本發(fā)明涉及生物技術領域中，凝集素組識別的糖鏈在區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤中的應用。

背景技術：

隨著影像學技術的進步及廣泛應用，胰腺囊性病變(pancreatic cyst lesion，PCL)檢出率逐年提高。美國最近的研究統(tǒng)計PCL總患病率為2.5％，胰腺囊性病變是由一組擁有常見臨床癥狀的不同病理類型的病變組成的異質性病變，主要包括單純的胰腺假性囊腫(PPs)和胰腺囊性腫瘤(pancreatic cystic neoplasms，PCNs)。PCNs屬隱匿性發(fā)病早期無明顯體征，其以腺管或腺泡上皮增生、分泌物潴留形成囊腫為主要特征，在所有原發(fā)性胰腺腫瘤中約占1％～5％。2010版WHO腫瘤分類將胰腺囊性腫瘤細分為黏液性腫瘤：黏液性囊性腫瘤(Mucinous cystic neoplasm，MCN)、導管內(nèi)乳頭狀瘤(Intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)和非黏液性腫瘤：漿液性囊性腫瘤(Serous cystic neoplasm，SCN)、實性假乳頭狀瘤(Solid pseudopaillary neoplasm，SPN。其中，惡性胰腺囊性病變包括黏液性囊性腫瘤(MCN)和導管內(nèi)乳頭狀黏液瘤(IPMN)以及黏液性囊腺癌(Mucinous cystic adenocarcinoma，MCA)；而漿液性囊性腫瘤(SCN)則多為良性病變。不同病理類型其治療方法不同，但是單從臨床癥狀和影像學表現(xiàn)很難區(qū)分其良惡性，囊性病變通常由CT發(fā)現(xiàn)，但是CT對于診斷惡性腫瘤的敏感性低于70％，而特異性則在87％-98％之間，MRI的T2WI相能夠提供更好的軟組織對比，因而更常用于囊腫良惡性的鑒別診斷，但是其準確度依然停留于20％-80％的較低區(qū)間內(nèi)。單從影像學鑒別囊性病變良惡的準確性仍較低，同時常用的血清學腫瘤標志物：CEA；CA19-9；CA72-4以及CA153等，在鑒別癌前病變方面特異性、敏感性較低。病理組織學檢查仍是目前臨床診斷的金標準，但鑒于組織學檢查固有的缺陷如損傷性檢查、不能動態(tài)檢測等，尋求微創(chuàng)性的早期診斷方法是防控疾病惡變的關鍵.超聲內(nèi)鏡下細針穿刺活檢(endoscopic ultrasonography-guided fine needle aspiration，EUS-FNA)能夠為胰腺囊性腫瘤的診斷提供直觀的第一手資料。

蛋白質糖基化是一種最常見的蛋白翻譯后修飾，是在糖基轉移酶作用下將糖類轉移至蛋白質，和蛋白質上特殊的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程。研究表明，70％人類蛋白包含一個或多個糖鏈，1％的人類基因組參與了糖鏈的合成和修飾。哺乳動物中蛋白質的糖基化類型可分為三種：N-糖基化、O-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇錨。大多數(shù)糖蛋白質只含有一種糖基化類型，但是有些蛋白多肽同時連有N-糖鏈、O-糖鏈或糖氨聚糖。

凝集素由于其可特異性識別不同糖鏈結構并可以多價形式與糖鏈高親和性結合的特性被廣泛用于糖組學的研究，凝集素芯片通過固定于芯片上的凝集素探針與樣品中糖蛋白糖鏈特異性結合，可以高通量地檢測出樣品中糖蛋白糖鏈結構和連接方式的變化，是研究糖蛋白糖鏈結構變化最有效的分析工具之一。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是如何區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤。

為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了檢測凝集素組識別的糖鏈的物質在下述A1)或A2)中的應用：

A1)制備區(qū)分或輔助區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤(Mucinous cystic neoplasm，MCN)患者和胰腺漿液性囊性腫瘤(Serous cystic neoplasm，SCN)患者產(chǎn)品；

