本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及基于核酸適體熒光探針I(yè)NS2的胰島素試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
胰島素是由胰臟內(nèi)的胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。外源性胰島素主要用來糖尿病治療。
胰島素的生物合成速度受血漿葡萄糖濃度的影響，當(dāng)血糖濃度升高時，β細(xì)胞中胰島素原含量增加，胰島素合成加速。胰島素在胰島β細(xì)胞中合成。胰島素的分子量5700，由兩條氨基酸肽鏈組成。A鏈有21個氨基酸，B鏈有30個氨基酸。A-B 鏈之間有兩處二硫鍵相連。胰島素是與C肽以相等分子分泌進(jìn)入血液的。臨床上使用胰島素治療的病人，血清中存在胰島素抗體，影響放射免疫方法測定血胰島素水平，在這種情況下可通過測定血漿C肽水平，來了解內(nèi)源性胰島素分泌狀態(tài)。
目前胰島素的檢測方法有三大類：色譜法、免疫學(xué)法、循環(huán)酶法。色譜法靈敏度高、特異性好，但樣品處理、分離條件、色譜柱制備諸多變異，使其難以標(biāo)準(zhǔn)化；而且HPLC設(shè)備價格昂貴、技術(shù)條件要求高，需專門的維護(hù)人員，使其推廣困難。免疫學(xué)法需要還原游離INS形式，抗體熒光分析法和比濁法不能直接檢測游離型同型半胱胺酸，只能檢測血漿總同型半胱胺酸，用還原劑在37℃半小時卵育對血樣進(jìn)行還原處理。免疫學(xué)法需一小時以上才能出結(jié)果，操作步驟繁瑣，因為需要進(jìn)行還原處理可受一些不確定的因素影響。循環(huán)酶法過程繁瑣，且檢測限低、產(chǎn)生誤差較大，價格昂貴，故得不到推廣。
核酸適配體是近年發(fā)展起來的一類新型識別分子，近年來受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注，大量針對重要生理活性分子的核酸適配體被篩選出來；各種基于核酸適配體的分析方法和技術(shù)已被報道；核酸適配體藥物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批準(zhǔn)上市。SELEX技術(shù)篩選得到的寡核苷酸序列被稱為適配子, 國內(nèi)其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識體或核酸適配體等。SELEX 技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機(jī)寡核苷酸(由兩端的固定序列和中間的隨機(jī)序列組成) 文庫,通過施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo)，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過程), 并結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù), 經(jīng)過多輪的循環(huán)選擇富集, 獲得與靶物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 長度一般為25~ 60 個核苷酸。
由上可知，核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性, 使其在疾病診斷中具有良好的應(yīng)用前景, 盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報道較少, 但應(yīng)用適體檢測短肽蛋白的研究卻不斷增多, 基于適體的檢測新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。但是目前基于核酸適體的針對于胰島素的高效特異性識別研究還很缺乏，且針對于胰島素的核酸適體及其篩選制備方法尚未見有報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的易產(chǎn)生操作技術(shù)誤差、重復(fù)性欠佳、干擾因素很多、操作繁瑣、測試成本高等不足，提供一種基于核酸適體熒光探針的胰島素INS試劑盒及其檢測方法。
本發(fā)明的方案是通過這樣實現(xiàn)的：
一種基于核酸適體熒光探針的胰島素試劑盒，其特征在于，主要成分包括：含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液；含 MgCl2的0.2M磷酸緩沖液；胰島素標(biāo)準(zhǔn)品；胰島素核酸適體熒光探針；所述胰島素核酸適體熒光探針為5'和3'兩端分別標(biāo)記熒光芘分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為：gcgagaggtg ggctactacc caccagagct atgtgacacc cggcgtgtat actgaacc。該序列命名為INS2。
以上所述的一種基于核酸適體熒光探針的胰島素試劑盒，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液為含有1~280 mmol/L NH4Cl, 1~34 mmol/L Tris,1~2mmol/LEDTA-Na2, pH 7.0~7.2；所述含 MgCl2的0.2M磷酸緩沖液為含有1~10mmol/L MgCl2。
以上任一所述的一種基于核酸適體熒光探針的胰島素試劑盒，其特征在于，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液、含 MgCl2的0.2M磷酸緩沖液、胰島素標(biāo)準(zhǔn)品、胰島素核酸適體熒光探針為配制好直接使用的液體試劑或是使用前需加水溶解的干粉狀態(tài)。
以上所述的一種基于核酸適體熒光探針的胰島素試劑盒，其特征在于，該試劑盒用于檢測肝素抗凝全血或末梢血中的胰島素濃度。
一種用以上任一所述基于核酸適體熒光探針的胰島素試劑盒來檢測胰島素濃度的方法，其特征在于，方法步驟包括：
（1）血樣裂解：將血樣和含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液按1:0.5~5體積比混勻，靜置5~30min，再中速離心5~10min，收集上清液；
（2）混合卵育：混合卵育：取20~100μl步驟1）得到的上清液和30~50ul的用含 MgCl2的0.2M磷酸緩沖液，溶解胰島素核酸適體熒光探針得到的胰島素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育5~15min，使胰島素核酸適體熒光探針與血樣充分結(jié)合，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照胰島素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中胰島素的濃度。
