本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)和生物組織標(biāo)本制備領(lǐng)域，更具體的涉及一種用于生物組織樣本的脫水組合物、脫水方法和制備方法。
背景技術(shù)：
：全面準(zhǔn)確地了解器官的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其神經(jīng)血管走向情況是神經(jīng)科學(xué)乃至整個(gè)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域不可或缺的基礎(chǔ)，但組織不透明阻礙了對(duì)于大多數(shù)完整生物組織標(biāo)本的全局式觀察。在這種需求下應(yīng)運(yùn)而生了完整生物組織透明技術(shù)，使得器官不必切片，即可在完整狀態(tài)下進(jìn)行觀察研究。近年來(lái)，組織透明方法層出不窮，大體可以分為兩類，一類是利用水溶性試劑透明，通過(guò)這類方法制備完整生物組織透明樣本時(shí)間較長(zhǎng)，處理時(shí)間通常在一周以上，并且透明效果較差，只有個(gè)別方法制得的樣品可以利用雙光子顯微鏡觀察，更不能達(dá)到光片照明顯微鏡成像需求；另一類是利用有機(jī)溶劑透明，通過(guò)這類方法制備完整生物組織透明樣本的處理時(shí)間要短于水溶性試劑透明的時(shí)間，根據(jù)樣本大小的不同需要3-5天時(shí)間，獲得的透明樣本透明效果很好，達(dá)到對(duì)樣品透明度要求最高的光片照明顯微鏡觀察的要求，但是通過(guò)這類方法制作樣品至少也需要數(shù)天的時(shí)間，且其組織內(nèi)部熒光蛋白熒光信號(hào)易淬滅，不利于觀察。綜上所述，目前完整生物組織樣本透明的制備方法中缺乏快速的透明手段，同時(shí)也缺乏具備高透明度、保護(hù)熒光蛋白熒光信號(hào)的技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的主要目的是提供用于生物組織樣本的脫水組合物、脫水方法和制備方法，以便解決上述技術(shù)問(wèn)題中的至少之一。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，作為本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于生物組織樣本的脫水組合物，包括：能夠使所述生物組織樣本脫水的有機(jī)試劑；以及水；其特征在于，所述脫水組合物用于生物組織樣本最后一步的脫水，且水占所述脫水組合物的體積濃度在0.5-3％范圍之間。作為本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種用于生物組織樣本脫水的脫水試劑組合，包括：N種脫水試劑，所述脫水試劑均包含能夠使所述生物組織樣本脫水的有機(jī)試劑和水，其中，N為大于等于2的整數(shù)；其特征在于，所述N種脫水試劑中用于生物組織樣本最后一步脫水的脫水試劑采用如上所述的脫水組合物。作為本發(fā)明的再一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種生物組織樣本的脫水方法，其特征在于，包括以下步驟：采用如上所述的脫水試劑組合依次進(jìn)行脫水，其中每一次脫水中，根據(jù)待處理的生物組織樣本的體積和最小維度厚度，脫水時(shí)間在0.5-3小時(shí)之間選擇；以及所述脫水試劑組合中，有機(jī)試劑的體積濃度根據(jù)所述脫水試劑的使用先后順序而逐漸增大。作為本發(fā)明的還一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種生物組織透明樣本的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：采用如上所述的脫水方法對(duì)待處理的生物組織樣本進(jìn)行脫水；以及使用透明劑浸泡所述待處理的生物組織樣本來(lái)完成整個(gè)生物組織透明樣本的制備?；谏鲜黾夹g(shù)方案可知，采用本發(fā)明的脫水組合物及脫水、透明方法可以在24小時(shí)內(nèi)獲得完整生物組織透明樣本，具備快速制備完整生物組織樣本的能力；本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，透明效果好，更重要的是熒光蛋白熒光信號(hào)穩(wěn)定，可用于光片照明成像設(shè)備進(jìn)行完整器官快速整體成像。附圖說(shuō)明圖1是C57小鼠腦標(biāo)本經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例1處理后的透明效果圖；圖2是SD大鼠腦標(biāo)本經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例2處理后的透明效果圖；圖3是熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠腦標(biāo)本經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例1處理后的光片照明成像效果圖。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明?，F(xiàn)有的完整生物組織透明標(biāo)本的制備方法多種多樣，但是無(wú)論水溶性透明方法還是有機(jī)溶劑透明方法，對(duì)于完整動(dòng)物組織來(lái)看透明標(biāo)本的處理時(shí)間最短也需3天時(shí)間；而本發(fā)明公開(kāi)了一種脫水、透明方法，可以在24小時(shí)內(nèi)獲得完整生物組織透明樣本，具備快速制備完整生物組織樣本的能力。