本發(fā)明涉及miRNA生物傳感器的制備方法，具體地說，設計一種基于酶生物燃料電池的自供能miRNA生物傳感器的制備及其超靈敏檢測miRNA。

背景技術：

酶生物燃料電池（EBFC）是一種特殊的燃料電池，其能在溫和條件下，利用可再生燃料提供可持續(xù)能源，受到廣泛關注?；贓BFC的自供能生物傳感器，是一種以電池性能輸出作為分析檢測信號的一類傳感器，該傳感器信號與被檢測分析物濃度成比例關系。與傳統(tǒng)傳感器相比，自供能生物傳感器檢測過程中無需施加額外電源，其具體優(yōu)點主要表現在：（1）設備簡單。檢測過程不同于傳統(tǒng)的電化學檢測三電極體系，僅需兩根電極，即EBFC的陰陽兩極，便可實現檢測；（2）抗干擾能力強。測試體系未施加額外電源，能有效避免易發(fā)生氧化還原的電活性物質在電極表面反應，從而提高了傳感器的抗干擾能力；（3）能實現簡單、快速、實時檢測。檢測過程中無需電化學工作站等供電設備，僅需簡易電壓表便可實現檢測，故檢測設備易攜帶，能實現實時監(jiān)測。

MicroRNA（miRNA），約22個核苷酸大小的內源性非編碼RNA，在多種生物過程如細胞分化，凋亡，增殖和免疫反應中具有重要作用，已成為用于檢測多種癌癥的診斷和預后評估的新生物標志物。目前，檢測miRNA表達的方法主要有Northern印跡法、miRNA陣列和實時逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、電化學方法。Northern印跡法方法靈敏度低、費時費力、樣品需求量大。微陣列檢測法同樣存在靈敏度較低的缺點，并且特異性較弱。RT-PCR具有高特異性與高靈敏度，但該方法操作繁瑣、RNA需分離純化。此外，miRNAs小尺寸的特點也限制了傳統(tǒng)RT-PCR的直接應用。并且miRNA家庭成員之間高的序列同源性也使定量分析成為挑戰(zhàn)。因此，設計制備基于生物燃料電池的自供能生物傳感器，實現miRNA簡單、方便、高靈敏、高特異性檢測非常必要。

本發(fā)明針對這一問題，構建了基于EBFC的miRNA生物傳感器，核心技術便為EBFC的構建，其中以[Fe(CN)₆]^3-作為EBFC的電子受體，構建生物陰極；以碳納米管/納米金/葡萄糖氧化酶（CNTs/AuNPs/GOx）作為生物陽極催化葡萄糖氧化。首先將電子受體[Fe(CN)₆]^3-封裝在MSN孔中，以目標miRNA的互補鏈（ssDNA）封孔。當無目標miRNA時，由于互補鏈將[Fe(CN)₆]^3-封裝于MSN孔中，此時陰極電子受體[Fe(CN)₆]^3-含量相對較少，電池輸出電壓低；當目標miRNA存在時，由于DNA互補配對作用，目標miRNA與互補鏈形成剛性雙螺旋結構，遠離MSN表面，孔內的[Fe(CN)₆]^3-釋放到體系中得到電子發(fā)生還原反應。目標miRNA的引入，達到釋放[Fe(CN)₆]^3-的目的，陰極電子受體[Fe(CN)₆]^3-量增加，電壓輸出信號增大，用于定量檢測目標miRNA。本發(fā)明設計的基于EBFC的自供能miRNA生物傳感器，可實現目標物簡單、快速、靈敏、高效檢測。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于EBFC的自供能生物傳感器的制備方法，實現miRNA的簡單、快速、靈敏、高效檢測，有助于癌癥早期診斷。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種互補鏈封孔的[Fe(CN)₆]^3-@MSN（[Fe(CN)₆]^3-@MSN@ssDNA）的制備方法如圖1，它由下列步驟組成：

步驟1. MSN的制備：濃度為1.5~3.0 mg mL^-1水溶液中，加入500~1000 μL 2.0 M NaOH 溶液，在80 ℃下劇烈攪拌10~20 min。隨后，將0.5~2 mL的TEOS加入到上述溶液中緩慢攪拌1~3 h直到有白色沉淀產生。將得到的產物過濾，二次水和甲醇多次洗滌，并在空氣中晾干。接著取一定量沉淀物在鹽酸和甲醇的混合物中回流10 h，以去除表面活性劑模板，制得MSN；

