本發(fā)明涉及藥物質(zhì)量控制方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及苦瓜葉的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

苦瓜葉為葫蘆科苦瓜屬一年生蔓性草本植物苦瓜(Momordica charantia L.)的干燥葉。性涼、味苦。具清熱解毒、殺菌、止痢、止痛的功效，能治療胃痛，痢疾，疔瘡腫毒?？喙先~作為常用民間藥，使用廣泛，常用于治療蚊蟲叮咬后皮膚的紅腫熱痛、小兒痱子、熱毒瘡腫、楊梅瘡、狗咬和鵝掌風(fēng)。

苦瓜葉資源豐富，療效確切，民間使用廣泛，認(rèn)可度高且方便易得，具有較好的開發(fā)價(jià)值。但是目前，國(guó)內(nèi)外多對(duì)苦瓜果實(shí)進(jìn)行多角度研究而其葉研究甚少，尚缺乏對(duì)苦瓜葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn)。

因此，為了確?？喙先~的質(zhì)量和安全，需要一種檢測(cè)方法，用于評(píng)估苦瓜葉的質(zhì)量?？紤]到中藥材的成分繁多，且各個(gè)成分間容易相互影響，僅以一兩個(gè)有效成分的含量難以全面評(píng)價(jià)中藥的真實(shí)質(zhì)量。因此，目前需要一種可以監(jiān)控苦瓜葉中多個(gè)成分的檢測(cè)方法，以更加全面地監(jiān)控苦瓜葉的質(zhì)量狀況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種苦瓜葉的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，它包括以下步驟：

(1)對(duì)照品溶液的制備：取苦瓜葉藥材粉末，50％甲醇提取，過(guò)濾，得苦瓜葉對(duì)照品溶液；

(2)參照物溶液的制備：取人參皂苷Rg1對(duì)照品，加入甲醇，得到參照物溶液；

(3)對(duì)照指紋圖譜的建立：

分別取參照物溶液和由不同批次苦瓜葉藥材制備得到的對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀檢測(cè)，得到各批次藥材和參照物的色譜數(shù)據(jù)；色譜條件如下：

檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；

色譜柱：C18色譜柱；

流動(dòng)相：流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈；

梯度洗脫程序如下：

對(duì)所得色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，建立苦瓜葉的對(duì)照指紋圖譜；

(4)供試品溶液的制備：取待測(cè)藥材，按照步驟(1)相同的方法制備得到供試品溶液；

(5)按照步驟(3)相同的色譜條件，將供試品溶液注入高效液相色譜儀檢測(cè)，將所得色譜圖與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，可鑒別出苦瓜葉及其質(zhì)量狀況。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述提取是超聲提取或回流提取。

進(jìn)一步地，所述回流提取的時(shí)間為1-2小時(shí)，超聲提取的時(shí)間為0.5-1小時(shí)；優(yōu)選超聲提取0.5小時(shí)。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述提取的溫度是40℃。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述藥材與50％甲醇溶液的重量體積比為1g:25mL。

進(jìn)一步地，所述C18色譜柱為迪馬C18色譜柱，色譜柱的規(guī)格為250mm×4.6mm，5μm

進(jìn)一步地，所述色譜條件的柱溫為25～35℃；更進(jìn)一步地，所述柱溫為30℃。

進(jìn)一步地，所述色譜條件的流速為1.0mL/min。

進(jìn)一步地，所述對(duì)照指紋圖譜如圖8中的R所示。

本發(fā)明通過(guò)多個(gè)工藝的篩選，將苦瓜葉中的多個(gè)成分有效分離并檢測(cè)出來(lái)，所得的指紋圖譜出峰多、各峰分離度良好，方法重復(fù)性好、精密度高，從而可以簡(jiǎn)便、快速、全面、準(zhǔn)確、可靠地監(jiān)控苦瓜葉藥材的質(zhì)量，為全面監(jiān)控苦瓜葉的藥材質(zhì)量提供了有效的保障。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說(shuō)明

圖1為人參皂苷Rg1的色譜圖。

圖2為甲醇提取色譜圖。

圖3為50％甲醛提取色譜圖。

圖4為回流提取1h色譜圖。

圖5為回流提取2h色譜圖。

圖6為超聲提取30min色譜圖。

圖7為超聲提取1h色譜圖。

圖8為10批不同產(chǎn)地苦瓜葉HPLC指紋色譜圖的疊加圖，R代表對(duì)照指紋圖譜；S1-S10代表不同產(chǎn)地10批次苦瓜葉樣品色譜圖譜。

圖9為不同產(chǎn)地苦瓜葉藥材的共有模式圖譜。

圖10為空白實(shí)驗(yàn)中，50％甲醇色譜圖。

圖11為苦瓜葉指紋圖譜穩(wěn)定性試驗(yàn)相似度評(píng)價(jià)疊加圖。

圖12為苦瓜葉指紋圖譜重復(fù)性試驗(yàn)相似度評(píng)價(jià)疊加圖。

圖13為苦瓜葉指紋圖譜儀器精密度試驗(yàn)相似度評(píng)價(jià)疊加圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例所用實(shí)驗(yàn)材料如下：

