本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ivig中iggfab片段和fc片段唾液酸含量的測定方法。

背景技術(shù)：

靜注人免疫球蛋白ph4(intravenousimmunoglobulins，ivig)，是一種重要的人血漿蛋白制品，主要成分是免疫球蛋白igg。

唾液酸(sialicacid)是一類天然的碳水化合物，通常以低聚糖、糖脂或糖蛋白的形式存在，為9-碳單糖的衍生物。是一種能使唾液產(chǎn)生光滑感覺的負電荷離子。它不僅具有"誘導(dǎo)"入侵病菌的作用，目前認知是神經(jīng)節(jié)苷脂的傳遞遞質(zhì)，并且是大腦的組成部分。唾液酸可以阻止病菌入侵，同時也是流感病毒的受體，是流感病毒結(jié)合在黏液細胞中的結(jié)合位點。唾液酸修飾的濃度對生物大分子發(fā)揮功能有著非常重要的影響，獲得對唾液酸進行準確快速的定量分析方法對于藥物的臨床使用、質(zhì)量檢測等方面具有重要的應(yīng)用價值。

igg作為一種糖蛋白，其中唾液酸位于其fab段和fc段n-端糖鏈終端。fab段即抗原結(jié)合片段(fragmentantigenbinding,fab),相當于抗體分子的兩個臂，由一條完整的輕鏈和重鏈的vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成；與異物蛋白結(jié)合。fc段即可結(jié)晶片段(fragmentcrystallizable,fc)，相當于igg的ch2和ch3結(jié)構(gòu)域。與吞噬細胞結(jié)合。igg在酶的作用下可降解為fab片段和fc片段。

ivig中iggfc片段唾液酸化程度會影響其與fc受體系統(tǒng)的結(jié)合，對ivig發(fā)揮抗炎療效至關(guān)重要，ivig中iggfc片段唾液酸含量的多少是其治療各種炎癥疾病的重要指標。而fab段的唾液酸化程度會影響抗原抗體的結(jié)合，影響ivig在治療免疫缺陷疾病時的效果。目前對唾液酸含量的檢測，多限于樣品或生物制品總唾液酸含量的檢測，尚無專門針對fab片段和fc片段分開進行檢測，而這兩者的唾液酸含量的差異在臨床使用中有不同的意義。

根據(jù)目前藥典相關(guān)規(guī)定及已發(fā)表的分光光度法，hplc方法精確、靈敏度更高。但目前尚無文獻報道hplc-熒光法應(yīng)用于ivig制品中唾液酸含量的檢測。因此，有必要建立一種用于測定ivig中iggfab片段和fc片段唾液酸含量的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種ivig中iggfab片段和fc片段唾液酸含量的測定方法，能夠測定ivig制品iggfab片段和fc片段唾液酸含量，方法簡單，精確、靈敏度高，重復(fù)性和準確性高。

解決以上技術(shù)問題的一種ivig中iggfab片段和fc片段唾液酸含量的測定方法，所述測定方法為經(jīng)過雙鏈fc片段的純化步驟、ivig去除糖類保護劑處理步驟、唾液酸解離步驟、熒光衍生步驟、高效液相色譜檢測和標準曲線的繪制步驟，即得唾液酸總含量和fc片段的唾液酸含量；其中，fab段唾液酸含量為＝(ivig中的唾液酸總含量×ivig分子量-fc片段的唾液酸含量×fc片段分子量)/fab片段分子量，式中ivig分子量為150,000da，fc片段分子量為55,000da，fab片段分子量為95,000da。

糖類保護劑是指單糖如葡萄糖,雙糖如蔗糖、海藻糖、乳糖，聚糖有葡聚糖等，都具有大量的自由羥基。

本發(fā)明中一種ivig中iggfab片段和fc片段唾液酸含量的測定方法，包括以下具體步驟：

步驟一：待測樣品預(yù)處理：

(1)雙鏈fc片段的純化：取ivig，酶切、蛋白g層析和分子篩層析后得到雙鏈fc片段；其中層析得到的雙鏈fc片段溶液經(jīng)測定蛋白濃度后，稀釋或濃縮，獲得蛋白濃度為0.5～4mg/ml的溶液待測；分子篩的作用是將fc從酶切且經(jīng)過proteing層析后的產(chǎn)物中純化出來。

