1.1.世界有關(guān)“天然免疫耐受”的研究現(xiàn)狀

最近“人豬嵌合胚胎”的新聞轟動(dòng)世界，但本發(fā)明認(rèn)為該技術(shù)路線不可行。

曾溢滔院士和黃淑幀教授課題組：首次將人的造血干細(xì)胞移植到山羊身上，登上2006年美國(guó)科學(xué)院報(bào)(PNAS同《科學(xué)》和《自然》雜志齊名)。據(jù)課題組介紹，美國(guó)科學(xué)家將人胎肝造血干細(xì)胞通過(guò)開腹后宮內(nèi)移植方法，移植到胎齡為49～54天的胎綿羊體內(nèi)，建立了人/綿羊異種移植嵌合體，移植的干細(xì)胞可以在山羊體內(nèi)存活2年之久。也有科研人員將人可無(wú)限增值的癌細(xì)胞已同樣方法試驗(yàn)，但隨著動(dòng)物免疫系統(tǒng)逐漸完善，癌細(xì)胞全部死亡。

本人也曾在90年代從事了先天免疫耐受的實(shí)驗(yàn)，并試圖以此方法識(shí)別(分辨)正常細(xì)胞與癌細(xì)胞之間的微細(xì)差異，從而獲取特異性抗癌抗體。曾經(jīng)申請(qǐng)過(guò)的專利說(shuō)明書中有這樣一段話……以求形成徹底的天然免疫耐受，導(dǎo)入兔子胚胎的正常細(xì)胞懸液可采用微型注射器，并在B超的監(jiān)視下進(jìn)行。我這段話的目的在告訴從事胚胎期先天免疫耐受的科研工作者，我們都犯了一個(gè)大錯(cuò)誤，異種細(xì)胞或異種抗原是不可能在羊或豬的胚胎內(nèi)建立起真正的天然免疫耐受機(jī)制的。

理論和實(shí)踐顯示外來(lái)抗原在動(dòng)物胚胎期有的能夠建立天然免疫耐受，有的則不能。似乎與動(dòng)物胚胎“自我”抗原的模擬度有關(guān)。為此早在2001年我就與所崇敬的知識(shí)淵博的著名老一輩免疫學(xué)家余傳霖老師通過(guò)書信往來(lái)，在余老師鐵血的事實(shí)根據(jù)面前，最終確認(rèn)動(dòng)物胚胎期攝取動(dòng)物胚胎“自身”抗原的APC細(xì)胞，存在著“自我”識(shí)別受體這一事實(shí)，這一發(fā)現(xiàn)表明動(dòng)物胚胎期“自我”識(shí)別機(jī)制的建立，是通過(guò)“自我”識(shí)別受體的功能完成對(duì)“自身”抗原的檢測(cè)和呈遞，完成天然免疫耐受的。異種抗原不能通過(guò)“自我”識(shí)別受體被動(dòng)物胚胎期APC細(xì)胞所攝取和呈遞的。也就是說(shuō)外來(lái)抗原是不能在動(dòng)物體內(nèi)建立類似“自我”天然免疫耐受的。遺憾的是有關(guān)動(dòng)物胚胎期建立天然免疫耐受途徑，這一有重大缺陷的理論一直應(yīng)用和影響到今天，這說(shuō)明理論研究的滯后對(duì)科研研究的影響。

1.1.1.結(jié)論：

(1).本發(fā)明認(rèn)為理論和實(shí)驗(yàn)表明“種抗原”是“天然免疫耐受”的分界線。

(2).跨種抗原必須轉(zhuǎn)化為同種“自身抗原”抗原，如本發(fā)明將人呼吸道正常上皮細(xì)胞抗原在母羊胚胎轉(zhuǎn)變?yōu)檠虻摹白陨砜乖?-“Ab2β抗體”，才能完成異種抗原在羊胚胎期的天然免疫耐受，實(shí)現(xiàn)“自我與非我”識(shí)別。

1.2.本發(fā)明理論依據(jù)：

1.2.1.天然免疫耐受理論

1.2.2.1.在免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟前如胚胎期接觸某種抗原，出生后當(dāng)再次遇到相同抗原時(shí)，表現(xiàn)對(duì)該抗原的特異性無(wú)反應(yīng)性，稱天然免疫耐受。其中中樞耐受：指胚胎期及出生后，T和B細(xì)胞未成熟時(shí)遇到自身抗原所形成的耐受。

1.2.2.2.在免疫系統(tǒng)的胚胎發(fā)育期，AId就能引起免疫耐受，新生期的AId也能引起較為持久的Id抑制。成年期獨(dú)特型抑制需要AId劑量較大，抑制卻較短暫。