不同采收地點(diǎn)的樣品于2011年8月前后分別采自四川省成都市、彭州市、簡(jiǎn)陽(yáng)市、內(nèi)江市、自貢市、宜賓市及河北保定，浙江嘉興，廣東佛山等地。采集新鮮葉，除去雜質(zhì)，陰干即得。以上實(shí)驗(yàn)樣品均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蔣桂華教授鑒定為葫蘆科植物苦瓜Momordica charantia L.的干燥葉。樣品采集地點(diǎn)、時(shí)間及生長(zhǎng)環(huán)境見(jiàn)表1。

于2011年8月20日對(duì)口采于四川省彭州市敖平鎮(zhèn)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蔣桂華教授鑒定為葫蘆科苦瓜屬植物苦瓜Momordica charantia L.的干燥葉，作為對(duì)照藥材；所用試劑均為分析純。

表1不同產(chǎn)地苦瓜葉樣品

儀器如下：

Agilent 1200型HPLC高效液相色譜儀，電子恒溫水浴鍋(北京中興DZKW-4)，超聲波清洗器(昆山KQ5200E)，十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)SartoriusBP211D)。

試劑如下：

人參皂苷Rg1(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110703-201128)，甲醇(分析純)，甲醇(色譜純)，乙腈。

實(shí)施例1工藝參數(shù)的篩選

1、色譜條件的篩選

(1)檢測(cè)波長(zhǎng)考察

取(表1中7號(hào)樣)苦瓜葉藥材粉末2.0g，精密稱定，置于250mL錐形瓶中，加入50％甲醇50mL，稱重，超聲提取30min，冷卻，用50％甲醇補(bǔ)足至原重，用0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)，得供試液。吸取10μl，記錄供試液在全波長(zhǎng)掃描下的色譜圖。通過(guò)比較3D色譜圖，發(fā)現(xiàn)在250nm波長(zhǎng)下各峰吸收較強(qiáng)且分離度較好，因此將檢測(cè)波長(zhǎng)定為250nm。

(2)色譜條件

取供試液20μl，注入高效液相色譜儀，記錄在250nm檢測(cè)波長(zhǎng)下流動(dòng)相為乙睛-水、甲醇-水的色譜圖。從色譜圖可以看到，乙睛-水系統(tǒng)分離效果相對(duì)較好，甲醇-水系統(tǒng)未能有效分離各峰。因此，選定乙睛-水作為本指紋圖譜的色譜流動(dòng)相。

考察柱溫25℃、30℃、35℃，以優(yōu)化色譜條件。從色譜圖可以看到，柱溫對(duì)色譜峰的分離效果影響不大，故選擇柱溫為30℃。

從色譜圖可以看到，保留時(shí)間在80min以后已無(wú)其他色譜峰出現(xiàn)。因此將苦瓜葉藥材指紋圖譜的檢測(cè)時(shí)間定為80min。確定色譜條件如下：

流動(dòng)相：水(A)、乙腈(B)；

色譜柱：迪馬C18Ser#6001573；

柱溫：30℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；

檢測(cè)時(shí)間：80min；

進(jìn)樣量：20μl；

流速：1mL/min。

流動(dòng)相梯度如下所示：

測(cè)定法：吸取對(duì)照品溶液2μl、供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，記錄在250nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜圖。

2、對(duì)照品溶液的制備

本試驗(yàn)選擇人參皂苷Rg1作為外標(biāo)參照，采用色譜圖中峰面積相對(duì)較大，比較穩(wěn)定的出峰時(shí)間在32.442min的物質(zhì)峰作為參照物，標(biāo)記為S。

取干燥至恒重的人參皂苷Rg1對(duì)照品適量，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加入甲醇，定容，搖勻，配制成每1mL含有40μg對(duì)照品的溶液，用0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)。吸取對(duì)照溶液2μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。

3、供試品溶液制備方法考察

(1)提取溶劑選擇

取(表1中7號(hào)樣)苦瓜葉藥材粉末2.0g，精密稱定，置于250mL錐形瓶中，分別加入50％甲醇、甲醇，稱重，超聲處理30分鐘后，冷卻，用相應(yīng)提取溶劑補(bǔ)足至原重，搖勻，過(guò)濾，用0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)。濾液置于棕色容量瓶中，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，如圖2、3所示。

結(jié)果顯示：采用溶劑50％甲醇提取苦瓜葉藥材，色譜峰數(shù)目多，峰值高，信息量豐富，且峰形較好，分離度佳。故選擇50％甲醇作為提取溶劑。

(2)提取方法選擇

取7號(hào)藥材粉末2.0g，精密稱定，置于250mL錐形瓶中，加入50％甲醇50mL，稱重，分別回流提取1h、回流提取2h、超聲提取30min、超聲提取1h后，冷卻，用50％甲醇補(bǔ)足至原重，搖勻，過(guò)濾，用0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)。濾液置于棕色容量瓶中，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，如圖4-7所示。