步驟2. 取一定量步驟1中制得的MSN，加入1~2倍于MSN質量的1% PDDA溶液，超聲使其溶解，隨后，將上述混合物在10000~15000 rpm下離心10~20 min并清洗多次，干燥后得到PDDA修飾的MSN；

步驟3. 取一定量步驟2中制得的PDDA修飾MSN與一定量濃度的[Fe(CN)₆]^3-混合，室溫下緩慢攪拌一夜。隨后，10 pM~100 nM ssDNA加入到上述溶液中，并在室溫下緩慢攪拌孵育2~6 h。將最終得到的混合物在2000~5000 rpm下離心1~5 min，洗滌，去除未封裝在孔內的[Fe(CN)₆]^3-，制得的[Fe(CN)₆]^3-@MSN@ssDNA。

一種CNT/AuNPs/GOx生物陽極的制備方法，由下列實驗步驟組成：

步驟1. 取一定量CNT分散在1~2倍于CNT質量的1% PDDA的鹽溶液中，超聲0.5~2 h得到帶正電的均勻懸濁液，離心去除剩余的PDDA（10000~15000 rpm，10~20 min），得到CNT/PDDA；

步驟2. 取一定量步驟1中制得的CNT/PDDA與1.0~5.0 mL濃度為10~100 nM的AuNPs相混合，在室溫下緩慢攪拌一夜。離心（8000~10000 rpm，10~20 min）去除過量的AuNPs并將最終得到的產物重新分散；

步驟3. 將20~50 μL步驟2中制得的CNT/AuNPs滴在ITO電極表面，在37 ℃下干燥2~4 h，1~10 mg mL^-1 EDC和NHS的溶液中浸泡0.5~1 h，隨后用二次水沖掉電極表面多余的EDC和NHS；

步驟4. 將步驟3中制得的電極浸泡在500~1000 μL 10~50 mg mL^-1的GOx溶液中12~24 h，二次水反復洗滌，置于4 ℃下備用。

一種基于EBFC的自供能miRNA生物傳感器的搭建及測量，由下列步驟組成：

步驟1. 在不引入目標miRNA時，一定量[Fe(CN)₆]^3-@MSN@ssDNA加入到支持電解液中，測量EBFC的E^OCV，記為E₀^OCV；

步驟2. 引入目標micRNA，不同濃度的目標miRNA在37 ℃下與一定量的MSN@ssDNA孵育1~6 h，隨后將上述混合物加入到支持電解液，再次測量EBFC的E^OCV；

上述搭建的無膜葡萄糖/氧氣EBFC的支持電解液為含5 mM 葡萄糖pH 7.4的100 mM Tris?HCl緩沖體系，測量裝置如圖2。

基于EBFC的自供能生物傳感器超靈敏檢測miRNA的原理如圖3所示：

當無目標miRNA時，[Fe(CN)₆]^3-被互補鏈封在MSN的孔內，體系內僅含極少量[Fe(CN)₆] ^3-，生物陰極幾乎無電子受體接受電子，此時，EBFC的開路電壓較小；當引入目標miRNA時，目標miRNA與其互補鏈之間由于DNA的雜交配對作用形成的剛性雙螺旋結構，使得互補鏈脫離MSN表面，使孔內的[Fe(CN)₆]^3-釋放到體系中，隨著引入miRNA濃度的增加，脫離MSN表面互補鏈的量增加，釋放出來的電子受體[Fe(CN)₆]^3-的量增加，從而導致EBFC的開路電壓增加，通過開路電壓增加值與目標miRNA對應關系得出miRNA含量。

本發(fā)明與現有技術相比，具有以下特點：

本發(fā)明提供了一種基于EBFC的自供能miRNA傳感器，實現miRNA簡單、方便、快速、靈敏、高效檢測，相對現有的miRNA檢測方法，具有以下特點：

（1）本發(fā)明所述基于EBFC的自供能生物傳感器，檢測過程中無需外加電源，僅需兩根電極，即生物燃料電池的陰陽兩極，整個檢測設備簡單，便是實現現場實時監(jiān)測；

（2）本發(fā)明所述的[Fe(CN)₆]^3-@MSN@ssDNA電子受體儲存器，對[Fe(CN)₆]^3-儲存量大，并且ssDNA封裝效果良好，穩(wěn)定性高，重復性好；