(2)ivig去除糖類保護劑處理；取ivig，分子篩層析去除糖類保護劑；

將待檢測的ivig上樣于分子篩，去除糖類組分，層析得到的溶液經(jīng)測定蛋白濃度后，稀釋或濃縮，獲得蛋白濃度為0.5～4mg/ml的溶液待測；分子篩的作用是將ivig中的igg與糖類保護劑分開。

本發(fā)明中檢測的樣本ivig，其成分中含有大量麥芽糖、蔗糖等糖類物質(zhì)作為ivig儲存的保護劑和穩(wěn)定劑，而且唾液酸也是一種糖類衍生物。現(xiàn)在唾液酸含量檢測方法中不論是色譜法還是分光光度方法，均基于發(fā)色物質(zhì)或熒光物質(zhì)與糖類的反應(yīng)，樣本中所含有的糖類物質(zhì)即便是很少的殘留也影響著測定準確性高低。本發(fā)明中檢測方法首先采取分子篩層析去除樣品中的糖類物質(zhì)，去除干擾，提高檢測準確性。

再將去除糖類保護劑后的ivig和純化后的雙鏈fc片段分別進行步驟二至步驟五處理，得ivig中的唾液酸總含量和fc片段的唾液酸含量；

步驟二：唾液酸解離：用酸性溶劑將待測樣品的唾液酸解離下來；

步驟三：熒光衍生，將苯甲酸二甲基氨基乙酯(dmb)衍生液加入步驟二中，50℃金屬浴避光反應(yīng)2.5h；單獨的唾液酸是無法被很好地被高效液相色譜(hplc)儀檢測到，需要加入與唾液酸(糖類物質(zhì))反應(yīng)的熒光衍生劑反應(yīng)后，再上hplc檢測。

步驟四：高效液相色譜檢測和標準曲線的繪制：用高效液相色譜儀進行檢測，再以標準曲線樣品梯度濃度為橫坐標，標準曲線樣品經(jīng)高效液相色譜檢測的衍生峰面積為縱坐標，采用線性方程繪制標準曲線；

步驟五：唾液酸含量的計算：

將待測樣品的經(jīng)高效液相色譜檢測的衍生峰面積代入標準曲線，計算樣品中每毫升溶液唾液酸含量，將計算的結(jié)果除以樣品溶液的蛋白濃度，即得到每mg樣品中唾液酸的含量；

其中，fab段唾液酸含量為＝(ivig中的唾液酸總含量×ivig分子量-fc片段的唾液酸含量×fc片段分子量)/fab片段分子量；式中，ivig分子量為150,000da，fc片段分子量為55,000da，fab片段分子量為95,000da。

所述步驟一中酶切條件為在ivig中加入edta-na2，l-半胱氨酸鹽酸鹽和木瓜蛋白酶，37℃，4h，edta-na2，l-半胱氨酸鹽酸鹽和木瓜蛋白酶用量比為1：5：20。

所述步驟一中第(1)步中分子篩層析為將蛋白g層析柱層析后收集的含fc片段的組分，上樣于分離范圍包含5000da-300000da的分子篩，將樣品中的各組分按照分子量分離開來，收集分子量為50000da的蛋白，即為完整的雙鏈fc片段。

所述步驟一中待測樣品溶液蛋白濃度為0.5～4mg/ml，優(yōu)化濃度為0.5～2mg/ml，更優(yōu)化濃度為0.5mg/ml。

所述唾液酸解離步驟為取300μl的1mg/ml待測樣品加入100μl0.1m三氟乙酸，金屬浴80℃，1h，產(chǎn)物經(jīng)0.22μm濾膜過濾。

所述高效液相色譜儀中色譜柱：waterssymmetryc18液相色譜柱4.6×2505μm，柱溫30℃，熒光檢測器激發(fā)波長373nm，發(fā)射波長448nm，流動相為甲醇、乙腈主超純水，其中甲醇：乙腈：超純水＝7:8:85，流速為0.9ml/min。

