本發(fā)明屬于煙草
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及煙草中新植二烯的提取純化和檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(ReferenceMaterial,RM),是一種已經(jīng)充分地確定了其一種或幾種特性，用于校準(zhǔn)測(cè)量器具，評(píng)價(jià)測(cè)量方法或確定材料特性量值的物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已成為分析中傳遞準(zhǔn)確度的基準(zhǔn)物質(zhì)和實(shí)驗(yàn)室分析質(zhì)量控制的重要工具，是量值溯源的重要手段，保證了不同時(shí)間與空間測(cè)量結(jié)果的可比性、一致性。目前，煙草中絕大部分香氣物質(zhì)及其前體物的定量分析基本能全部實(shí)現(xiàn)，但仍有少部分香氣物質(zhì)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)價(jià)格昂貴使常規(guī)檢測(cè)分析難以承受(如新植二烯)，在進(jìn)行分析時(shí)只能采取半定量模式，制約了煙草中香氣物質(zhì)研究的深入開(kāi)展。新植二烯是一種聚類異戊二烯，具20個(gè)碳原子，結(jié)構(gòu)為3-亞甲基-7，11，15-三甲基-1-十六烯，在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下，沸點(diǎn)為344.5±9.0℃，為半揮發(fā)性有機(jī)化合物。它是由美國(guó)學(xué)者R.L.Rowland在1957年首次從烤煙中分離出來(lái)，并將其命名為新植二烯。后來(lái)日本學(xué)者I.Onishi和美國(guó)學(xué)者R.N.GLADDING從白肋煙和卷煙煙氣中分離得到新植二烯。新植二烯是煙草中的非色素類萜烯，占煙葉鮮重的0.06％～0.10％。它是烤煙葉綠素降解的產(chǎn)物之一，在成熟和烘烤中，煙葉葉綠素在葉綠素酶的作用下降解產(chǎn)生植醇，約15％～30％的植醇再脫水，便形成新植二烯。新植二烯自身具有清香氣且刺激性較強(qiáng)，而葉綠素和葉綠醇則具有青雜氣，在調(diào)制過(guò)程中隨著葉綠素和葉綠醇大量轉(zhuǎn)化成新植二烯，煙葉的青雜氣消除，進(jìn)而產(chǎn)生清香氣。新植二烯在煙草揮發(fā)物性香味物質(zhì)中含量最高，是煙葉中重要的致香物質(zhì)。新植二稀還可在醇化過(guò)程中發(fā)生降解反應(yīng)生成具有清醇香味的小分子化合物，如植物呋喃等，這些化合物對(duì)烤煙清香氣的產(chǎn)生具有積極的作用，從而進(jìn)一步增加了煙葉香氣和吃味。另外，新植二烯在煙草燃燒時(shí)可直接進(jìn)入煙氣，具有減少刺激性、醇和煙氣的作用，同時(shí)還可以作為捕集煙氣氣溶膠內(nèi)香氣成分的載體，具有攜帶煙葉中揮發(fā)性香氣成分物質(zhì)進(jìn)入煙氣的能力，因而是煙葉的重要增香劑。煙葉中新植二烯含量的高低是遺傳因素、生態(tài)環(huán)境和栽培措施共同作用的結(jié)果。葉片中新植二烯的含量在基因型和煙葉各部位間存在著較大的差異，不僅與地區(qū)、海拔、光照等生態(tài)環(huán)境因素密切相關(guān)，還受到施肥等一系列栽培措施的影響。新植二烯含量與煙草香型風(fēng)格也有密切的關(guān)系，研究表明清香型烤煙的新植二烯含量顯著高于濃香及中間香型的烤煙。它對(duì)提高對(duì)改善煙草香氣品質(zhì)、合理利用煙葉原料具有重要的意義，因此對(duì)煙葉中新植二烯的含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定很有必要。目前煙草及煙草制品中新植二烯檢測(cè)所用到的新植二烯的標(biāo)準(zhǔn)品是化工合成的，價(jià)格高昂，而且化工合成的新植二烯是一種單體及二聚體的混合物，而實(shí)際上煙草中的新植二烯是以單體形式存在的，因此使用化工合成的新植二烯作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在測(cè)量時(shí)并不準(zhǔn)確。