1.2.2.3.大量試驗(yàn)證明同種外來(lái)抗原在動(dòng)物胚胎期能夠建立天然免疫耐受(即“自我與非我”識(shí)別系統(tǒng))，原因存在種抗原的“自我識(shí)別受體”。

1.2.2.抗體獨(dú)特型與抗獨(dú)特型抗體模擬抗原理論

數(shù)字龐大的Id或AId抗體可以摸擬整個(gè)外來(lái)抗原世界。利用這一理論，特別是通過(guò)創(chuàng)造性應(yīng)用相關(guān)理論和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，就可以制備模擬人呼吸道“正常上皮細(xì)胞細(xì)胞”膜表面抗原分子的Ab2β抗體，并以此區(qū)分相應(yīng)癌細(xì)胞膜表面特異抗原分子。

1.2.3多態(tài)性MHC免疫識(shí)別理論

多態(tài)性MHC的生物學(xué)功能和意義，決定了同種動(dòng)物不同品系特別是某些品系動(dòng)物具有更廣和更深的免疫識(shí)別功能，應(yīng)用多態(tài)性MHC免疫識(shí)別理論，就是為最大限度增加免疫識(shí)別能力。

1.2.4.模擬人呼吸道上皮細(xì)胞細(xì)胞膜表面抗原分子所需要的“Ab2β抗體”

1.2.4.1.本發(fā)明相對(duì)于人民衛(wèi)生出版社教科書《天然自身抗體》所闡述：“現(xiàn)代研究庫(kù)容量10的7次方可覆蓋百分之99％自身抗原決定基，庫(kù)容量超過(guò)10的8次方可得到相對(duì)親和力較高自身抗體”?？勺鳛閷?shí)驗(yàn)參考。

1.2.4.2.如果實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身有可能不存在一些能夠識(shí)別人呼吸道上皮細(xì)胞細(xì)胞膜表面抗原的抗體，則所需要的“Ab2β抗體”也相應(yīng)減少。反之則亦然。

1.2.5.不同分子生態(tài)環(huán)境對(duì)同一個(gè)體或不同個(gè)體免疫系統(tǒng)的影響

提出這個(gè)理論旨在說(shuō)明僅與本發(fā)明相關(guān)的認(rèn)識(shí)，即經(jīng)過(guò)特定抗原免疫和未經(jīng)過(guò)特定抗原免疫的同一個(gè)體或同一品系動(dòng)物，除反應(yīng)性和親和力以及抗體效價(jià)區(qū)別之外，未必經(jīng)過(guò)特定抗原免疫的抗血清就是所需抗特定抗原特定表位的抗體(如腫瘤細(xì)胞免疫)，而且識(shí)別抗原表位有限，原因在于優(yōu)勢(shì)克隆(多為MHC抗原)的作用。那么未經(jīng)過(guò)特定抗原免疫的同一個(gè)體或同一品系動(dòng)物的天然血清抗體，則可能識(shí)別更多抗原表位這也是區(qū)別。那么不同分子生態(tài)環(huán)境針對(duì)不同個(gè)體免疫系統(tǒng)的影響則更大。其理論豐富而復(fù)雜，但其相互作用機(jī)制都遵循和符合我們?nèi)庋鬯姷降拇笞匀谎莼?guī)律如各種物質(zhì)(包括人)之間相互作用機(jī)制。這就是本發(fā)明即采用經(jīng)過(guò)免疫的抗血清又采用未經(jīng)過(guò)免疫的血清的原因。

1.2.6.有關(guān)本發(fā)明自命標(biāo)題“Ab2β抗體庫(kù)”的相關(guān)理論問(wèn)題

本發(fā)明提出這個(gè)理論問(wèn)題的目的在于，(1).有的教科書根據(jù)Id與抗Id的血清學(xué)反應(yīng)和Ab2功能把Ab2分為α、β、γ和ε四種；也有的教科書直接把Ab2分為Ab2α和Ab2β兩種。本發(fā)明采用后一種教科書Ab2分型模式，即抗Ab1V區(qū)抗原結(jié)合部位即互不決定區(qū)(CDR)的抗體統(tǒng)稱Ab2β抗體，實(shí)際包括Ab2β抗體和Ab2γ抗體，原因在于這樣可以使本發(fā)明說(shuō)明書標(biāo)題和內(nèi)容簡(jiǎn)單化，易理解不易混淆而且更加說(shuō)明問(wèn)題。(2).抗Id抗體模擬抗原的模式包括：高變抗Id區(qū)與抗原間的同源性和基于拓?fù)湎嗨菩缘哪M。而且結(jié)構(gòu)上的模擬與功能模擬是一致的，如Ab1的相同表面可與兩種無(wú)關(guān)的結(jié)構(gòu)結(jié)合，另外模擬的程度也有完全性模擬和部分模擬之分別。(3).針對(duì)抗原結(jié)合部位的AId抗體稱為Ab2γ型，其中有一類抗體能模擬外來(lái)抗原(內(nèi)在影像)稱為Ab2β型。(4).Ab2γ型和Ab2β型都能抑制抗原與抗原受體的結(jié)合。