所述標準曲線的繪制中1mg唾液酸標準品加10ml水配制成0.1mg/ml的唾液酸標準溶液，加水分別稀釋至5、10、20、30、40ug/ml，取300μl各濃度標準品溶液，分別加入50μldmb衍生液，50℃金屬浴避光反應(yīng)2.5h，20μl進樣檢測。

本發(fā)明測定ivig制品iggfab片段和fc片段唾液酸含量，方法簡單，精確、靈敏度高，重復(fù)性和準確性高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中試驗一的唾液酸含量檢測標準曲線

圖2為本發(fā)明中試驗二的唾液酸含量檢測標準曲線

圖3-圖9為本發(fā)明中試驗一中的色譜圖

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細描述。

實施例1

一種ivig中iggfab片段和fc片段唾液酸含量的測定方法，包括以下具體步驟：

步驟一：待測樣品預(yù)處理：

(1)雙鏈fc片段的純化：取ivig，酶切、蛋白g層析和分子篩層析后得到雙鏈fc片段；其中層析得到的雙鏈fc片段溶液經(jīng)測定蛋白濃度后，稀釋或濃縮，獲得蛋白濃度為0.5～4mg/ml的溶液待測；分子篩有兩個作用，在實驗之初，對igg脫鹽；或?qū)c從酶切且經(jīng)過proteing層析后的產(chǎn)物中純化出來。

分子篩層析為將蛋白g層析柱層析后收集的含fc片段的組分，上樣于分離范圍包含5000da-300000da的分子篩，將樣品中的各組分按照分子量分離開來，收集分子量為50000da的蛋白，即為完整的雙鏈fc片段。

待測樣品溶液蛋白濃度為0.5～4mg/ml，優(yōu)化濃度為0.5～2mg/ml，更優(yōu)化濃度為0.5mg/ml。

(2)ivig去除糖類保護劑處理；取ivig，分子篩層析去除糖類保護劑；

將待檢測的ivig上樣于分子篩，去除糖類組分，層析得到的溶液經(jīng)測定蛋白濃度后，稀釋或濃縮，獲得蛋白濃度為0.5～4mg/ml的溶液待測；

本發(fā)明中檢測的樣本ivig，其成分中含有大量麥芽糖、蔗糖等糖類物質(zhì)，而且唾液酸也是一種糖類衍生物?，F(xiàn)在唾液酸含量檢測方法中不論是色譜法還是分光光度方法，均基于發(fā)色物質(zhì)或熒光物質(zhì)與糖類的反應(yīng)，樣本中所含有的糖類物質(zhì)即便是很少的殘留也影響著測定準確性高低。本發(fā)明中檢測方法首先采取分子篩層析去除樣品中的糖類物質(zhì)，去除干擾，提高檢測準確性。

再將去除糖類保護劑后的ivig和純化后的雙鏈fc片段分別進行步驟二至步驟五處理，得ivig中的唾液酸總含量和fc片段的唾液酸含量；

步驟二：唾液酸解離：用酸性溶劑將待測樣品的唾液酸解離下來；唾液酸解離步驟為取300μl的1mg/ml待測樣品加入100μl0.1m三氟乙酸，金屬浴80℃，1h，產(chǎn)物經(jīng)0.22μm濾膜過濾。

步驟三：熒光衍生，將dmb衍生液加入步驟二中，50℃金屬浴避光反應(yīng)2.5h；單獨的唾液酸是無法被很好地被hplc檢測到，需要加入與唾液酸(糖類物質(zhì))反應(yīng)的熒光衍生劑反應(yīng)后，再上hplc檢測。