A2)區(qū)分或輔助區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤；

所述凝集素組包括b1)或b2)：

b1)WGA和/或BPL；

b2)由b1)與STL、DBA、PTL-I和MAL-I中的全部或部分組成的組合物。

上述應用中，所述凝集素組還可包括三十一種凝集素中的至少一種；所述三十一種凝集素為Jacalin、ECA、HHL、WFA、GSL-Ⅱ、MAL-Ⅱ、PHA-E、SJA、PNA、EEL、AAL、LTL、MPL、LEL、GSL-Ⅰ、LCA、RCA120、BS-Ⅰ、ConA、PTL-Ⅱ、DSA、SBA、VVA、NPL、PSA、ACA、UEA-Ⅰ、PWM、GNA、PHA-E+L和SNA。

其中，所述凝集素組中各凝集素識別的糖鏈如實施例中表2或/和表4所示。

上述應用中，所述凝集素組可僅為b1)或b2)，還可為由b1)或b2)與所述三十一種凝集素中的至少一種組成的組合物。

上述應用中，所述凝集素組識別的糖鏈含量可為所述凝集素組識別的糖鏈在胰腺囊液中的含量。

上述應用中，所述檢測所述凝集素組識別的糖鏈含量的物質可包括也可僅為檢測所述凝集素組識別的糖鏈含量所需的試劑和/或儀器。所述檢測所述凝集素組識別的糖鏈含量的物質具體可包括或可為所述凝集素組或含有所述凝集素組的芯片。

所述檢測所述凝集素組識別的糖鏈含量的試劑可包括所述凝集素組、熒光染料、封閉緩沖液、孵育緩沖液、PBST和/或PBS。所述檢測所述凝集素組識別的糖鏈含量的試劑也可僅由所述凝集素組、所述熒光染料、所述封閉緩沖液、所述孵育緩沖液、PBST和/或PBS組成。所述熒光物質可為Cy3(美國Amerhsma公司)。所述封閉緩沖液可為向PBS中加入BSA、甘氨酸和Tween-20得到的溶液，所述封閉緩沖液中BSA、甘氨酸和Tween-20的濃度分別為2％(質量百分比濃度)、500mmol/L和0.1％(質量百分比濃度)。所述孵育緩沖液可為向PBS中加入BSA、甘氨酸和Tween-20得到的溶液，所述孵育緩沖液中BSA、甘氨酸和Tween-20的濃度分別為2％(質量百分比濃度)、500mmol/L和0.1％(質量百分比濃度)。PBST為向PBS加入Tween-20得到的Tween-20質量百分比濃度為0.1％的溶液。甘氨酸可為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。Tween-20可為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。上文中的PBS的pH均可為7.4。

所述檢測所述凝集素組識別的糖鏈含量的儀器可包括所述芯片和/或GenPix4000B芯片掃描儀。所述檢測所述凝集素組識別的糖鏈含量的也可僅為所述芯片和/或GenPix 4000B芯片掃描儀。GenPix 4000B芯片掃描儀為美國Axon公司產(chǎn)品。

所述檢測所述凝集素組識別的糖鏈含量的物質還可由檢測所述凝集素組識別的糖鏈含量所需的試劑和/或儀器與數(shù)據(jù)處理裝置組成，所述數(shù)據(jù)處理裝置用于將來自待測對象的所述凝集素組識別的糖鏈的含量轉換為所述待測對象的診斷值，根據(jù)所述待測對象的診斷值確定所述待測對象為MCN患者或SCN患者。所述數(shù)據(jù)處理裝置可為軟件和/或模塊。所述軟件可為GenePix 3.0軟件。

在本發(fā)明的一個實施例中，闡述了用所述凝集素組中的WGA和BPL區(qū)分MCN患者和SCN患者的方法，所述方法包括：將來自待測對象的反應WGA和BPL識別的糖鏈的含量的熒光歸一化數(shù)值代入公式1得到所述待測對象的診斷值；

公式1中，WGA表示利用WGA檢測所述待測樣本時的熒光信號歸一化數(shù)值；BPL表示利用BPL檢測所述待測樣本時的熒光信號歸一化數(shù)值，Y表示所述待測樣本的診斷值。公式1中的WGA具體為利用WGA檢測所述待測樣本時的熒光信號與利用WGA、BPL、STL、DBA、PTL-I、MAL-I、Jacalin、ECA、HHL、WFA、GSL-Ⅱ、MAL-Ⅱ、PHA-E、SJA、PNA、EEL、AAL、LTL、MPL、LEL、GSL-Ⅰ、LCA、RCA120、BS-Ⅰ、ConA、PTL-Ⅱ、DSA、SBA、VVA、NPL、PSA、ACA、UEA-Ⅰ、PWM、GNA、PHA-E+L和SNA檢測所述待測樣本時的熒光信號之和的比值，BPL具體為利用BPL檢測所述待測樣本時的熒光信號與利用WGA、BPL、STL、DBA、PTL-I、MAL-I、Jacalin、ECA、HHL、WFA、GSL-Ⅱ、MAL-Ⅱ、PHA-E、SJA、PNA、EEL、AAL、LTL、MPL、LEL、GSL-Ⅰ、LCA、RCA120、BS-Ⅰ、ConA、PTL-Ⅱ、DSA、SBA、VVA、NPL、PSA、ACA、UEA-Ⅰ、PWM、GNA、PHA-E+L和SNA檢測所述待測樣本時的熒光信號之和的比值。

