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白的測定試劑，由R1試劑、R2試劑和標準樣構(gòu)成，所述的R1試劑是由PEG600溶解于添加有緩沖液、疊氮鈉的純化水中所形成的溶液；所述的R2試劑是由NGAL抗體包被膠乳解于添加有疊氮鈉的純化水中所形成的溶液；所述的標準樣是由中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白、牛血清蛋白、緩沖液和疊氮鈉溶解于純化水中形成的溶液。進一步的，作為優(yōu)選：所述的R1試劑中，緩沖液為甘氨酸緩沖液。更優(yōu)選的，PEG600的濃度為2％，疊氮鈉的濃度為0.01％，所述的甘氨酸緩沖液的濃度為50mmol/L。所述的R2試劑中，NGAL抗體包被膠乳的濃度0.2％，疊氮鈉的濃度為0.01％。所述的標準樣中，緩沖液為磷酸鹽緩沖液。更優(yōu)選的，疊氮鈉的濃度為0.1％，牛血清蛋白濃度為3％，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為50mmol/L。同時，本申請還提供了一種具有上述特征中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白測定試劑的制備方法，包括如下步驟：(1)R1試劑配制：向純化水中加入聚乙二醇600，攪拌至完全溶解；加入甘氨酸緩沖液攪拌至溶解，添加疊氮鈉攪拌至完全溶解，繼續(xù)攪拌后定容；(2)R2試劑配制：向純化水中加入疊氮鈉，攪拌至完全溶解；加入NGAL抗體包被膠乳，攪拌至完全溶解，繼續(xù)攪拌后定容；(3)標準樣配制：向純化水中加入中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白，攪拌至完全溶解；加入緩沖液攪拌至溶解，加入牛血清蛋白攪拌至溶解，加入疊氮鈉攪拌至完全溶解，繼續(xù)攪拌后定容；(4)對上述制備的R1試劑和R2試劑及標準樣的靈敏度、線性范圍、精密度和準確度進行測定。進一步的，作為優(yōu)選：所述的攪拌速度為450轉(zhuǎn)/分。攪拌速度過高會導致剪切力過大，影響所配制溶體的表面張力和粘合力，攪拌速度過低則影響其混配效果，控制在450轉(zhuǎn)/分時，在確保攪拌剪切適中的同時，也促進了其內(nèi)所添加物質(zhì)的融合。步驟(1)中，所述的純化水的初始體積為1500ml，定容體積為1600ml。定容前后體積變化在20-30％，可以很好的保證其內(nèi)所添加其他物質(zhì)良好的融合性，確保所配置的R1試劑濃度、溶液穩(wěn)定性最佳。步驟(2)中，所述的純化水的初始體積為300ml，定容體積為400ml。定容前后體積變化在25-35％，可以很好的保證其內(nèi)所添加其他物質(zhì)良好的融合性，確保所配置的R2試劑濃度、溶液穩(wěn)定性最佳。步驟(3)中，所述的純化水的初始體積為200ml，定容體積為300ml。定容前后體積變化在40-50％，可以很好的保證其內(nèi)所添加其他物質(zhì)良好的融合性，確保所配置的標準樣濃度、溶液穩(wěn)定性最佳。本發(fā)明的工作原理如下：血清樣品中的中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)能與試劑盒中的抗原-微球蛋白試劑發(fā)生抗原-抗體反應，使加入抗原的量呈線性相關，采用比濁法，使用光學監(jiān)測儀器測定反應液吸光度值。通過不同濃度的標準品繪制標準曲線定量監(jiān)測血清中NGAL的濃度。(1)靈敏度評價試驗根據(jù)GB/T26124-2011《臨床化學體外診斷試劑(盒)》中對“分析靈敏度”檢測的要求，以試劑盒在規(guī)定參數(shù)下對分析靈敏度評價用樣本進行檢測產(chǎn)生的吸光度改變，換算為n單位的吸光度的差值(ΔA)作為分析靈敏度。分析靈敏度評價試驗對分析靈敏度評價用樣本重復測定20次。評估結(jié)果：分析靈敏度600ng/ml吸光度差值(ΔA)≥0.0200ABS。(2)線性范圍評價試驗根據(jù)GB/T26124-2011《臨床化學體外診斷試劑(盒)》和《體外診斷試劑分析性能評估指導原則——線性范圍(征求意見稿)》中的建議，對試劑線性范圍進行驗證時，在待驗證線性范圍內(nèi)選擇5個濃度水平，每個濃度水平重復測定3次。(3)精密度評價試驗精密度評價包括重復性和批間差，且至少評估二個濃度水平樣本的精密度，其中有一個濃度在醫(yī)學決定水平左右。