1.2.7.最關(guān)鍵理論：在免疫系統(tǒng)的胚胎發(fā)育期，AId就能引起免疫耐受《抗體分子與腫瘤》71頁(yè)……。

1.3.實(shí)驗(yàn)方案

1.3.1.第一階段試驗(yàn)

1.3.1.1.選擇不同品系母羊制備抗人呼吸道上皮細(xì)胞細(xì)胞膜表面不同抗原表位的Ab1抗體。通過(guò)如下三種技術(shù)路線途徑：

1.3.1.1.1.第一種途徑：

應(yīng)用保有天然正確空間結(jié)構(gòu)的人呼吸道上皮細(xì)胞，分別免疫不同品系母羊，從中分別提取抗人血清和其純化的總抗體。然后應(yīng)用人呼吸道上皮細(xì)胞分別與不同品系母羊的抗人血清和其純化的總抗體相互作用，接著以人呼吸道上皮細(xì)胞吸附其中抗體，即抗人呼吸道上皮細(xì)胞抗體，并采用常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)或新方法提取和純化這些抗體，本發(fā)明把這些專一抗人呼吸道上皮細(xì)胞細(xì)胞的抗體稱免疫“Ab1抗體”(該途徑在較少地方如天津等大城市采用)。

1.3.1.1.2.第二種途徑：

應(yīng)用保有天然正確空間結(jié)構(gòu)的人呼吸道上皮細(xì)胞細(xì)胞分別與上述未經(jīng)免疫的不同品系母羊(注：指天然母羊)的血清和其血清中提取純化的總抗體相互作用，接著以人呼吸道上皮細(xì)胞吸附其中抗體，即抗人呼吸道上皮細(xì)胞細(xì)胞的抗體，并采用常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)或新方法提取和純化這些抗體，本發(fā)明把這些專一抗人呼吸道上皮細(xì)胞細(xì)胞的抗體稱天然“Ab1抗體”。

1.3.1.1.3.第三種途徑：

應(yīng)用保有天然正確空間結(jié)構(gòu)的人呼吸道上皮細(xì)胞，與第二種途徑獲得的所有血清中提取純化的混合的總抗體相互作用，接著以人呼吸道上皮細(xì)胞吸附其中抗體，即抗人呼吸道上皮細(xì)胞的抗體，并采用常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)或新方法提取和純化這些抗體，本發(fā)明把這些專一抗人呼吸道上皮細(xì)胞的抗體稱混合天然“Ab1抗體”。

1.3.1.2.最后特別指出：將經(jīng)歷了三種途徑篩選Ab1抗體”后，關(guān)鍵是剩余的所有來(lái)自不同品系羊的總抗體(注：不結(jié)合人呼吸道上皮細(xì)胞的抗體，內(nèi)含有Ab2抗體)，將直接用于第二階段試驗(yàn)。

1.3.2.第二階段試驗(yàn)

1.3.2.1.構(gòu)建模擬人呼吸道上皮細(xì)胞細(xì)胞不同抗原表位的“Ab2β抗體庫(kù)”

1.3.2.1.1.試驗(yàn)步驟

(1).應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分別提取純化大量同種不同品系羊的總B細(xì)胞。

(2).將提取的羊總B細(xì)胞與第一階段試驗(yàn)獲得的“Ab1抗體”混合，再通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)或免疫磁珠技術(shù)，篩選出專一結(jié)合“Ab1抗體”的B細(xì)胞，即本發(fā)明所需的“Ab2β抗體”產(chǎn)生細(xì)胞。

(3).如果真正需要的話，通過(guò)本發(fā)明簡(jiǎn)單的、獨(dú)創(chuàng)性免疫學(xué)新試驗(yàn)技術(shù)，可以完全清除掉與“Ab1抗體”本身的抗原結(jié)合部位不能結(jié)合的任何無(wú)關(guān)的B細(xì)胞，專一篩選結(jié)合“Ab1抗體”的不同品系的母羊“Ab2β抗體”產(chǎn)生細(xì)胞。