具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種用于生物組織樣本的脫水組合物，包括：能夠使生物組織樣本脫水的有機(jī)試劑；以及水；其中，該脫水組合物用于生物組織樣本最后一步的脫水，且水占脫水組合物的體積濃度在0.5-3％范圍之間。作為優(yōu)選，該有機(jī)試劑選自乙醇、四氫呋喃、叔丁醇、丙醇、三甘醇、丁辛醇和環(huán)己醇中的一種或多種。本發(fā)明還公開(kāi)了一種用于生物組織樣本脫水的脫水試劑組合，包括：N種脫水試劑，該脫水試劑均包含能夠使生物組織樣本脫水的有機(jī)試劑和水，其中，N為大于等于2的整數(shù)；其中，該N種脫水試劑中用于生物組織樣本最后一步脫水的脫水試劑采用如上所述的脫水組合物。本發(fā)明還公開(kāi)了一種生物組織樣本的脫水方法，包括以下步驟：采用如上所述的脫水試劑組合依次進(jìn)行脫水，其中每一次脫水中，根據(jù)待處理的生物組織樣本的體積和最小維度厚度，脫水時(shí)間在0.5-3小時(shí)之間選擇；以及該脫水試劑組合中，有機(jī)試劑的體積濃度根據(jù)脫水試劑的使用先后順序而逐漸增大。作為優(yōu)選，對(duì)于待處理的生物組織樣本的最小維度厚度在1-3mm的，脫水時(shí)間為0.25-1h；最小維度厚度在3-5mm的，脫水時(shí)間為1-2h；最小維度厚度在5-10mm的，脫水時(shí)間為2-3h。作為優(yōu)選，N為3、4、5或6，即脫水次數(shù)為3、4、5或6。其中，該生物組織樣本可以是部分的，也可以是完整的生物組織樣本，優(yōu)選為完整的樣本。本發(fā)明還公開(kāi)了一種生物組織透明樣本的制備方法，包括以下步驟：采用如上所述的脫水方法對(duì)待處理的生物組織樣本進(jìn)行脫水；以及使用透明劑浸泡待處理的生物組織樣本來(lái)完成整個(gè)生物組織透明樣本的制備。其中，透明劑例如選自苯甲酸與苯甲酸芐酯的混合液、芐醚、二苯醚、二甲苯或氯仿；透明劑的浸泡時(shí)間可以為0.5-1h，優(yōu)選為0.5h。本發(fā)明的脫水時(shí)間與現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)成鮮明的反差，下表中將這種對(duì)比清楚的展示了出來(lái)。最小維度(mm)已有方法每次脫水時(shí)間(h)本申請(qǐng)方法每次脫水時(shí)間(h)1-310.25-13-5121-25-10242-3下面結(jié)合具體實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步闡述說(shuō)明。成年Thy-1小鼠一只，體重約20g，用1ml注射器抽取1％戊巴比妥鈉溶液0.2ml，腹腔注射麻醉。待動(dòng)物痛覺(jué)消失后，開(kāi)胸充分暴露心臟，快速用裝有1×PBS溶液(pH7.4)的注射器自左心室進(jìn)行心臟穿刺，5分鐘內(nèi)均勻推注1×PBS溶液20ml，動(dòng)物眼球、前肢及肝臟血色消失，繼續(xù)灌注4％多聚甲醛溶液20ml(pH7.4，1×PBS配制)。剛開(kāi)始灌注多聚甲醛時(shí)，可見(jiàn)到動(dòng)物抽動(dòng)、甩尾，之后動(dòng)物肢體和尾巴繃直，提示灌注成功。剪開(kāi)顱骨，小心分離剪斷與腦相連的顱神經(jīng)，取出完整動(dòng)物腦標(biāo)本，浸入4％多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱內(nèi)繼續(xù)后固定2小時(shí)以上，最好過(guò)夜。實(shí)施例1用蒸餾水配制50％四氫呋喃、60％四氫呋喃、80％四氫呋喃、90％四氫呋喃、98％四氫呋喃各50ml，分別盛放于密封的玻璃瓶?jī)?nèi)，用鋁箔紙將玻璃瓶包裹嚴(yán)實(shí)，以避光。將腦標(biāo)本依次浸泡于由低濃度到高濃度的四氫呋喃脫水劑中各1小時(shí)，然后再用芐醚作為透明劑對(duì)腦標(biāo)本進(jìn)行透明處理，將腦標(biāo)本從98％四氫呋喃溶液中取出后浸入裝有50ml芐醚溶液的密封玻璃瓶?jī)?nèi)，同樣此玻璃瓶也用鋁箔紙進(jìn)行包裹避光，3小時(shí)后用顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1所示。對(duì)該樣品進(jìn)行光片照明成像處理，結(jié)果如圖3所不。實(shí)施例2用蒸餾水配制50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、99％乙醇各50ml，分別盛放于密封的玻璃瓶?jī)?nèi)，用鋁箔紙將玻璃瓶包裹嚴(yán)實(shí)，以避光。將腦標(biāo)本依次浸泡于由低濃度到高濃度的乙醇脫水劑中內(nèi)各2小時(shí)，然后再用苯甲醇與苯甲酸芐酯的混合液作為透明劑對(duì)腦標(biāo)本進(jìn)行透明處理。將腦標(biāo)本從99％乙醇溶液中取出后浸入裝有50ml芐醚溶液的密封玻璃瓶?jī)?nèi)，同樣此玻璃瓶也用鋁箔紙進(jìn)行包裹避光，2小時(shí)后用顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，通過(guò)本發(fā)明方法制備的完整生物組織透明樣本制備時(shí)間大大縮短，例如成年小鼠脊髓只需2.5個(gè)小時(shí)，大鼠整腦只需18.5個(gè)小時(shí)，并且由此制得的透明標(biāo)本透明度高，熒光蛋白熒光信號(hào)穩(wěn)定，可以利用光片照明顯微鏡進(jìn)行快速連續(xù)的成像觀察。以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3