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種煙草中新植二烯的提取純化方法，解決新植二烯標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，進(jìn)口標(biāo)物訂購(gòu)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，為萜類香味物質(zhì)的分離純化提供依據(jù)，有利于煙草中香氣物質(zhì)及前體物質(zhì)的定量分析，進(jìn)而促進(jìn)煙草中香味物質(zhì)的研究。為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：首先，本發(fā)明公開(kāi)了一種煙草中新植二烯的提取純化方法，所述提取純化方法包括如下步驟：(1)向煙草樣品中加入鹵化烴類有機(jī)溶劑進(jìn)行超聲處理，超聲處理期間間隔震蕩若干次，過(guò)濾得粗提液；(2)將步驟(1)得到的粗提液進(jìn)行旋蒸濃縮處理，加入鹵化烴類有機(jī)溶劑溶解將樣品轉(zhuǎn)移至硅膠上進(jìn)行拌樣處理，然后再轉(zhuǎn)移至硅膠柱中進(jìn)行上樣處理；(3)使用洗脫劑進(jìn)行洗脫處理，收集洗脫液；(4)將步驟(3)得到的洗脫液旋蒸濃縮近干，使用醇類有機(jī)溶劑溶解后過(guò)有機(jī)相濾膜并用制備色譜進(jìn)一步純化；(5)將步驟(4)制備色譜分離純化后的溶液旋蒸濃縮并用鹵化烴類有機(jī)溶劑反提除水得新植二烯樣品。優(yōu)選的，所述步驟(1)中，煙草樣品與鹵化烴類有機(jī)溶劑的質(zhì)量體積比為1g：8-10ml，進(jìn)一步優(yōu)選的，所述煙草樣品與鹵化烴類有機(jī)溶劑的質(zhì)量體積比為1g：10ml；所述鹵化烴類有機(jī)溶劑為分析純二氯甲烷；優(yōu)選的，所述步驟(1)中，超聲處理?xiàng)l件為：超聲頻率為18-20KHz，超聲處理時(shí)間共計(jì)0.5-1h，超聲處理期間每隔10min震蕩一次；優(yōu)選的，所述步驟(2)中，旋蒸處理溫度為30-35℃，鹵化烴類有機(jī)溶劑為分析純二氯甲烷；拌樣處理中的硅膠目數(shù)為100-200目；所述樣品凈含量與所述硅膠的質(zhì)量比為1:1；所述硅膠柱目數(shù)為100-200目；所述硅膠柱中硅膠目數(shù)為200-300目；優(yōu)選的，所述步驟(3)中，洗脫劑為石油醚；洗脫處理具體為：第一個(gè)柱體積洗脫液舍棄(洗脫液可用于下一次的洗脫，重新富集新植二烯)，收集后兩個(gè)柱體積洗脫液；優(yōu)選的，所述步驟(4)中，旋蒸處理溫度為30-35℃；醇類有機(jī)溶劑為色譜純甲醇；有機(jī)相濾膜規(guī)格為0.45μm有機(jī)相濾膜；優(yōu)選的，所述步驟(4)中，制備色譜進(jìn)一步純化所采用的條件為：流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1％甲酸；0min,A:B＝90：10；6min，A:B＝98：2；9min，A:B＝90：10；12min，A:B＝90：10；進(jìn)樣量為2mL，掃描波長(zhǎng)220-260nm，收集4.2min-5.4min之間的組分。優(yōu)選的，所述步驟(5)中，旋蒸處理溫度為30-35℃，鹵化烴類有機(jī)溶劑為色譜純二氯甲烷。本發(fā)明還公開(kāi)了一種由上述提取純化方法制備得到的新植二烯。此外，本發(fā)明公開(kāi)了一種上述新植二烯的檢測(cè)方法，所述方法采用氣相色譜分析檢測(cè)，檢測(cè)條件為：色譜柱DB-5彈性毛細(xì)管色譜柱，規(guī)格為30m×0.25mm×0.25μm；火焰離子化檢測(cè)器(FID)；進(jìn)樣口：250℃；初始溫度80℃，保持0min，以20℃/min速率升至300℃，保持15min，以2℃速率升至310℃，保持15min，總運(yùn)行時(shí)間為46min。最后，本發(fā)明公開(kāi)了上述新植二烯作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在煙草香氣物質(zhì)及其前體物的定量分析中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：(1)初烤煙葉中新植二烯含量豐富，本方法以初烤煙葉為原料直接進(jìn)行提取，取材方便、廉價(jià)易得。