本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及基于核酸適體熒光探針EPO5的促紅細胞生成素試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
EPO是促紅細胞生成素（ErythropoietEP）的英文簡稱。人體中的促紅細胞生成素是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，能夠促進紅細胞生成。服用紅細胞生成素可以使患腎病貧血的病人增加血流比溶度（即增加血液中紅細胞百分比）。這種藥物近年進入商業(yè)市場。人體缺氧時，此種激素生成增加，并導(dǎo)致紅細胞增生。EPO興奮劑正是根據(jù)促紅細胞生成素的原理人工合成，它能促進肌肉中氧氣生成，從而使肌肉更有勁、工作時間更長。
促紅細胞生成素是對紅細胞的生成有增強作用的體液性因子。為分子量6-7萬的糖蛋白，糖的含量多，已證明血和尿中都有它的存在。未分化的干細胞分化成紅細胞系干細胞（erythropoietin responsive cell），促紅細胞生成素在此發(fā)揮作用，使之變?yōu)榍俺杉t細胞。對進一步再成熟為成紅血細胞、網(wǎng)織紅細胞，血紅蛋白的合成以及流入末梢血管等均有促進作用。一般在貧血和低氧狀態(tài)時，根據(jù)身體組織對氧的需要，促紅細胞生成素的供給量將增加，但在腎臟貧血時其含量則非常低。其生成器官和機制雖尚未清楚，可是作為某腎臟因子（renal erythropoietic factor）與血漿的基質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生腎小球的說法是有力的。此外，起著相當(dāng)于促紅細胞生成素作用的因子中，促進白細胞生成的有colony stimulating factor，促進血小板生成的為促血小板生成素，包括促紅細胞生成素在內(nèi)，統(tǒng)稱為造血促進因子。
增加紅血球的數(shù)目，用于貧血、組織斷離、早產(chǎn)兒，用在癌學(xué)和血液學(xué)方面。用于治療慢性腎衰患者的貧血癥。治療最初1～3周觀察到血細胞比容增加，且與劑量成比例，在4～6周中血細胞比容水平在不同研究中可達30%～40%之間不等，患者的生活質(zhì)量提高，包括體力耐受、情緒、起居方式和性功能的提高。對慢性腎衰不需要透析的貧血患者的研究表明，使用本品也是有利的。
目前促紅細胞生成素的檢測方法有三大類：色譜法、免疫學(xué)法、循環(huán)酶法。色譜法靈敏度高、特異性好，但樣品處理、分離條件、色譜柱制備諸多變異，使其難以標(biāo)準(zhǔn)化；而且HPLC設(shè)備價格昂貴、技術(shù)條件要求高，需專門的維護人員，使其推廣困難。免疫學(xué)法需要還原游離EPO形式，抗體熒光分析法和比濁法不能直接檢測游離型同型半胱胺酸，只能檢測血漿總糖化蛋白，用還原劑在37℃半小時卵育對血樣進行還原處理。免疫學(xué)法需一小時以上才能出結(jié)果，操作步驟繁瑣，因為需要進行還原處理可受一些不確定的因素影響。循環(huán)酶法過程繁瑣，且檢測限低、產(chǎn)生誤差較大，價格昂貴，故得不到推廣。
核酸適配體是近年發(fā)展起來的一類新型識別分子，近年來受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注，大量針對重要生理活性分子的核酸適配體被篩選出來；各種基于核酸適配體的分析方法和技術(shù)已被報道；核酸適配體藥物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批準(zhǔn)上市。SELEX技術(shù)篩選得到的寡核苷酸序列被稱為適配子, 國內(nèi)其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識體或核酸適配體等。SELEX 技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機寡核苷酸(由兩端的固定序列和中間的隨機序列組成) 文庫,通過施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo)，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過程), 并結(jié)合體外擴增技術(shù), 經(jīng)過多輪的循環(huán)選擇富集, 獲得與靶物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 長度一般為25~ 60 個核苷酸。
由上可知，核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性, 使其在疾病診斷中具有良好的應(yīng)用前景, 盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報道較少, 但應(yīng)用適體檢測球蛋白的研究卻不斷增多, 基于適體的檢測新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。但是目前基于核酸適體的針對于促紅細胞生成素的高效特異性識別研究還很缺乏，且針對于促紅細胞生成素的核酸適體及其篩選制備方法尚未見有報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的易產(chǎn)生操作技術(shù)誤差、重復(fù)性欠佳、干擾因素很多、操作繁瑣、測試成本高等不足，提供一種基于核酸適體熒光探針的促紅細胞生成素EPO試劑盒及其檢測方法。
本發(fā)明的方案是通過這樣實現(xiàn)的：
一種基于核酸適體熒光探針的促紅細胞生成素試劑盒，其特征在于，主要成分包括：含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細胞裂解液；含 MgCl2的0.2M磷酸緩沖液；促紅細胞生成素標(biāo)準(zhǔn)品；促紅細胞生成素核酸適體熒光探針；所述促紅細胞生成素核酸適體熒光探針為5'和3'兩端分別標(biāo)記熒光芘分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為：gctagctggt agcttaagtg ctagcctagc cagct。該序列命名為EPO5。
以上所述的一種基于核酸適體熒光探針的促紅細胞生成素試劑盒，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細胞裂解液為含有1~280 mmol/L NH4Cl, 1~34 mmol/L Tris,1~2mmol/LEDTA-Na2, pH 7.0~7.2；所述含 MgCl2的0.2M磷酸緩沖液為含有1~10mmol/L MgCl2。
以上任一所述的一種基于核酸適體熒光探針的促紅細胞生成素試劑盒，其特征在于，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細胞裂解液、含 MgCl2的0.2M磷酸緩沖液、促紅細胞生成素標(biāo)準(zhǔn)品、促紅細胞生成素核酸適體熒光探針為配制好直接使用的液體試劑或是使用前需加水溶解的干粉狀態(tài)。
以上所述的一種基于核酸適體熒光探針的促紅細胞生成素試劑盒，其特征在于，該試劑盒用于檢測肝素抗凝全血或末梢血中的促紅細胞生成素濃度。