以上所述的生物醫(yī)學(xué)軟件為Sigmaplot軟件，于市面上可以購買到。
以上所述的一種用基于核酸適體熒光探針的胰島素試劑盒來檢測胰島素濃度的方法，其特征在于，所述胰島素核酸適體熒光探針試劑中胰島素核酸適體熒光探針濃度為200~400 nmol/L，其特性還在于,所述胰島素核酸適體熒光探針為5'和3'兩端分別標(biāo)記熒光芘分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為：gcgagaggtg ggctactacc caccagagct atgtgacacc cggcgtgtat actgaacc。
胰島素核酸適體熒光探針不與胰島素結(jié)合時，核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)，5'和3'兩端的芘分子單體相互游離, 熒光激發(fā)后發(fā)射波長在 370~ 400nm 之間；胰島素核酸適體熒光探針與胰島素結(jié)合時，胰島素誘導(dǎo)其發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，核酸適體5'和3'兩端的芘分子單體相互靠近，形成激發(fā)態(tài)二聚體，熒光激發(fā)后激發(fā)態(tài)二聚體發(fā)射波長在 480 到 500nm之間。
以上所述的一種用基于核酸適體熒光探針的胰島素試劑盒來檢測胰島素濃度的方法，其特征在于，所述的血樣為肝素抗凝全血或末梢血，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液為含有1~280 mmol/L NH4Cl, 1~34 mmol/L Tris,1~2mmol/LEDTA-Na2, pH 7.0~7.2；所述含 MgCl2的0.2M磷酸緩沖液為含有1~10mmol/L MgCl2；所述熒光檢測儀為具有時間分辨熒光測定的熒光檢測儀。
以上所述的一種用基于核酸適體熒光探針的胰島素試劑盒來檢測胰島素濃度的方法，其特征在于，該檢測方法用于檢測肝素抗凝全血或末梢血中的胰島素濃度。
本發(fā)明的原理是：在不與胰島素時，核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)，5' 和3' 兩端的芘分子單體相互游離, 熒光發(fā)射波長在 370 到 400nm 之間；與胰島素結(jié)合時，胰島素誘導(dǎo)核酸適體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，核酸適體的5' 和3'兩端的芘分子單體相互靠近，形成二聚體，芘激發(fā)態(tài)發(fā)射波長二聚體在 480 到 500nm之間。芘激發(fā)態(tài)二聚體熒光壽命有著長達(dá)100 ns，比生物樣品自發(fā)熒光壽命（約為5 ns）長，通過檢測胰島素核酸適體探針和樣品混合后的熒光強(qiáng)度和熒光壽命，計算樣品中胰島素的濃度。
本發(fā)明的實質(zhì)性特點和顯著進(jìn)步是：
（1）檢測操作簡單快速，無需復(fù)雜樣品加工和分離，將核酸適體探針直接加入裂解后的血樣液，用熒光分光光度計短時間內(nèi)就可以檢測480~500nm處的熒光值；
（2）本試劑盒及其檢測方法具有靈敏度高，檢測結(jié)果重復(fù)性高，樣品檢測誤差在0.01~0.1%之間，特異性強(qiáng)，胰島素核酸適體熒光探針不與胰島素結(jié)合時，核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)，5'和3'兩端的芘分子單體相互游離, 熒光激發(fā)后發(fā)射波長在 370~ 400nm 之間；其與胰島素結(jié)合時，胰島素誘導(dǎo)其發(fā)生改變，核酸適體5'和3'兩端的芘分子單體相互靠近，形成二聚體，熒光激發(fā)后二聚體發(fā)射波長在 480~ 500nm之間。
（3）所用的試劑可以使配制好可直接使用的液體試劑或是使用前加水溶解后使用的干粉狀態(tài)，檢測試劑可以常溫貯存，運(yùn)輸方便。
具體實施方式
以下結(jié)合表1和實施例描述本發(fā)明基于核酸適體熒光探針的胰島素INS試劑盒及其檢測方法。
表1.實施例中的試劑盒試劑成分組成
實施例1
按照表1中實施例1所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將肝素抗凝全血、紅細(xì)胞裂解液按體積比1:0.5混勻，靜置30min，再中速離心7min，收集上清；
（2）混合卵育：取20μl步驟1）得到的上清和45ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解胰島素核酸適體熒光探針得到的胰島素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育5min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照胰島素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中胰島素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.05±0.01%。
實施例2
按照表1中實施例2所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將末梢血、紅細(xì)胞裂解液按體積比1:2.5混勻，靜置5min，再中速離心6min，收集上清；
（2）混合卵育：取50μl步驟1）得到的上清和30ul的
用0.2M磷酸緩沖液溶解胰島素核酸適體熒光探針得到的胰島素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育6min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照胰島素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中胰島素的濃度。樣品的3個平行測定誤差為0.02±0.01%。
實施例3
按照表1中實施例3所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將末梢血、紅細(xì)胞裂解液按體積比1:3.5混勻，靜置10min，再中速離心5min，收集上清；
（2）混合卵育：取75μl步驟1）得到的上清和45ul的