（3）本發(fā)明所述的基于EBFC的自供能生物傳感器采用DNA雜交配對進行分子識別，不僅具有極高選擇性，還具有成本低、操作簡單等優(yōu)點；

（4）本發(fā)明所述的基于EBFC的自供能生物傳感器中，具有高電化學活性的電子受體[Fe(CN)₆]^3-在EBFC陰極得電子，同時生物陽極CNTs/AuNPs/GOx對生物燃料葡萄糖具有良好的電催化活性，實現對目標物miRNA的超靈敏檢測，大大提高了檢測靈敏度；

（5）通過構建無額外供電設備的自供能生物傳感器，不需要昂貴的儀器設備，可實現miRNA檢測的微型化、便攜化和集成化。

附圖說明

圖1. [Fe(CN)₆]^3-@MSN@ssDNA組裝過程示意圖；

圖2. 自供能miRNA生物傳感器裝置示意圖；

圖3. 基于EBFC的自供能生物傳感器超靈敏檢測miRNA的原理示意圖。

具體實施方式

實施例1：自供能生物傳感器用于miRNA-21的檢測

（1）介孔硅（MSN）的制備：2.0 mg mL^-1的CTAB水溶液中加入875 μL 2.0 M 的NaOH溶液，80 ℃下劇烈攪拌20 min。隨后，將1.25 mL的TEOS加入到上述溶液中緩慢攪拌2 h。得到的產物過濾、洗滌、干燥。取160 mg沉淀物在1.5 mL鹽酸（37%）和75 mL甲醇的混合物中回流10 h去除表面活性劑模板，制得的MSN過濾，洗滌并在60 ℃下干燥4 h；

（2）PDDA修飾MSN的制備：取16 mg步驟1中制得的MSN，加入8.0 mL濃度為1%的PDDA超聲溶解，15000 rpm下離心10 min并清洗3遍，干燥后，得到PDDA修飾的MSN；

（3）Fe(CN)₆^3-@MSN@ssDNA納米儲存器的制備：取10 mg步驟2中制得PDDA修飾的MSN分散于1.0 mL 1.0 M的Fe(CN)₆^3-溶液中，室溫下緩慢攪拌一夜。隨后，10 μL 10 nM 的ssDNA加入到上述溶液中，并在室溫下緩慢攪拌孵育4 h。將最終得到的混合物在3000 rpm下離心2 min，洗滌，去除未被封裝在孔內的[Fe(CN)₆]^3-，得到的[Fe(CN)₆]^3-@MSN@ssDNA納米儲存器；

（4）CNT/AuNPs/GOx生物陽極的制備：8.0 mg的CNT分散在1% PDDA的鹽溶液中，超聲30 min得到帶正電的均勻懸濁液， 15000 rpm下離心10 min去除剩余的PDDA聚合物，洗滌，得到CNT/PDDA。取一定量上述沉淀物與3.0 mL的AuNPs（10 nM）相混合，室溫下緩慢攪拌過夜，8000 rpm下離心10 min去除多余的AuNPs，最終得到的產物重新分散得濃度為1 mg mL^-1CNT/AuNPs。將50 μL CNT/AuNPs滴涂在ITO電極表面，在37 ℃下干燥2 h后將電極浸泡在1 mg mL^-1 EDC和NHS的溶液中30 min，二次水沖掉電極表面多余的EDC和NHS。將活化電極浸泡在500 μL 10 mg mL^-1的GOx溶液中4 °C 孵育12 h，二次水反復洗滌后浸泡在pH 7.4的PBS中，并置于4 ℃下備用；

（5）基于EBFC的miRNA自供能傳感器的搭建及測量：當無目標miRNA時，50 μL [Fe(CN)₆]^3-@MSN@ssDNA加入到支持電解液中，測量EBFC的E^OCV，記為E₀^OCV；引入目標miRNA后，5 μL不同濃度的目標miRNA與50 μL的[Fe(CN)₆]^3-@MSN@ssDNA 37 ℃下孵育2 h，隨后將上述混合物加入到支持電解液，再次測量EBFC的E^OCV。

上述搭建的無膜葡萄糖/氧氣酶生物燃料電池的支持電解液為含5 mM 葡萄糖的100 mM Tris?HCl緩沖體系，pH= 7.4。

DNA序列miRNA-21：5’-UAG CU U AUC AGA CUG AUG UUG A-3’

ssDNA：5’-TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A- 3’。

實施案例2：自供能生物傳感器用于let-7b的檢測

DNA序列l(wèi)et-7b：5’-UGA GGU AGU AGG UUG UGU GGU U-3’

ssDNA：5’-AAC CAC ACA ACC UAC UAC CUC A-3’

其余步驟同實施方案1。