一種用以上任一所述基于核酸適體熒光探針的促紅細胞生成素試劑盒來檢測促紅細胞生成素濃度的方法，其特征在于，方法步驟包括：
（1）血樣裂解：將血樣和含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細胞裂解液按1:0.5~5體積比混勻，靜置5~30min，再中速離心5~10min，收集上清液；
（2）混合卵育：混合卵育：取20~100μl步驟1）得到的上清液和30~50ul的用含 MgCl2的0.2M磷酸緩沖液，溶解促紅細胞生成素核酸適體熒光探針得到的促紅細胞生成素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育5~15min，使促紅細胞生成素核酸適體熒光探針與血樣充分結(jié)合，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照促紅細胞生成素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中促紅細胞生成素的濃度。
以上所述的生物醫(yī)學(xué)軟件為Sigma plot軟件，于市面上可以購買到。
以上所述的一種用基于核酸適體熒光探針的促紅細胞生成素試劑盒來檢測促紅細胞生成素濃度的方法，其特征在于，所述促紅細胞生成素核酸適體熒光探針試劑中促紅細胞生成素核酸適體熒光探針濃度為200~400 nmol/L，其特性還在于,所述促紅細胞生成素核酸適體熒光探針為5'和3'兩端分別標(biāo)記熒光芘分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為：gctagctggt agcttaagtg ctagcctagc cagct。
促紅細胞生成素核酸適體熒光探針不與促紅細胞生成素結(jié)合時，核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)，5'和3'兩端的芘分子單體相互游離, 熒光激發(fā)后發(fā)射波長在 370~ 400nm 之間；促紅細胞生成素核酸適體熒光探針與促紅細胞生成素結(jié)合時，促紅細胞生成素誘導(dǎo)其發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，核酸適體5'和3'兩端的芘分子單體相互靠近，形成激發(fā)態(tài)二聚體，熒光激發(fā)后激發(fā)態(tài)二聚體發(fā)射波長在 480 到 500nm之間。
以上所述的一種用基于核酸適體熒光探針的促紅細胞生成素試劑盒來檢測促紅細胞生成素濃度的方法，其特征在于，所述的血樣為肝素抗凝全血或末梢血，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細胞裂解液為含有1~280 mmol/L NH4Cl, 1~34 mmol/L Tris,1~2mmol/LEDTA-Na2, pH 7.0~7.2；所述含 MgCl2的0.2M磷酸緩沖液為含有1~10mmol/L MgCl2；所述熒光檢測儀為具有時間分辨熒光測定的熒光檢測儀。
以上所述的一種用基于核酸適體熒光探針的促紅細胞生成素試劑盒來檢測促紅細胞生成素濃度的方法，其特征在于，該檢測方法用于檢測肝素抗凝全血或末梢血中的促紅細胞生成素濃度。
本發(fā)明的原理是：在不與促紅細胞生成素時，核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)，5' 和3' 兩端的芘分子單體相互游離, 熒光發(fā)射波長在 370 到 400nm 之間；與促紅細胞生成素結(jié)合時，促紅細胞生成素誘導(dǎo)核酸適體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，核酸適體的5' 和3'兩端的芘分子單體相互靠近，形成二聚體，芘激發(fā)態(tài)發(fā)射波長二聚體在 480 到 500nm之間。芘激發(fā)態(tài)二聚體熒光壽命有著長達100 ns，比生物樣品自發(fā)熒光壽命（約為5 ns）長，通過檢測促紅細胞生成素核酸適體探針和樣品混合后的熒光強度和熒光壽命，計算樣品中促紅細胞生成素的濃度。
本發(fā)明的實質(zhì)性特點和顯著進步是：
（1）檢測操作簡單快速，無需復(fù)雜樣品加工和分離，將核酸適體探針直接加入裂解后的血樣液，用熒光分光光度計短時間內(nèi)就可以檢測480~500nm處的熒光值；
（2）本試劑盒及其檢測方法具有靈敏度高，檢測結(jié)果重復(fù)性高，樣品檢測誤差在0.01~0.1%之間，特異性強，促紅細胞生成素核酸適體熒光探針不與促紅細胞生成素結(jié)合時，核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)，5'和3'兩端的芘分子單體相互游離, 熒光激發(fā)后發(fā)射波長在 370~ 400nm 之間；其與促紅細胞生成素結(jié)合時，促紅細胞生成素誘導(dǎo)其發(fā)生改變，核酸適體5'和3'兩端的芘分子單體相互靠近，形成二聚體，熒光激發(fā)后二聚體發(fā)射波長在 480~ 500nm之間。
（3）所用的試劑可以使配制好可直接使用的液體試劑或是使用前加水溶解后使用的干粉狀態(tài)，檢測試劑可以常溫貯存，運輸方便。
具體實施方式
以下結(jié)合表1和實施例描述本發(fā)明基于核酸適體熒光探針的促紅細胞生成素EPO試劑盒及其檢測方法。
表1.實施例中的試劑盒試劑成分組成
實施例1
按照表1中實施例1所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將肝素抗凝全血、紅細胞裂解液按體積比1:0.5混勻，靜置30min，再中速離心7min，收集上清；
（2）混合卵育：取20μl步驟1）得到的上清和45ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解促紅細胞生成素核酸適體熒光探針得到的促紅細胞生成素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育5min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照促紅細胞生成素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中促紅細胞生成素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.05±0.01%。
實施例2
按照表1中實施例2所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將末梢血、紅細胞裂解液按體積比1:2.5混勻，靜置5min，再中速離心6min，收集上清；
（2）混合卵育：取50μl步驟1）得到的上清和30ul的
用0.2M磷酸緩沖液溶解促紅細胞生成素核酸適體熒光探針得到的促紅細胞生成素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育6min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照促紅細胞生成素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中促紅細胞生成素的濃度。樣品的3個平行測定誤差為0.02±0.01%。
實施例3