利用公式1以未知MCN患者和SCN患者的胰腺囊性腫瘤患者為待測對象對MCN患者和SCN患者進行區(qū)分時，如Y大于0.70，所述待測對象為或候選為MCN患者，如Y小于或等于0.70，所述待測對象為或候選為SCN患者。

在實際應用中，利用所述凝集素組識別的糖鏈的含量區(qū)分MCN患者和SCN患者時，可根據(jù)實際情況從所述凝集素組中選擇合適的凝集素及相應的模型區(qū)分MCN患者和SCN患者，只要是可以利用本發(fā)明的凝集素組識別的糖鏈的含量對MCN患者和SCN患者進行區(qū)分，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述凝集素芯片為將所述凝集素組中各凝集素固定于支持物上得到的芯片。所述支持物可為環(huán)氧化合物片基。所述環(huán)氧化合物片基為利用環(huán)氧化合物制備的支持物。所述凝集素芯片可含有陰性質控點和/或位置標記。所述凝集素芯片的陰性質控點可為BSA。所述凝集素芯的位置標記可為所述熒光染料標記的BSA。將凝集素固定于支持物上可利用博奧晶芯SmartArrayer48點樣儀器(北京博奧生物集團有限公司)進行。

為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了所述凝集素組識別的糖鏈含量在下述A1)或A2)中的應用：

A1)制備區(qū)分或輔助區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤(Mucinous cystic neoplasm，MCN)患者和胰腺漿液性囊性腫瘤(Serous cystic neoplasm，SCN)患者產(chǎn)品；

A2)區(qū)分或輔助區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤。

為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了所述凝集素組識別的糖鏈作為區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤標志物在區(qū)分或輔助區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤中的應用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了以所述凝集素組識別的糖鏈作為區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤標志物的區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤的物質在下述A1)或A2)中的應用；

A1)制備區(qū)分或輔助區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤產(chǎn)品；

A2)區(qū)分或輔助區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤。

為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了區(qū)分或輔助區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤產(chǎn)品，為檢測所述凝集素組識別的糖鏈含量的物質。

上述產(chǎn)品中，所述產(chǎn)品可包括所述凝集素組或含有所述凝集素組的芯片。

上述產(chǎn)品中所述芯片可為上述應用中所述芯片。

上述產(chǎn)品中，所述凝集素組中的各凝集素均可由熒光物質標記。所述熒光物質可為Cy3。

所述檢測所述凝集素組識別的糖鏈含量的物質可為上文所述檢測所述凝集素組識別的糖鏈含量的物質。

為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了所述產(chǎn)品在下述A1)或A2)中的應用；

A1)制備區(qū)分或輔助區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤產(chǎn)品；

A2)區(qū)分或輔助區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤。

為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了構建區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤的方法。

本發(fā)明所提供的構建區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤的方法，包括：分別對胰腺黏液性囊性腫瘤組和胰腺漿液性囊性腫瘤組胰腺囊液中的糖鏈進行定量分析，根據(jù)分析結果獲得胰腺囊性腫瘤糖鏈特征譜；所述胰腺囊性腫瘤糖鏈特征譜由所述凝集素組識別的糖鏈組成。

上述方法中，所述胰腺黏液性囊性腫瘤組可包括至少一個胰腺黏液性囊性腫瘤患者。所述胰腺漿液性囊性腫瘤組可包括至少一個胰腺漿液性囊性腫瘤患者。

上述方法中，對胰腺囊液中的糖鏈進行定量分析，可利用所述凝集素組進行。所述凝集素組中的各凝集素均可由熒光物質標記。所述熒光物質可為Cy3。

上述方法中，對胰腺囊液中的糖鏈進行定量分析可包括利用含有所述凝集素組的芯片分別對胰腺黏液性囊性腫瘤組和胰腺漿液性囊性腫瘤組胰腺囊液中的糖鏈進行定量分析。具體可包括：將待測樣品中的蛋白質用所述熒光物質標記后與所述芯片孵育，確定所述待測樣品中所述凝集素組識別的糖鏈的含量。