步驟四：高效液相色譜檢測和標準曲線的繪制：用高效液相色譜儀進行檢測，再以標準曲線樣品梯度濃度為橫坐標，標準曲線樣品經(jīng)高效液相色譜檢測的衍生峰面積為縱坐標，采用線性方程繪制標準曲線；

高效液相色譜儀中色譜柱：waterssymmetryc18液相色譜柱4.6×2505μm，柱溫30℃，熒光檢測器激發(fā)波長373nm，發(fā)射波長448nm，流動相為甲醇、乙腈主超純水，其中甲醇：乙腈：超純水＝7:8:85，流速為0.9ml/min。

標準曲線的繪制中1mg唾液酸標準品加10ml水配制成0.1mg/ml的唾液酸標準溶液，加水分別稀釋至5、10、20、30、40μg/ml，取300μl各濃度標準品溶液，分別加入50μldmb衍生液，50℃金屬浴避光反應(yīng)2.5h，20μl進樣檢測。

步驟五：唾液酸含量的計算：

將待測樣品的經(jīng)高效液相色譜檢測的衍生峰面積代入標準曲線，計算樣品中每毫升溶液唾液酸含量，將計算的結(jié)果除以樣品溶液的蛋白濃度，即得到每mg樣品中唾液酸的含量；

其中，fab段唾液酸含量為＝(ivig中的唾液酸總含量×ivig分子量-fc片段的唾液酸含量×fc片段分子量)/fab片段分子量；式中，ivig分子量為150,000da，fc片段分子量為55,000da，fab片段分子量為95,000da。實施例2

一種ivig制品iggfab片段和fc段唾液酸含量的測定方法，包括以下步驟：

(1)fc片段的純化

a酶切：

取ivig1ml，加入edta-na2，l-半胱氨酸鹽酸鹽和木瓜蛋白酶，酶切，37℃，4h。

b層析純化：

a、蛋白g層析

將酶切產(chǎn)物過濾后上樣于蛋白g(proteing)層析柱層析，收集酶切產(chǎn)物中含有fc片段的組分。

蛋白g層析步驟：

①沖液配制：

結(jié)合緩沖液：20mm磷酸納，ph7.0。洗脫緩沖液：100mm甘氨酸，ph2.7中和緩沖液：1mtris-hcl，ph9.0。

②樣品上樣前處理

樣品加入2倍體積結(jié)合緩沖液，充分混勻，放置過夜。上樣前一次性0.22um濾器過濾。

③柱平衡

先用5倍柱體積的蒸餾水洗柱，再用5倍體積結(jié)合緩沖液洗柱，流速均為1ml/min，至電導(dǎo)、紫外吸收紫外檢測器在280nm波長檢測等基線穩(wěn)定。

④上樣

樣品泵s2管路進樣，1ml/min。進樣體積約20ml。

⑤洗滌

用5-10倍柱體積的結(jié)合緩沖液平衡分離柱，直到基線，即所有未結(jié)合物質(zhì)都被沖洗出柱子(紫外檢測器在280nm波長檢測)。

⑥洗脫與樣品收集

用10倍柱體積的洗脫緩沖液進行洗脫。收集洗脫峰，收集后立即用中和緩沖液(0.06ml～0.2ml1mtris-hcl)中和至中性。

b、分子篩層析

將蛋白g層析柱層析后收集的所有含fc片段的組分(包括雙鏈fc、未酶切的ivig，以及部分含鉸鏈區(qū)的單鏈fc)，上樣于分離范圍包含5000da-300000da的分子篩，將樣品中的各組分按照分子量分離開來，收集分子量為50000da的蛋白，即為完整的雙鏈fc片段。