(2)與化學(xué)合成相比，本方法步驟少、操作簡(jiǎn)單、成本低，僅使用一步超聲萃取、硅膠柱初步分離純化后經(jīng)反相制備色譜即可得到純度極高的新植二烯樣品，經(jīng)分析檢測(cè)，本發(fā)明制備得到的新植二烯純度高達(dá)99.42％。(3)本方法制得的新植二烯純度遠(yuǎn)高于市面所售新植二烯純度，且不含新植二烯二聚體，因此作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行煙草香氣物質(zhì)及其前體物的定量分析時(shí)更為準(zhǔn)確。附圖說(shuō)明圖1為新植二烯標(biāo)準(zhǔn)品(200μg/mL)氣相色譜圖；圖2為新植二烯粗提物氣相色譜圖；圖3為新植二烯凝膠柱分離純化氣相色譜圖；圖4為新植二烯純化制備后氣相色譜圖。具體實(shí)施方式結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。實(shí)施例11、儀器與試劑：美國(guó)安捷倫6890N氣相色譜儀；美國(guó)WatersPrep150制備色譜；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)；氮吹儀；BS214S分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；玻璃柱(40×650mm)。分析純二氯甲烷(國(guó)藥)；分析純石油醚(60-90℃，國(guó)藥)；色譜純二氯甲烷(德國(guó)默克)；色譜純甲醇(德國(guó)默克)；蒸餾水，符合GB/T6682中一級(jí)水的要求。2、樣品提取及初步分離：(1)新植二烯提?。悍Q20g的煙末于300mL的錐形瓶中，加入200mL分析純二氯甲烷，封口膜封口，超聲頻率為18kHz，超聲30min，期間每隔10min震蕩一次，濾紙過(guò)濾于250mL平底燒瓶中得新植二烯粗提物。(2)硅膠柱裝柱：柱子清洗烘干備用，柱子底部用少量棉花塞住，松緊適度，后用鐵架臺(tái)固定并與水平面垂直，于1000mL燒杯中加入150g的300目的硅膠，用石油醚調(diào)成勻漿，注入柱子，并用洗耳球輕輕敲打柱身，沉降約2h，待用。(3)拌樣：將步驟1得到的粗提液在35℃水浴的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮近干，分三次依次加入2mL分析純的二氯甲烷，將樣品完全轉(zhuǎn)移到與其凈重1:1的100目硅膠上，并充分?jǐn)嚢钃]干，待用。(4)上樣：將步驟3拌好的樣品通過(guò)漏斗加入步驟(2)的柱子中沉降，并用石油醚將研缽和漏斗沖洗干凈，使樣品全部轉(zhuǎn)移到柱子中。(5)洗脫：將步驟4上樣后的柱子中加入適量的棉花保護(hù)樣品面，然后用石油醚進(jìn)行洗脫，其中第一個(gè)柱體積洗脫液舍棄(洗脫液可用于下一次的洗脫，重新富集新植二烯)，收集并合并后兩個(gè)柱體積洗脫液。3、制備色譜的進(jìn)一步純化：(1)將上述步驟(5)的洗脫液在35℃旋蒸濃縮近干，用色譜純甲醇進(jìn)行溶解，過(guò)0.45μm有機(jī)相濾膜，用制備色譜進(jìn)一步純化(制備色譜進(jìn)一步純化所采用的條件為：流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1％甲酸；0min,A:B＝90：10；6min，A:B＝98：2；9min，A:B＝90：10；12min，A:B＝90：10；)，進(jìn)樣量為2mL，掃描波長(zhǎng)220-260nm，收集4.2min-5.4min之間的組分。(2)將步驟(1)制備色譜所分離純化的樣品35℃水浴的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，經(jīng)色譜純二氯甲烷反提除水后得新植二烯樣品。實(shí)施例21、儀器與試劑：美國(guó)安捷倫6890N氣相色譜儀；美國(guó)WatersPrep150制備色譜；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)；氮吹儀；BS214S分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；玻璃柱(40×650mm)。分析純二氯甲烷(國(guó)藥)；分析純石油醚(60-90℃，國(guó)藥)；色譜純二氯甲烷(德國(guó)默克)；色譜純甲醇(德國(guó)默克)；蒸餾水，符合GB/T6682中一級(jí)水的要求。