用0.2M磷酸緩沖液溶解胰島素核酸適體熒光探針得到的胰島素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育7min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照胰島素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中胰島素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.04±0.01%。
實施例4
按照表1中實施例4所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將肝素抗凝全血、紅細(xì)胞裂解液按體積比1:0.5混勻，靜置25min，再中速離心8min，收集上清；
（2）混合卵育：取100μl步驟1）得到的上清和50ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解胰島素核酸適體熒光探針得到的胰島素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育8min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照胰島素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中胰島素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.06±0.01%。
實施例5
按照表1中實施例5所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將肝素抗凝全血、紅細(xì)胞裂解液按體積比1:1.0混勻，靜置20min，再中速離心9min，收集上清；
（2）混合卵育：取80μl步驟1）得到的上清和30ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解胰島素核酸適體熒光探針得到的胰島素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育9min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照胰島素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中胰島素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.07±0.01%。
實施例6
按照表1中實施例6所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將肝素抗凝全血、紅細(xì)胞裂解液按體積比1:4.5混勻，靜置15min，再中速離心10min，收集上清；
（2）混合卵育：取30μl步驟1）得到的上清和40ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解胰島素核酸適體熒光探針得到的胰島素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育10min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照胰島素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中胰島素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.08±0.01%。
實施例7
按照表1中實施例7所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將末梢血、紅細(xì)胞裂解液按體積比1:3.0混勻，靜置18min，再中速離心8min，收集上清；
（2）混合卵育：取50μl步驟1）得到的上清和20ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解胰島素核酸適體熒光探針得到的胰島素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育12min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照胰島素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中胰島素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.1±0.01%。
實施例8
按照表1中實施例8所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將末梢血、紅細(xì)胞裂解液按體積比1:2.0混勻，靜置26min，再中速離心6min，收集上清；
（2）混合卵育：取60μl步驟1）得到的上清和25ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解胰島素核酸適體熒光探針得到的胰島素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育13min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照胰島素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中胰島素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.02±0.01%。
實施例9
按照表1中實施例9所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將末梢血、紅細(xì)胞裂解液按體積比1:4.0混勻，靜置8min，再中速離心7min，收集上清；
（2）混合卵育：取40μl步驟1）得到的上清和35ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解胰島素核酸適體熒光探針得到的胰島素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育15min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照胰島素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中胰島素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.01±0.01%。
序列表
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gcgagaggtg ggctactacc caccagagct atgtgacacc cggcgtgtat actgaacc 58