所述胰腺囊性腫瘤糖鏈特征譜可為公式1。

利用胰腺囊性腫瘤糖鏈特征譜可區(qū)分胰腺黏液性囊性腫瘤和胰腺漿液性囊性腫瘤。

在本發(fā)明的另一個實施例中，對胰腺囊液中的糖鏈進行定量分析包括利用所述凝集素組分別對胰腺黏液性囊性腫瘤組和胰腺漿液性囊性腫瘤組胰腺囊液中的糖鏈進行定量分析。

本發(fā)明中，所述糖鏈為糖基化蛋白中糖鏈。

本發(fā)明通過比較SCN患者與MCN患者的不同凝集素識別的糖蛋白糖鏈含量的差異，并通過相關性分析，發(fā)現(xiàn)用于區(qū)分SCN患者與MCN患者的六種凝集素識別的糖鏈，這六種凝集素分別為STL、WGA、BPL、DBA、PTL-I和MAL-I，STL、WGA、BPL和DBA這四種凝集素每種凝集素識別糖鏈在MCN患者胰腺囊液中的含量顯著高于SCN患者，且PTL-I和MAL-I這兩種凝集素每種凝集素識別糖鏈在MCN患者胰腺囊液中的含量顯著低于SCN患者，在利用WGA與BPL聯(lián)合區(qū)分SCN患者與MCN患者時的靈敏度為0.714，特異度為1。表明本發(fā)明的凝集素組識別的糖鏈可以作為生物分子標識，用于區(qū)分SCN患者與MCN患者，可以利用本發(fā)明的凝集素組及其識別的糖鏈區(qū)分SCN患者與MCN患者。

附圖說明

圖1為凝集素芯片點樣陣列圖及應用于糖蛋白糖鏈的熒光檢測圖，圖中A為凝集素芯片點樣陣列圖，B為胰腺黏液性囊腺瘤(MCN)、胰腺漿液性囊腺瘤(SCN)患者胰腺囊性腫瘤囊液糖蛋白糖鏈熒光檢測結果圖；

圖2為GenePix3.0軟件分析芯片掃描圖，其中橫坐標表示熒光強度。

圖3為ROC曲線分析結果。

圖4為以STL與BPL為例的驗證圖。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的封閉緩沖液為向PBS中加入BSA、甘氨酸和Tween-20得到的溶液，封閉緩沖液中BSA、甘氨酸和Tween-20的濃度分別為2％(質量百分比濃度)、500mmol/L和0.1％(質量百分比濃度)。孵育緩沖液為向PBS中加入BSA、甘氨酸和Tween-20得到的溶液，孵育緩沖液中BSA、甘氨酸和Tween-20的濃度分別為2％(質量百分比濃度)、500mmol/L和0.1％(質量百分比濃度)。PBST為向PBS加入Tween-20得到的Tween-20質量百分比濃度為0.1％的溶液。甘氨酸可為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。Tween-20可為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。上文中的PBS的pH均為7.4。

實施例1、用于區(qū)別MCN患者與SCN患者的糖基化蛋白糖鏈

(1)研究對象及樣本采集

研究對象：經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過(倫理號：S2014-108-01)，排除惡性腫瘤病史；嚴重心肺功能不全；出凝血功能障礙；前期經(jīng)影像學診斷明確，中國人民解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科聯(lián)合腫瘤外科病區(qū)收治PCNs患者，其中確診的MCN患者17例(入組MCN組)，SCN患者18例(入組SCN組)。

囊液采集至少0.2ml并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制劑(每0.1毫升囊液加入1μL)防止蛋白降解。

(2)胰腺囊性腫瘤囊液蛋白處理和熒光標記

35例囊液樣本各取相應體積(內(nèi)含100μg總蛋白)與100μL 0.1M Na₂CO₃(pH 9.3)緩沖液混勻，混合液與Cy3熒光染料室溫孵育3h，用Sephadex G-25柱分離純化Cy3標記的蛋白質，并用分光光度計測定收集液中被標記蛋白質的濃度。