按照表1中實施例3所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將末梢血、紅細胞裂解液按體積比1:3.5混勻，靜置10min，再中速離心5min，收集上清；
（2）混合卵育：取75μl步驟1）得到的上清和45ul的
用0.2M磷酸緩沖液溶解促紅細胞生成素核酸適體熒光探針得到的促紅細胞生成素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育7min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照促紅細胞生成素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中促紅細胞生成素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.04±0.01%。
實施例4
按照表1中實施例4所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將肝素抗凝全血、紅細胞裂解液按體積比1:0.5混勻，靜置25min，再中速離心8min，收集上清；
（2）混合卵育：取100μl步驟1）得到的上清和50ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解促紅細胞生成素核酸適體熒光探針得到的促紅細胞生成素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育8min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照促紅細胞生成素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中促紅細胞生成素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.06±0.01%。
實施例5
按照表1中實施例5所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將肝素抗凝全血、紅細胞裂解液按體積比1:1.0混勻，靜置20min，再中速離心9min，收集上清；
（2）混合卵育：取80μl步驟1）得到的上清和30ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解促紅細胞生成素核酸適體熒光探針得到的促紅細胞生成素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育9min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照促紅細胞生成素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中促紅細胞生成素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.07±0.01%。
實施例6
按照表1中實施例6所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將肝素抗凝全血、紅細胞裂解液按體積比1:4.5混勻，靜置15min，再中速離心10min，收集上清；
（2）混合卵育：取30μl步驟1）得到的上清和40ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解促紅細胞生成素核酸適體熒光探針得到的促紅細胞生成素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育10min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照促紅細胞生成素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中促紅細胞生成素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.08±0.01%。
實施例7
按照表1中實施例7所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將末梢血、紅細胞裂解液按體積比1:3.0混勻，靜置18min，再中速離心8min，收集上清；
（2）混合卵育：取50μl步驟1）得到的上清和20ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解促紅細胞生成素核酸適體熒光探針得到的促紅細胞生成素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育12min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照促紅細胞生成素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中促紅細胞生成素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.1±0.01%。
實施例8
按照表1中實施例8所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將末梢血、紅細胞裂解液按體積比1:2.0混勻，靜置26min，再中速離心6min，收集上清；
（2）混合卵育：取60μl步驟1）得到的上清和25ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解促紅細胞生成素核酸適體熒光探針得到的促紅細胞生成素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育13min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照促紅細胞生成素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中促紅細胞生成素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.02±0.01%。
實施例9
按照表1中實施例9所需試劑成分溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入超純水，復(fù)溶后使用。每個樣品設(shè)定3個平行，檢測步驟如下：
（1）血樣裂解：將末梢血、紅細胞裂解液按體積比1:4.0混勻，靜置8min，再中速離心7min，收集上清；
（2）混合卵育：取40μl步驟1）得到的上清和35ul的用0.2M磷酸緩沖液溶解促紅細胞生成素核酸適體熒光探針得到的促紅細胞生成素核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育15min，得到測試液；
（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；
（4）結(jié)果計算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照促紅細胞生成素標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計算出血樣中促紅細胞生成素的濃度。
樣品的3個平行測定誤差為0.01±0.01%。
序列表
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