分子篩層析步驟：

①柱平衡

用2倍柱體積超純水沖洗hiprep26/60sephacryls-200highresolution預(yù)裝柱后，用2倍柱體積0.9％生理鹽水平衡。

②樣品處理與上樣

濃縮樣品，至濃度10mg/ml或以上。進樣體積5ml，流速1.3ml/min。

③層析

生理鹽水1.3ml/min洗滌，約3個小時直至所有組分的峰全部出完。

④峰收集

在約90-120min之間，出現(xiàn)第二個樣品峰，此峰的主要成分即我們所需要的fc片段的峰。

(2)唾液酸含量檢測

a待測樣品前處理：

待測樣品為ivig和純化的雙鏈fc片段；

將ivig上樣于能夠分子篩，去除其中含有的糖類組分；

將去除糖類保護劑的ivig和雙鏈fc片段經(jīng)稀釋或超濾濃縮，獲得濃度為0.5mg/ml的蛋白樣品。

b唾液酸解離：

利用酸性條件(tfa，鹽酸，醋酸)將ivig或雙鏈fc片段上的唾液酸解離下來。

取300μl蛋白樣品(1mg/ml)加入100μl0.1m三氟乙酸(7.45ml三氟乙酸加水至100ml)，金屬浴80℃，1h，產(chǎn)物經(jīng)0.22μm濾膜過濾。

c熒光衍生

取上一步反應(yīng)產(chǎn)物，加入dmb衍生液，50℃金屬浴避光反應(yīng)2.5h，20μl進樣檢測。

d高效液相色譜檢測：

色譜柱：waterssymmetryc18液相色譜柱4.6×2505μm；柱溫30℃；熒光檢測器激發(fā)波長373nm，發(fā)射波長448nm；流動相為甲醇：乙腈：超純水＝(7:8:85)；流速為0.9ml/min；

e標準曲線的繪制：

1mg唾液酸標準品加10ml水配制成0.1mg/ml的唾液酸標準溶液。加水分別稀釋至5、10、20、30、40ug/ml。取300μl各濃度標準品溶液，分別加入50μldmb衍生液，50℃金屬浴避光反應(yīng)2.5h，20μl進樣檢測。

以標準曲線樣品梯度濃度為橫坐標，標準曲線樣品經(jīng)高效液相色譜檢測的衍生峰面積為縱坐標，采用線性方程繪制標準曲線。

f唾液酸含量的計算：

將待測樣品的經(jīng)高效液相色譜檢測的衍生峰面積代入標準曲線，計算樣品中唾液酸含量。

其中ivig中的唾液酸總含量和fc片段的唾液酸含量經(jīng)以上計算直接得出；fab段唾液酸含量為ivig中的唾液酸總含量減去fc片段的唾液酸含量得到。

試驗一：比較是否去除糖類保護劑對樣品測定結(jié)果的影響

設(shè)試驗組和對照組，其它步驟相同，試驗組有去除糖類保護劑步驟，制品溶液為a1和b1；對照組沒有去除糖類保護劑步驟,制品溶液為a2和b2；具體步驟如下：

(1)待測樣品制備：

以市售的a、b兩個公司的ivig制品為檢測樣品，分別經(jīng)層析去除保護劑的處理和不經(jīng)去除糖類保護劑的處理后，用本發(fā)明所述方法繪制標注曲線并檢測其ivig唾液酸總含量。

試驗組中去除糖類保護劑的ivig樣品制備

設(shè)置流速1ml/min，用2倍柱體積超純水沖洗hiprep26/60sephacryls-200highresolution預(yù)裝柱后，用2倍柱體積生理鹽水平衡；取市售的a公司的ivig制品2ml上樣于層析柱層析，收集分子量為150,000da(的蛋白液；經(jīng)測定蛋白濃度后，利用生理鹽水對其稀釋，獲得蛋白濃度為0.5～4mg/ml的溶液a1；

