本發(fā)明涉及一種阿爾茲海默綜合癥標(biāo)志物ABCA7檢測試劑盒和制備方法，本發(fā)明屬于醫(yī)療產(chǎn)品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默綜合癥（AD）是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD是老年期最常見疾病之一，世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)全球65歲以上老年人群AD的患病率為4%~7%。AD患病率與年齡密切相關(guān)，年齡平均每增加6.1歲，患病率升高1倍；在85歲以上老年人群中，AD患病率可高達(dá)20%~30%。2001年全球AD患者超過2000萬，估計(jì)到2040年，全球AD患者將超過8000萬。自1999年，中國開始進(jìn)入老齡化社會，與之相對應(yīng)的，目前中國老年人群AD患病人口已經(jīng)超過600萬，預(yù)計(jì)到2050年患病人口將超過2000萬，是世界上AD患病人口最多、增長速度最快的國家。AD是造成老年人失去日常生活能力的最常見疾病，也是導(dǎo)致老年人死亡的第5位病因。AD不僅給患者帶來巨大的痛苦，還給家庭和社會帶來了沉重的精神壓力和醫(yī)療、照料負(fù)擔(dān)。因此，AD已成為影響全球公共健康和社會可持續(xù)發(fā)展的重大問題。盡管世界各國對AD治療藥物的研發(fā)投入了大量人力物力，仍未能研發(fā)出延緩或阻止AD進(jìn)展的藥物。因此早期診斷治療是防治AD的關(guān)鍵時期。
目前阿爾茲海默綜合癥臨床常用的診斷方法有：1、神經(jīng)影像學(xué)檢查、腦電圖：如計(jì)算海馬區(qū)神經(jīng)原纖維纏結(jié)和老年斑數(shù)，與臨床診斷的符合率可達(dá)81%～88%。由于正常老年人也有一定數(shù)量的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和老年斑，且有同樣的分布，準(zhǔn)確率較低，且耗時費(fèi)用高；2、神經(jīng)心理學(xué)測驗(yàn)：神經(jīng)心理學(xué)測驗(yàn)是在現(xiàn)代心理測驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的用于腦功能評估的一類心理測驗(yàn)方法。因個體差異較大，準(zhǔn)確率較差。對于早期患者，檢出率并不理想；3、基因檢測：通過檢測阿爾茲海默綜合標(biāo)志性因子，如淀粉樣蛋白前體蛋白基因（APP）、早老素1、2基因（PS1、PS2）等，有簡便、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，但需要相應(yīng)的檢測設(shè)備，技術(shù)要求高，費(fèi)用高，難以推廣。4、血液學(xué)檢查、腦脊液檢測：主要用于檢測阿爾茲海默綜合癥特異性蛋白，發(fā)現(xiàn)存在的伴隨疾病或并發(fā)癥、發(fā)現(xiàn)潛在的危險因素。目前常用ELISA免疫診斷技術(shù)檢測血清中或腦脊液特異性蛋白，具有常規(guī)程序冗長費(fèi)時、不易于推廣、靈敏度低等。因此尋找一種快速、方便攜帶、操作簡單、靈敏度高，對阿爾茲海默綜合癥的診斷和方法學(xué)建立具有十分重要的意義。
人類ABCA7基因位于19p13.3，總長度約24kb，包含46個外顯子，編碼三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATP binding cassette transporter, ABC）[1]。ABC是廣泛分布于真核生物和原核生物中的一個蛋白超家族，大多數(shù)ABC蛋白整合于細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜上，主要負(fù)責(zé)物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其在膽固醇的逆轉(zhuǎn)中起重要作用[2]。ABCA7首次被識別是在人巨噬細(xì)胞中[3]。人的ABCA7蛋白是一個由2146個氨基酸構(gòu)成的分子質(zhì)量為235kDa的轉(zhuǎn)運(yùn)體，是全分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包含具有2個高度保守的細(xì)胞漿ATP結(jié)合盒和2個跨膜結(jié)構(gòu)域[1]。ABCA7主要表達(dá)于外周淋巴細(xì)胞、胸腺、脾臟、骨髓等。Langmann等[4]通過蛋白印跡及反轉(zhuǎn)錄-PCR分析證實(shí)ABCA7在人腦中也有較高表達(dá)。Kim等[5]在成年大鼠的原位雜交試驗(yàn)揭示ABCA7在腦組織中表達(dá)量高，尤其是在海馬CA1區(qū)神經(jīng)元。2006年Kim研究發(fā)現(xiàn)，ABCA7 mRNA在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)是神經(jīng)元中的10倍[6]。不少研究報道，ABCA7在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是高表達(dá)的。