因此，重復性評價采用在重復性條件下，用二個濃度水平的控制物質(zhì)(其中一個濃度接近醫(yī)學決定水平)測試，每個濃度重復測試10次；批間差評價采用二個濃度水平的控制物質(zhì)(其中一個濃度接近醫(yī)學決定水平)分別測試3個不同批號的試劑盒，每個批號測試3次。(4)準確度評價試驗用不少于40個在檢測濃度范圍內(nèi)的不同濃度的人源樣品，以指定的分析系統(tǒng)作為比對方法，每份樣品按待測試劑操作方法及比對方法分別檢測。用線性回歸方法計算兩組結(jié)果的相關系數(shù)(r)及每個濃度點的相對偏差。評估結(jié)果：三批試劑的重復性變異系數(shù)CV≤10％；相對偏差≤15％，試劑線性可達5000ng/ml，分析靈敏度600ng/ml吸光度差值(ΔA)≥0.0200ABS。本申請利用膠乳增強免疫比濁法測定中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白的方法，其優(yōu)點是快速靈敏，準確性好，特異性高，穩(wěn)定性好，操作簡便，可適用于臨床全自動或半自動生化分析儀配套使用。附圖說明圖1為本申請中抗原-吸光度曲線圖；圖2為本申請中抗體-吸光度曲線圖；圖3為本申請中測定試劑的準確度柱狀圖。具體實施方式實施例1本實施例所用主要試劑：R1試劑：甘氨酸緩沖液：50mmol/L；PEG600：2％；疊氮鈉：0.01％。R1試劑：NGAL抗體包被膠乳：0.2％；疊氮鈉：0.01％。標準樣：磷酸鹽緩沖液：50mmol/L；疊氮鈉：0.1％；牛血清蛋白：3％。1)R1試劑的配制①將1500ml純化水加入到適當容器中。②開啟電動攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。③量取40ml聚乙二醇6000加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。④稱取0.1g甘氨酸加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑤稱取0.2g疊氮鈉加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑥攪拌十分鐘以上。⑦定容至1600ml。2)R2試劑的配制①將300ml純化水加入到適當容器中。②開啟電動攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。③稱取0.2g疊氮鈉加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。④量取4mlNGAL抗體包被膠乳加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑤攪拌十分鐘以上。⑥定容至400ml。3)標準樣的配制①將200ml純化水加入到適當容器中。②開啟電動攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。③量取5ml中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。④稱取54.6g磷酸氫二鉀加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。⑤稱取43.5g磷酸二氫鉀加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑥稱取2g疊氮鈉加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑦量取6ml牛血清白蛋白加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑧攪拌十分鐘以上。⑨定容至300ml。4)試劑檢驗①儀器配置:儀器使用日立7100全自動生化分析儀。A.測定參數(shù)嚴格按照產(chǎn)品說明書在儀器中設定，基本測定參數(shù)如下：a.方法：兩點終點法，反應方向：向上；波長：570nm(主波長),670nm(副波長)，溫度37℃。b.比色杯光徑：1cm。c.R1試劑:240μl,R2試劑:60μl，標準樣：10μl。B.第一測光點：在R1加入后5分鐘讀取；第二測光點：在R2加入后5分鐘讀取。②試劑外觀檢查：目測檢查。③裝量檢查：用通用量具測量。