重復(fù)以上步驟，對b公司靜注人免疫球蛋白進行處理，獲得蛋白濃度為0.5～4mg/ml的溶液b1,待測。

對照組中不去除糖類保護劑的ivig樣品制備

利用生理鹽水將a、b公司ivig制品稀釋至0.5～4mg/ml，分別獲得蛋白溶液a2、b2,待測。

(2)唾液酸含量檢測

a唾液酸解離：

取300μl蛋白樣品加入100μl0.1m三氟乙酸，金屬浴80℃，1h。

b熒光衍生：

取上一步反應(yīng)產(chǎn)物，加入dmb衍生液，50℃金屬浴避光反應(yīng)2.5h。

c高效液相色譜檢測：

選擇色譜柱：waterssymmetryc18液相色譜柱；柱溫30℃；熒光檢測器激發(fā)波長373nm，發(fā)射波長448nm；流動相為甲醇：乙腈：超純水＝(7:8:85)；設(shè)置流速為0.9ml/min，上樣體積10μl，將待測樣品進樣于色譜柱進行檢測，并計算進樣10～14min出現(xiàn)的最大衍生峰的面積。

d標準曲線的繪制：

以n-乙酰神經(jīng)氨酸作為標準品，用生理鹽水將其溶解并稀釋至濃度梯度：0、6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml。以不同濃度標準品為樣品，重復(fù)步驟“b”、“c”，獲得各濃度標準品在進樣10～14min時出現(xiàn)的最大衍生峰的面積。不同標準品高效液相色譜圖如圖3-9所示，目標峰明顯，易于判斷。

目標衍生峰全部在12.3分鐘出現(xiàn)，對不同濃度標準品檢測實驗中標準品濃度、色譜峰的出峰時間、峰面積相關(guān)對應(yīng)數(shù)據(jù)整理見表1：

表1：標準品(標準曲線)色譜數(shù)據(jù)

(注：編號a到g,分別一一對應(yīng)于圖3到圖9，試驗一中以下相同)。

以標準曲線樣品濃度為縱坐標，標準曲線樣品經(jīng)高效液相色譜檢測的衍生峰面積為橫坐標，采用線性方程繪制標準曲線，并獲得曲線方程，如圖1所示，能夠擬合得到較好的直線方程，相關(guān)系數(shù)的平方(r²)大于0.99。

e唾液酸含量的計算：

將待測樣品的經(jīng)高效液相色譜檢測的衍生峰面積代入標準曲線，計算樣品中每毫升溶液唾液酸含量，將計算的結(jié)果除以樣品溶液的蛋白濃度，即得到每mg蛋白上唾液酸的含量。

f重復(fù)實驗

重復(fù)以上方法，對制待測樣品進行重復(fù)試驗，結(jié)果求均值如下表2：

表2

從結(jié)果能夠看出，試驗組a1、b1小于對照組a2、b2，其原因為：本發(fā)明中檢測的樣本ivig，其成分中含有大量麥芽糖、蔗糖等糖類物質(zhì)，而且唾液酸也是一種糖類衍生物。色譜法進行唾液酸含量檢測方法時基于發(fā)色物質(zhì)或熒光物質(zhì)與糖類的反應(yīng)，因為對照組a2、b2并未去除保護劑中含有的糖類，能與dmb發(fā)生衍生，導(dǎo)致測定結(jié)果偏大，不準確。試驗組樣品a1、b1是將ivig制品a、b經(jīng)過分子篩層析后獲得的不含糖類保護劑的蛋白樣品，去除了影響檢測的因素，使結(jié)果更準確。因此，本發(fā)明中在檢測ivig制品的唾液酸含量前對ivig進行分子篩層析處理是需要和取得了好的效果。

試驗二

以市售的c、d、e、f四個公司的ivig制品為檢測樣品，用本發(fā)明所述方法進行檢測。

(1)fc片段的純化

a酶切：

取市售的c公司的ivig制品1ml，分別加入100μgedta-na2，500μgl-半胱氨酸鹽酸鹽和2mg木瓜蛋白酶，酶切，37℃，4h。

b層析純化：

(1)蛋白g層析

①緩沖液配制：

結(jié)合緩沖液：20mm磷酸納，ph7.0。洗脫緩沖液：100mm甘氨酸，ph2.7，中和緩沖液：1mtris-hcl，ph9.0

②層析

設(shè)置流速1ml/min，先用5倍柱體積的蒸餾水洗滌蛋白g層析柱，再用5倍體積結(jié)合緩沖液洗柱；取步驟“a”中獲得的酶切產(chǎn)物加入2倍體積結(jié)合緩沖液，充分混勻后上樣于層析柱，再經(jīng)5倍柱體積的結(jié)合緩沖液平衡層析柱后，用10倍柱體積的洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫液，并用中和緩沖液調(diào)節(jié)其ph至中性。