1.3.2.1.2.制備“Ab2β抗體庫(kù)”的三條途徑

(1)第一條途徑：

應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，將經(jīng)歷了第一階段三種途徑篩選Ab1抗體”后，剩余的所有來(lái)自不同品系羊的總抗體(注：內(nèi)有Ab2抗體)，分別與第一階段第二種途徑“天然Ab1抗體”和第三種途徑的“混合天然Ab1抗體”相互作用，從中篩選相結(jié)合的Ab2β抗體，制備和構(gòu)建成模擬人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面抗原---即獲得來(lái)自羊源的Ab2β抗體庫(kù)(包含Ab2γ抗體)。

(2)第二條途徑：

.應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分別提取純化同種大量不同品系羊的總B細(xì)胞，將能夠與Ab1抗體結(jié)合的B細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，在特定的不同時(shí)間內(nèi)，將體外培養(yǎng)的B細(xì)胞，通過(guò)體外培養(yǎng)B細(xì)胞技術(shù)，制備和構(gòu)建成模擬人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面抗原----即獲得來(lái)自羊源分泌性“Ab2β抗體庫(kù)”(包含Ab2γ抗體)。

(3)第三條途徑：

應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分別提取純化同種大量不同品系羊的總B細(xì)胞，將能夠與Ab1抗體抗原結(jié)合部位結(jié)合的B細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，在特定的不同時(shí)間內(nèi)，將體外培養(yǎng)的B細(xì)胞，通過(guò)基因工程抗體技術(shù)如噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，制備和構(gòu)建成模擬人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面抗原---即獲得來(lái)自羊源的噬菌體“Ab2β抗體庫(kù)”(包含Ab2γ抗體)。特別指出：由于母羊胚胎不大，因此所需“Ab2β抗體”量不會(huì)很大，因此相對(duì)復(fù)雜的第三條途徑只是一個(gè)備用途徑。

以上三條途徑盡可能獲得不同品系羊免疫系統(tǒng)模擬人呼吸道上皮細(xì)胞膜表面不同表位的“Ab2β抗體″，并以此構(gòu)建初級(jí)“Ab2β抗體庫(kù)″。

1.3.2.2.驗(yàn)證初級(jí)“Ab2β抗體庫(kù)″的功能和效果

利用競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)：如ELISA和流式細(xì)胞術(shù)等試驗(yàn)，通過(guò)觀察Ab2β抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制人呼吸道上皮細(xì)胞與Ab1抗體結(jié)合的能力來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.3.第三階段試驗(yàn)

1.3.3.1.理論和實(shí)踐證明：在免疫系統(tǒng)的胚胎發(fā)育期，AId就能引起免疫耐受。

1.3.3.2.應(yīng)用上述選擇的特定品系已經(jīng)懷孕母羊，在其胚胎特定時(shí)間里，將獲得的“Ab2β抗體”，通過(guò)如下兩條途徑導(dǎo)入母羊胚胎：

(1)第一條途徑：在羊母體胚胎，特定時(shí)間妊娠內(nèi)，在B超監(jiān)視下，將混合Ab2β抗體的人呼吸道上皮細(xì)胞注射到胚胎腹腔內(nèi)。

(2)第二條途徑：將獲得的“Ab2β抗體”，注射到特定品系已經(jīng)懷孕的母羊血管內(nèi)，“Ab2β抗體”將通過(guò)母體胎盤進(jìn)入母體胚胎。

(3)第三條途徑：剖腹產(chǎn)將混合Ab2β抗體的人呼吸道上皮細(xì)胞注射到胚胎大血管。

1.3.4.第四階段試驗(yàn)

待上述對(duì)人呼吸道上皮細(xì)胞建立天然免疫耐受的母羊胎兒出生，并進(jìn)入青春期免疫功能強(qiáng)大時(shí)，將相應(yīng)人肺癌細(xì)胞多次免疫該羊。由于能夠識(shí)別人正常呼吸道上皮細(xì)胞的“Ab1抗體”已經(jīng)在該羊胚胎期被克隆清除，因此羊的免疫系統(tǒng)僅對(duì)人肺癌細(xì)胞膜表面特異性抗原(注：與正常呼吸道上皮細(xì)胞僅有微小差異)加以精準(zhǔn)識(shí)別，并產(chǎn)生特異性羊抗人肺癌抗體---特異性抗癌抗體。

1.4.預(yù)期成果：

1.4.1.獲得羊等動(dòng)物源抗人肺惡性腫瘤抗體。

1.4.2.通過(guò)本發(fā)明獨(dú)創(chuàng)性技術(shù)和基因工程抗體技術(shù)的結(jié)合，可以將羊等動(dòng)物源抗人肺惡性腫瘤抗體，轉(zhuǎn)化并大量制備成人源或全人源抗人肺癌抗體。