④試劑空白測定:用蒸餾水或去離子水作為空白樣品測試試劑盒，在測試主波長下，記錄測試啟動時吸光度(A1試劑)和約5分鐘后的吸光度(A2試劑)，A2即為工作試劑的空白吸光度。⑤線性范圍測定:取接近線性范圍上限的高值樣本用生理鹽水倍比稀釋配制成不同濃度梯度的樣本系列。以H值與稀釋比例計算出預期值。稀釋方法參照表1所示(根據(jù)高值的大小可相應調(diào)整稀釋梯度)。表1樣本稀釋表實施例12345生理鹽水(ml)00.50.50.50.5高值標本H(ml)10.50.50.50.5稀釋比例原倍1/21/41/81/16表1中：實施例1樣本的濃度為已知定值CH，實施例2-5樣本濃度按公式：樣本濃度＝CH×稀釋比例，計算作為預期值，將稀釋好的樣本系列充分混勻，在校正后的測定系統(tǒng)上按從低值到高值順序平行測定2次，均值作為對應實施例樣本實測值(如2次測定結(jié)果有明顯偏差應剔除重測)，具體參見表1。統(tǒng)計學分析：以預期值為橫坐標，樣本實測值為縱坐標作圖及直線回歸分析，見圖1所示，確定線性區(qū)間計算出直線方程y＝a+bx及相關系數(shù)，當相關系數(shù)r≥0.990時為線性良好。數(shù)據(jù)分析處理采用MicrosoftExcel軟件。相關公式如下：式中，C：濃度；V：容積；b：回歸線的斜率；∣a∣：回歸線截距的絕對值；r：相關系數(shù)；Xi：各管預期值；Yi：各管測定值；i：1、2、3.……、n；n：測定樣本數(shù)。⑥精密度測定:a.重復性測定:用臨床標本或質(zhì)控血清測試試劑盒，重復測試10次，計算測量值的平均值和標準差(s)。按如下公式計算變異系數(shù)(CV)。與變異系數(shù)CV(％)：式中：——待測血清樣本的均值；Xi——測定血清樣本的測定結(jié)果；n——測定次數(shù)；CV——變異系數(shù)。b.批間差測定取三個批號送檢試劑，每個批號取3瓶，分別測定1份臨床樣本或質(zhì)控血清，可選用羅氏質(zhì)控品，分別計算9份試劑測定均值和每個批號3份試劑的測定均值并用MicrosoftExcel軟件統(tǒng)計三個批號試劑測定的變異系數(shù)。相關公式如下:式中：——中的最大值；——中的最小值；——總均值。⑦準確性測定:比對試驗：相關系數(shù)r≥0.975。相對偏差≤15％；⑧分析靈敏度:用已知濃度或活性的樣品測試試劑盒，記錄在試劑盒規(guī)定參數(shù)下產(chǎn)生的吸光度改變，換算為n單位的吸光度差值(ΔA)。根據(jù)表1計算得到的預期值、實測值、a、b、相關系數(shù)r、變異系數(shù)CV、批間極差、相對偏差B以及吸光度差值ΔA匯總?cè)氡?。表2測試結(jié)果匯總表表3分析靈敏度對照表(1-20為平行實驗序號)123456789100.03260.03110.03090.02980.02970.02860.02840.03020.03160.0319111213141516171819200.03240.03160.03190.03460.03120.03330.03620.02950.03240.0323表4批內(nèi)重復性對照表表5批間精密度對照表評估結(jié)果及表2結(jié)果表明：三批試劑的重復性變異系數(shù)CV≤10％；相對偏差≤15％，試劑線性可達5000ng/ml，分析靈敏度600ng/ml吸光度差值(ΔA)≥0.0200ABS。本申請利用膠乳增強免疫比濁法測定中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白的方法，其優(yōu)點是快速靈敏，準確性好，特異性高，穩(wěn)定性好，操作簡便，可適用于臨床全自動或半自動生化分析儀配套使用。以上內(nèi)容是結(jié)合本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)選實施方式對所提供技術方案所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明創(chuàng)造具體實施只局限于上述這些說明，對于本發(fā)明創(chuàng)造所屬
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的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍。當前第1頁1 2 3