2、樣品提取及初步分離：(1)新植二烯提?。悍Q20g的煙末于300mL的錐形瓶中，加入160mL分析純二氯甲烷，封口膜封口，超聲頻率為20kHz，超聲60min，期間每隔10min震蕩一次，濾紙過(guò)濾于250mL平底燒瓶中得新植二烯粗提物。(2)硅膠柱裝柱：柱子清洗烘干備用，柱子底部用少量棉花塞住，松緊適度，后用鐵架臺(tái)固定并與水平面垂直，于1000mL燒杯中加入150g的300目的硅膠，用石油醚調(diào)成勻漿，注入柱子，并用洗耳球輕輕敲打柱身，沉降約2h，待用。(3)拌樣：將步驟1得到的粗提液在35℃水浴的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮近干，分三次依次加入2mL分析純的二氯甲烷，將樣品完全轉(zhuǎn)移到與其凈重1:1的200目硅膠上，并充分?jǐn)嚢钃]干，待用。(4)上樣：將步驟3拌好的樣品通過(guò)漏斗加入步驟(2)的柱子中沉降，并用石油醚將研缽和漏斗沖洗干凈，使樣品全部轉(zhuǎn)移到柱子中。(5)洗脫：將步驟4上樣后的柱子中加入適量的棉花保護(hù)樣品面，然后用石油醚進(jìn)行洗脫，其中第一個(gè)柱體積洗脫液舍棄(洗脫液可用于下一次的洗脫，重新富集新植二烯)，收集并合并后兩個(gè)柱體積洗脫液。3、制備色譜的進(jìn)一步純化：(1)將上述步驟(5)中的洗脫液在35℃旋蒸濃縮近干，用10ml色譜純甲醇進(jìn)行溶解，過(guò)0.45μm有機(jī)相濾膜，用制備色譜進(jìn)一步純化(制備色譜進(jìn)一步純化所采用的條件為：流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1％甲酸；0min,A:B＝90：10；6min，A:B＝98：2；9min，A:B＝90：10；12min，A:B＝90：10；)，進(jìn)樣量為2mL，掃描波長(zhǎng)220-260nm，收集4.2min-5.4min之間的組分。(2)將步驟1制備色譜所分離純化的樣品35℃旋蒸濃縮，經(jīng)色譜純二氯甲烷反提除水后得新植二烯樣品。實(shí)驗(yàn)例為進(jìn)一步驗(yàn)證本申請(qǐng)技術(shù)方案，購(gòu)買市面上銷售的新植二烯標(biāo)準(zhǔn)品(氣相色譜圖如圖1所示，各組分面積百分比如表1所示)作對(duì)比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。表1新植二烯標(biāo)準(zhǔn)品面積百分比保留時(shí)間/min峰面積/(Pa*s)峰面積/％8.0334.15E-010.318.1151.13E+0284.988.2421.95E+001.478.3341.08E+000.828.4421.65E+0112.42具體實(shí)施方式如下：1、儀器與試劑：美國(guó)安捷倫6890N氣相色譜儀；美國(guó)WatersPrep150制備色譜；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)；氮吹儀；BS214S分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；玻璃柱(40×650mm)。分析純二氯甲烷(國(guó)藥)；分析純石油醚(60-90℃，國(guó)藥)；色譜純二氯甲烷(德國(guó)默克)；色譜純甲醇(德國(guó)默克)；蒸餾水，符合GB/T6682中一級(jí)水的要求。2、新植二烯氣相色譜檢測(cè)條件：色譜柱DB-5彈性毛細(xì)管色譜柱，規(guī)格為30m×0.25mm×0.25μm；火焰離子化檢測(cè)器(FID)；進(jìn)樣口：250℃；初始溫度80℃，保持0min，以20℃/min速率升至300℃，保持15min，以2℃速率升至310℃，保持15min，總運(yùn)行時(shí)間為46min。3、樣品提取及初步分離：(1)新植二烯提?。悍Q20g的煙末于300mL的錐形瓶中，加入200mL分析純二氯甲烷，封口膜封口，超聲45min，期間每隔10min震蕩一次，濾紙過(guò)濾于250mL平底燒瓶中，取1mL于35℃水浴的氮吹濃縮近干，用1mL的色譜純二氯甲烷進(jìn)行溶解，過(guò)0.45μm有機(jī)相濾膜，用氣相色譜(FID檢測(cè)器)進(jìn)行純度的檢測(cè)，其余粗提液待純化。氣相色譜結(jié)果顯示，共檢測(cè)出67種物質(zhì)，其中新植二烯占16.8％。