奧地利Ullrich等[7]在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高膽固醇血癥可增加AB肽段（1~40）的產(chǎn)生和tau蛋白的磷酸化，并對膽堿能神經(jīng)元的數(shù)量和功能以及學(xué)習(xí)記憶能力造成影響。最近，Woojins．Kim等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在AD大鼠模型中敲除ABCA7基因，腦內(nèi)海馬區(qū)Aβ斑塊沉淀增加了53%。Hughes等[9]研究證明通過PET成像發(fā)現(xiàn)ABCA7rs3764650多態(tài)性與Ａβ斑塊顯著相關(guān)。相關(guān)學(xué)者也證實(shí)了[10-13]ABCA7rs3764650的多態(tài)性與AD的發(fā)生相關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)，還存在3個位點(diǎn)多態(tài)性，包括rs11550680 [14]、rs3752246 [15]，rs4147929 [16]。
Karch等[17]研究顯示，ABCA7rs3764650最小基因C與AD發(fā)病年齡和疾病的進(jìn)程有關(guān)，ABCA7表達(dá)水平與癡呆的嚴(yán)重程度相關(guān)，并且ABCA7表達(dá)越高認(rèn)知的缺失程度越嚴(yán)重。也有研究證實(shí)，ABCA7rs3764650與APOEε4在語言學(xué)習(xí)及記憶、工作記憶、瞬時記憶三個認(rèn)知方面有顯著的相互作用關(guān)系[18]。
綜上所述，ABCA7作為一種膜整合蛋白能夠調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膜膽固醇的含量與分布，這些都是維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇的穩(wěn)態(tài)所必要的，而膽固醇又可調(diào)節(jié)Aβ的形成。ABCA7亦可調(diào)節(jié)APP的進(jìn)程及抑制毒性Aβ斑塊的形成。因此ABCA7的發(fā)現(xiàn)對AD發(fā)病機(jī)制的探索、藥物及其他干預(yù)治療的研究具有重要意義。目前，關(guān)于ABCA7試劑盒研究尚未有報道。本文通過建立ABCA7干式免疫熒光定量法檢測試劑盒，用于阿爾茨海默綜合癥的早期診斷。
熒光微球納米顆粒在標(biāo)志物檢測領(lǐng)域具有巨大潛能。它具有以下特點(diǎn)：1、靈敏度高：不受外界的背景干擾；2、穩(wěn)定性高：避免了樣本腐蝕或自身衰變引發(fā)的淬滅現(xiàn)象；3、靈活性高：可以組合多樣化光譜；4、安全性高：對于檢測者、檢測樣品和環(huán)境都沒有危害；5、方便簡易：可對樣品直接進(jìn)行檢測，無需特殊處理；6、以上特點(diǎn)決定其在生物標(biāo)記物方面應(yīng)用前景較廣闊，尤其是在床旁檢測領(lǐng)域。通過熒光微球納米顆粒標(biāo)記鼠抗人ABCA7單克隆抗體，建立一種阿爾茲海默綜合癥標(biāo)志物ABCA7檢測試劑盒和制備方法在臨床檢測領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對以上存在的問題，本發(fā)明提供了一種阿爾茲海默綜合癥標(biāo)志物ABCA7檢測試劑盒和制備方法。本發(fā)明的特點(diǎn)是：結(jié)合干式免疫熒光法檢測人ABCA7，通過特異性單抗與樣本中ABCA7抗原形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，其準(zhǔn)確性和特異性更高；利用干式免疫熒光法測定，其背景值低，測量便捷、準(zhǔn)確、操作簡單。
本發(fā)明的目的是提供一種阿爾茲海默綜合癥標(biāo)志物ABCA7檢測試劑盒和制備方法。