(3)凝集素芯片和數(shù)據(jù)分析

凝集素芯片上固定有37種凝集素組成的凝集素組，凝集素的點樣陣列如圖1中A所示，各凝集素的詳細信息如表1所示。

將表1中的37種凝集素分別按照各凝集素廠家提供的使用說明配成1mg/mL的點樣液。其中Cy3標記的和非標記的BSA分別為位置標記和陰性質控點。按博奧晶芯SmartArrayer48點樣儀器(北京博奧生物集團有限公司)48點樣系統(tǒng)設置參數(shù)每種凝集素重復點樣三次，其點樣矩陣為4×10的陣列重復點制4個區(qū)，點制于環(huán)氧化合物片基上。點樣完畢將芯片置于濕度為50％的環(huán)境中孵育過夜，然后在37℃真空干燥箱中干燥3h，便于凝集素與片基有效的結合，備用。封閉前，點制好的芯片用pH7.4的1×PBST和1×PBS各清洗芯片2次，每次5min，甩干，得到凝集素芯片。

表1、凝集素芯片凝集素信息

在芯片雜交盒中，于封閉緩沖液中4rpm勻速旋轉25℃封閉1h，用PBST，pH7.4的PBS各洗2次，每次5min，甩干；MCN組和SCN組個例樣本各取5μg標記后蛋白質，分別與孵育緩沖液混合后，與芯片室溫孵育3h，用10mmol/L PBST與10mmol/L PBS各洗2次，每次5min，甩干；GenPix 4000B芯片掃描儀(美國Axon公司)掃描芯片。然后用GenePix 3.0軟件從掃描結果圖中獲取熒光信號強度值和背景值等信息進行分析，可獲得MCN組和SCN組凝集素芯片上每個點的熒光信號值，該款芯片中每種凝集素對應3個重復點，即實際每種凝集素重復檢測3次，均獲得3個信號數(shù)據(jù)，抽取中值，即每個凝集素對應一個中值。計算每個凝集素的中值所占37種凝集素中值之和的比例完成數(shù)據(jù)歸一化。每個樣本做三次重復。凝集素歸一化熒光強度表示為三次重復的均值±標準偏差值。計算每個凝集素熒光強度在MCN組歸一化數(shù)值與SCN組歸一化數(shù)值的比值(即ratio值)來比較糖基化蛋白質的相對變化。數(shù)據(jù)同時利用SPSS19進行t檢驗分析。

一個MCN組樣本和一個SCN組樣本的GenPix 4000B芯片掃描儀掃描芯片的結果如圖1中B所示。GenePix3.0軟件分析芯片掃描圖如圖2所示。結果表明，(1)MCN組和SCN組中，糖基化蛋白中，Jacalin，LEL，LCA，ConA以及ACA的信號強度均值均大于0.05，表明其特異性識別的糖基化蛋白的糖鏈以高甘露糖和核心巖藻糖糖鏈結構為主，LEL和ConA識別的高甘露糖型N-糖鏈，Jacalin識別的Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr(T)和GalNAcα-Ser/Thr(Tn)，ACA識別的Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr(T antigen),在兩類囊腺瘤囊液中含量均較高；(2)凝集素WFA識別的terminating in GalNAcα/β1-3/6Gal結構,STL識別的trimers and tetramers of GlcNAc和core(GlcNAc)的N-糖鏈結構只在MCN組樣本中具有較高含量.(3)而凝集素PTL-I識別的GalNAc,GalNAcα-1,3Gal,GalNAcα-1,3Galβ-1,3/4Glc,凝集素MAL-I識別的Galβ-1,4GlcNAc結構只在SCN組樣本中含量升高。

MCN、SCN囊液糖蛋白糖鏈譜的變化：

利用凝集素芯片分別對MCN組與SCN組囊液樣本進行檢測，通過軟件獲取芯片數(shù)據(jù)并歸一化處理后，計算ratio值(表2、表3與表4)，歸一化數(shù)據(jù)如圖2所示。

表2、MCN及SCN囊液中差異表達的糖蛋白糖鏈結構及特異識別的糖鏈結構的凝集素

表3、各樣本熒光信號歸一化數(shù)值

表4、其余凝集素的Ratio值

根據(jù)統(tǒng)計學理論，Ratio值介于0.5與2之間，則樣本中相同糖蛋白糖鏈含量在MCN組與SCN組兩組樣本間無差異；Ratio值≥2，則MCN組樣本中的糖蛋白糖鏈含量顯著高于SCN組中相同糖蛋白糖鏈含量；Ratio值≤0.5，則MCN組樣本中的糖蛋白糖鏈含量顯著低于SCN組中相同糖蛋白糖鏈的含量。