(2)分子篩層析

設(shè)置流速1ml/min，用2倍柱體積超純水沖洗hiprep26/60sephacryls-200highresolution預(yù)裝柱后，用2倍柱體積生理鹽水平衡；取步驟“a”中獲得的酶切產(chǎn)物上樣于層析柱層析，收集分子量為50000～60000da的蛋白液。

(3)層析得到的溶液經(jīng)測定蛋白濃度后，利用蛋白超濾離心管濃縮，獲得蛋白濃度為0.5～4mg/ml的溶液；

c重復(fù)以上步驟，純化b、c、d三個公司fc片段，待測。

(2)ivig的層析處理

設(shè)置流速1ml/min，用2倍柱體積超純水沖洗hiprep26/60sephacryls-200highresolution預(yù)裝柱后，用2倍柱體積生理鹽水平衡；取市售的a公司的ivig制品2ml上樣于層析柱層析，收集分子量為150000da的蛋白液；經(jīng)測定蛋白濃度后，利用生理鹽水對其稀釋，獲得蛋白濃度為0.5～4mg/ml的溶液；

重復(fù)以上步驟，對d、e、f三個公司靜注人免疫球蛋白進行處理，待測。

(3)唾液酸含量檢測

a唾液酸解離：

取300μl蛋白樣品加入100μl0.1m三氟乙酸，金屬浴80℃，1h。

b熒光衍生：

取上一步反應(yīng)產(chǎn)物，加入dmb衍生液，50℃金屬浴避光反應(yīng)2.5h。

c高效液相色譜檢測：

選擇色譜柱：waterssymmetryc18液相色譜柱；柱溫30℃；熒光檢測器激發(fā)波長373nm，發(fā)射波長448nm；流動相為甲醇：乙腈：超純水＝(7:8:85)；設(shè)置流速為0.9ml/min，上樣體積10μl，將待測樣品進樣于色譜柱進行檢測，并計算進樣10～14min出現(xiàn)的最大衍生峰的面積。

d標準曲線的繪制：

以n-乙酰神經(jīng)氨酸作為標準品，用生理鹽水將其溶解并稀釋至濃度梯度：3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml。以不同濃度標準品為樣品，重復(fù)步驟“b”、“c”，獲得各濃度標準品在進樣10～14min時出現(xiàn)的最大衍生峰的面積。

以標準曲線樣品濃度為縱坐標，標準曲線樣品經(jīng)高效液相色譜檢測的衍生峰面積為橫坐標，采用線性方程繪制標準曲線，并獲得曲線方程，如圖2所示：

e唾液酸含量的計算：

將待測樣品的經(jīng)高效液相色譜檢測的衍生峰面積代入標準曲線，計算樣品中每毫升溶液唾液酸含量，將計算的結(jié)果除以樣品溶液的蛋白濃度，即得到每mg蛋白上唾液酸的含量。

其中ivig中的唾液酸總含量和fc片段的唾液酸含量經(jīng)以上計算直接得出；fab段唾液酸含量為：

(ivig中的唾液酸總含量×ivig分子量-fc片段的唾液酸含量×fc片段分子量)/fab片段分子量

其中，ivig分子量為150,000da，fc片段分子量為55,000da，fab片段分子量為95,000da。

f重復(fù)實驗

重復(fù)以上方法，共計對制待測樣品進行3次重復(fù)試驗，結(jié)果統(tǒng)計如下表3：

表3

從以上可以得出，本發(fā)明中的檢測方法準確，且重復(fù)性高。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。