結(jié)果顯示：采用上述的提取方法，樣品的峰數(shù)、分離度、峰形均較佳，最終選擇超聲處理30min。

因此，最終供試品的制備方法確定為：

取苦瓜葉藥材粉末2.0g，精密稱定，置于250mL錐形瓶中，加入50％甲醇50mL，稱重，超聲提取30min后，冷卻，用50％甲醇補(bǔ)足至原重，搖勻，過(guò)濾，用0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)。濾液置于棕色容量瓶中，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)施例2本發(fā)明的方法及其方法學(xué)驗(yàn)證

1、藥材HPLC對(duì)照指紋圖譜的建立

(1)不同產(chǎn)地苦瓜葉藥材HPLC指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜

取表1中10批苦瓜葉藥材，照實(shí)施例1下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，并且按照實(shí)施例1下的色譜條件下實(shí)驗(yàn)，記錄HPLC色譜圖。

結(jié)果顯示：HPLC色譜圖以保留時(shí)間約為32.431min的2號(hào)峰作為參照峰(S)，其保留時(shí)間及峰面積為1，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.5％，相對(duì)峰面積的RSD均較大，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”計(jì)算色譜的相似度，得到苦瓜葉藥材色譜對(duì)照?qǐng)D譜，見(jiàn)表2、表3及圖8。

表2苦瓜葉指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3苦瓜葉指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

(2)苦瓜葉HPLC指紋圖譜共有模式的確定

根據(jù)苦瓜葉樣品的HPLC圖譜，以國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”對(duì)指紋圖譜進(jìn)行分析，生成共有模式，得到7個(gè)特征峰，分別標(biāo)記為1，2，3……7。見(jiàn)圖9。

(3)苦瓜葉藥材的相似度評(píng)價(jià)

以苦瓜葉藥材對(duì)照指紋圖譜為參照，采用國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”，分別與苦瓜葉藥材進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 10批苦瓜葉藥材指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度

由上表可知，苦瓜葉藥材指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.9，相似性良好，反映了藥材的同源性。由圖8，可知10批苦瓜葉在主要成分上無(wú)明顯差異。

2、HPLC指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證

(1)空白實(shí)驗(yàn)

精密吸取50％甲醇20μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取溶劑不干擾實(shí)驗(yàn)測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖10。

(2)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取(7號(hào))苦瓜葉藥材，照實(shí)施例1下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(分別編號(hào)1～5)在實(shí)施例1下的色譜條件下實(shí)驗(yàn)，記錄HPLC色譜圖。

結(jié)果顯示：HPLC色譜圖以保留時(shí)間約為32.431min的2號(hào)峰作為參照峰(S)，其保留時(shí)間及峰面積為1，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.5％，相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0％，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”計(jì)算色譜的相似度，為0.998、0.996、0.999、0.997、0.995，RSD值為0.15％，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表5、6及圖11。

表5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)共有峰相對(duì)峰面積

(3)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取(7號(hào))苦瓜葉藥材，5份，照實(shí)施例1下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在實(shí)施例1的色譜條件下實(shí)驗(yàn)，記錄HPLC色譜圖。

結(jié)果顯示：HPLC色譜圖以保留時(shí)間約為32.431min的2號(hào)峰作為參照峰(S)，其保留時(shí)間及峰面積為1，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.4％，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.5％，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”計(jì)算色譜的相似度，均為1.000。見(jiàn)表7、8及圖12。

表7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表8重復(fù)性實(shí)驗(yàn)共有峰相對(duì)峰面積

(4)儀器精密度試驗(yàn)

取(7號(hào))苦瓜葉藥材，照實(shí)施例1下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在實(shí)施例1的色譜條件下實(shí)驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄HPLC色譜圖。

結(jié)果顯示：HPLC色譜圖以保留時(shí)間約為32.431min的2號(hào)峰作為參照峰(S)，其保留時(shí)間及峰面積為1，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.5％，相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0％，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”計(jì)算色譜的相似度，為0.999、0.997、0.997、0.996、0.999，均大于0.99，RSD值為0.13％，表明儀器精密度良好。見(jiàn)表9、10及圖13。

表9精密度實(shí)驗(yàn)共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表10精密度實(shí)驗(yàn)共有峰相對(duì)峰面積

綜上所述，本發(fā)明通過(guò)多個(gè)工藝的篩選，將苦瓜葉中的多個(gè)成分有效分離并檢測(cè)出來(lái)，所得的指紋圖譜出峰多、各峰分離度良好，方法重復(fù)性好、精密度高，從而可以簡(jiǎn)便、快速、全面、準(zhǔn)確、可靠地監(jiān)控苦瓜葉藥材的質(zhì)量，為全面監(jiān)控苦瓜葉的藥材質(zhì)量提供了有效的保障。