結果發(fā)現(xiàn)，6種凝集素識別的糖基化蛋白糖鏈含量在MCN組與SCN組囊液中有顯著差異。糖蛋白糖鏈中，STL識別的trimers and tetramers of GlcNAc和core(GlcNAc)的N-糖鏈結構、WGA識別的多價唾液酸結構、BPL識別的Galβ1-3GalNAc與Terminal GalNAc、DBA識別的αGalNAc、Tn antigen、GalNAcα1-3((Fucα1-2))Gal(blood group A antigen)在MCN組中含量明顯增加。PTL-I和MAL-I這兩種凝集素識別的糖鏈結構在SCN組中含量顯著增加(R<0.5，p<0.05)。表明可以利用這6種凝集素及含有其識別的糖蛋白糖鏈區(qū)分MCN患者與SCN患者。

為區(qū)分MCN患者與SCN患者，以WGA與BPL為例構建了利用多因素Logistic回歸構建了區(qū)分MCN患者與SCN患者的數(shù)學模型，見公式1。

公式1中，WGA表示利用WGA進行檢測時樣本熒光信號歸一化數(shù)值，BPL表示利用BPL進行檢測時樣本熒光信號歸一化數(shù)值，Y表示樣本的診斷值。

利用公式1以未知MCN患者和SCN患者的胰腺囊性腫瘤患者為待測對象時進行ROC曲線分析(圖3)，曲線下面積AUC＝0.853，靈敏度為0.714，特異度為1，該方法判定為胰腺癌患者的閾值為0.70，即當Y大于0.70時，待測對象疑似為MCN患者，當Y小于或等于0.70時，待測對象為SCN患者。

(4)凝集素印跡

為進一步驗證凝集素芯片的結果，以凝集素STL和BPL為例，將Cy3熒光標記的凝集素與轉膜后的胰腺囊性腫瘤囊液蛋白孵育，經(jīng)掃描儀掃描和Genepix 3.0軟件分析，確定含有STL和BPL識別的糖鏈的糖基化蛋白在MCN組與SCN組囊液中的含量情況。具體操作步驟如下：

將30μg蛋白樣本先經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后，取出凝膠，在轉膜緩沖液中漂洗數(shù)秒。PVDF膜使用前先用無水甲醇預處理5min后轉至轉膜緩沖液中平衡好后使用。取出凝膠使用TE 70PWR半干轉膜儀按照每平方厘米PVDF膜電流0.8mA，恒流轉膜1.5h。轉膜完畢后，立即把PVDF膜放置到預先準備好的TBST中清洗兩次，每次10min洗去膜上殘留的轉膜緩沖液.然后轉入Carbo-free封閉液中，在搖床上輕搖1h封閉。封閉結束后，直接將Cy3熒光標記的凝集素按終濃度2μg/mL加入Carbo-free封閉液中，在搖床上輕搖4℃避光過夜。TBST清洗膜3次，每次10min，然后在Storm840凝膠成像系統(tǒng)中設置PMT為800，紅色熒光通道(635nm激發(fā)波長/650LP發(fā)射波長)下掃描圖像，用Image J軟件讀取蛋白條帶灰度值。

結果(圖4)顯示，STL和BPL在18例MCN患者的囊液樣本中的熒光強度明顯高于在17例SCN患者囊液樣本中的熒光強度，表明，糖基化蛋白中，STL和BPL結合的糖鏈在MCN患者囊液中的含量高于在SCN患者囊液中的含量。在60kDa和50kDa的兩條蛋白條帶(白框勾勒)處，STL作為探針在MCN患者中的熒光強度顯著高于在SCN患者中的熒光強度(P<0.05)；在120kDa的蛋白條帶(白框勾勒)處，BPL作為探針在MCN患者中的熒光強度顯著高于在SCN患者中的熒光強度(P<0.05)。結果顯示與凝集素芯片結果一致。證明這些凝集素可以作為探針通過對胰腺囊性腫瘤囊液中的糖蛋白糖鏈的檢測區(qū)別SCN患者與MCN患者。