雖然新植二烯的相對(duì)含量最高，但其他雜質(zhì)高達(dá)66種，占總量的83.2％。分析結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。表2新植二烯粗提液面積百分比(2)硅膠柱裝柱：柱子清洗烘干備用，柱子底部用少量棉花塞住，松緊適度，后用鐵架臺(tái)固定并與水平面垂直，于1000mL燒杯中加入150g的300目的硅膠，用石油醚調(diào)成勻漿，注入柱子，并用洗耳球輕輕敲打柱身，沉降約2h，待用。(3)拌樣：將步驟1得到的粗提液在35℃水浴的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮近干，分三次依次加入2mL分析純的二氯甲烷，將樣品完全轉(zhuǎn)移到與其凈重1:1的100目硅膠上，并充分?jǐn)嚢钃]干，待用。(4)上樣：將步驟3拌好的樣品通過(guò)漏斗加入步驟(2)的柱子中沉降，并用石油醚將研缽和漏斗沖洗干凈，使樣品全部轉(zhuǎn)移到柱子中。(5)洗脫：將步驟4上樣后的柱子中加入適量的棉花保護(hù)樣品面，然后用石油醚進(jìn)行洗脫，第一個(gè)半柱體積舍棄，后3.5個(gè)柱體積分為7個(gè)半柱體積分別收集到250mL的平底燒瓶中，待進(jìn)一步純化。(6)將步驟5得到的洗脫液在35℃水浴的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮近干，分別用3mL的色譜純二氯甲烷溶解，并重復(fù)兩遍，使分離到的樣品完全轉(zhuǎn)移到10mL樣品瓶中，待用。(7)將步驟6得到的7個(gè)半柱體積目標(biāo)物的二氯甲烷溶液，以及200ug/mL新植二烯的標(biāo)準(zhǔn)品，分別取1mL過(guò)0.45μm有機(jī)相濾膜，用氣相色譜(FID檢測(cè)器)進(jìn)行濃度和純度的檢測(cè)，確定洗脫體積。氣相色譜檢測(cè)結(jié)果顯示：200ug/mL新植二烯標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)純度顯示為84.98％，8.442min的色譜峰經(jīng)譜庫(kù)檢索為新植二烯二聚體，峰面積占12.42％；第2個(gè)半柱體積新植二烯的峰面積為2.9E-1，純度為0.052％，其濃度和純度都很低，應(yīng)舍棄。第7和第8個(gè)半柱體積新植二烯雖然純度達(dá)到了57％，但濃度最高不足標(biāo)準(zhǔn)品的一半，考慮到成本，應(yīng)舍棄(其洗脫液用于下一次的洗脫，重新富集新植二烯)。第3-6個(gè)半柱體積其純度都在48％以上，最大的濃度達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)品的15倍，最小濃度也大于標(biāo)準(zhǔn)品，所以確定收集的柱體積為第3-6個(gè)半柱體積，即第2和第3個(gè)柱體積。分析結(jié)果見(jiàn)表5。以第四個(gè)半柱體積為例，粗提液經(jīng)硅膠柱純化后雜質(zhì)由前面的66種降低為34種，新植二烯的含量也由16.78％純化到56.17％。分析結(jié)果見(jiàn)圖3、表3。表3新植二烯凝膠柱分離純化面積百分比4、制備色譜的進(jìn)一步純化：(1)將第2和第3個(gè)柱體積的二氯甲烷溶液合并后35℃水浴的氮吹濃縮近干，用適量的色譜純甲醇進(jìn)行溶解，過(guò)0.45μm有機(jī)相濾膜，用制備色譜進(jìn)一步純化，收集4.2min-5.4min之間的組分。(2)將步驟1制備色譜所分離純化的樣品35℃水浴的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，經(jīng)色譜純二氯甲烷反提除水后，用氣相色譜(FID檢測(cè)器)檢測(cè)其純度。如圖4、表4所示，氣相色譜檢測(cè)結(jié)果顯示，新植二烯經(jīng)制備色譜進(jìn)一步純化后，雜質(zhì)由硅膠柱分離后的34種降低到1種，新植二烯的純度達(dá)到99.42％，相比標(biāo)準(zhǔn)品的84.98％提高了14.44％。表4新植二烯制備純化面積百分比保留時(shí)間/min峰面積/(Pa*s)峰面積/％8.112112.0699.428.6750.660.58上述雖然結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3