本發(fā)明試劑盒包括PVC底板、熒光結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、樣品墊和吸水墊；所述樣品墊、硝酸纖維素膜、熒光結(jié)合墊、吸水墊按水平方向固定于PVC底板上。所述熒光結(jié)合墊上有包被的鼠抗人ABCA7單克隆抗體1-熒光微球納米顆粒復(fù)合物、雞IgY-熒光微球納米顆粒復(fù)合物；所述的硝酸纖維素膜上有鼠抗人ABCA7單克隆抗體2構(gòu)成的檢測線和兔抗雞IgY抗體構(gòu)成的質(zhì)控線；所述的納米顆粒徑為100~200nm。
本發(fā)明的技術(shù)方案為：
1）硝酸纖維素膜（NC膜）-PVC底板的制備：將硝酸纖維素膜切成25mm×300mm，貼在PVC底板上。將鼠抗人ABCA7單抗2在硝酸纖維素膜上劃線得到檢測線；將兔抗雞IgY在硝酸纖維素膜上劃線得到質(zhì)控線。然后將硝酸纖維素膜（NC膜）-PVC底板置于干燥箱干燥；
2）利用納米熒光微球顆粒標(biāo)記鼠抗人ABCA7單抗1和雞IgY，保存?zhèn)溆谩?/p>
3）結(jié)合墊的制備：將結(jié)合墊切成9mm×300mm細(xì)條，將鼠抗人ABCA7單克隆抗體1-熒光微球納米顆粒復(fù)合物、雞IgY-熒光微球納米顆粒復(fù)合物按照一定比例混合，均勻鋪在結(jié)合墊上，放入烘箱烤干。
4）樣品墊：將玻璃纖維膜切成17mm×300mm細(xì)條。
5）吸收墊：將吸水紙切成17mm×300mm細(xì)條。
7）組裝：將上述吸水墊、樣品墊、熒光結(jié)合墊依次貼在PVC底板上，將貼好的中間物用斬切機(jī)切成一定寬度的試劑條。
附圖說明
圖1干式免疫熒光檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為樣品墊；2為熒光結(jié)合墊；3為硝酸纖維素膜；4為吸水墊；5為PVC底板；6為樣本中目標(biāo)抗原；7為熒光微球標(biāo)記鼠抗人ABCA7單抗1；8為熒光微球標(biāo)記雞IgY；9為檢測線：鼠抗人ABCA7單抗2；10為質(zhì)控線：兔抗雞IgY。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 制備本發(fā)明的阿爾茲海默綜合癥ABCA7的干式免疫熒光試劑盒
本發(fā)明試劑盒包括PVC底板、熒光結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、樣品墊和吸水墊；所述樣品墊、硝酸纖維素膜、熒光結(jié)合墊、吸水墊按水平方向固定于PVC底板上。
一、硝酸纖維素膜（NC膜）-PVC底板的制備
1、劃膜：將硝酸纖維素酶切成25mm×300mm，貼在PVC底板上。將兔抗雞IgY用PBS稀釋到濃度為1mg/ml，作為C線包被液；將鼠抗人ABCA7單抗2用PBS稀釋到濃度為1mg/ml，作為T線。通過噴膜儀，將T線包被液和C線包被液在硝酸纖維素膜上劃線得到檢測線和質(zhì)控線，37度烤干，即可得到單克隆抗體包被測試條。
二、結(jié)合墊的制備
1、標(biāo)記抗體：納米熒光微球顆粒與鼠抗人ABCA7單抗偶聯(lián)方法是通過納米熒光微球上的醛基與抗體蛋白上的氨基在弱堿環(huán)境下通過希夫氏堿基縮合，形成納米熒光微球-CH-NH2-ABCA7抗體復(fù)合物；同樣方式形成納米熒光微球-CH-NH2-雞IgY抗體復(fù)合物。熒光微球納米顆粒與鼠抗人ABCA7單抗或雞IgY按照1:1（ul：ug）混合反應(yīng)2h，制備得到鼠抗人ABCA7單克隆抗體1-熒光微球納米復(fù)合物或雞IgY-熒光微球納米顆粒復(fù)合物。
2、結(jié)合墊的制備：將結(jié)合墊切成9mm×300mm細(xì)條，將鼠抗人ABCA7單克隆抗體1-熒光微球納米顆粒復(fù)合物或雞IgY-熒光微球納米顆粒復(fù)合物按照一定比例混合均勻鋪在結(jié)合墊上，放入烘箱37度下烘烤2h。
三、其他輔材制備
1、將玻璃纖維膜切成17mm×300mm細(xì)條。
2、吸收墊：將吸水紙切成17mm×300mm細(xì)條。
四、組裝
組裝試紙條：將硝酸纖維素膜、吸水紙、熒光結(jié)合墊、樣品墊依次粘貼到PVC底板上，用斬切機(jī)切成一定寬度的試劑條。
實(shí)施例2 本發(fā)明試劑盒的使用方法
1、用移液器移取50ul血清、血漿、腦脊液樣本加到試紙條的加樣墊上；
2、室溫靜置10min；
3、10min結(jié)束，將試紙條放入免疫熒光定量分析儀中讀取數(shù)據(jù)；
4、免疫熒光定量分析儀對光學(xué)信號進(jìn)行測量和分析處理，定量得出被測物質(zhì)的濃度；
5、依據(jù)參考值判定陰陽性。
實(shí)施例3 本發(fā)明試劑盒與ELISA 試劑盒比較
本發(fā)明的試劑盒與ELISA 試劑盒同時檢測臨床確診的阿爾茲海默綜合癥患者血清154例，腦脊液樣本27例，正常人對照血清163 例，檢測結(jié)果見下表1：
表1 本發(fā)明的試劑盒與ELISA 試劑盒檢測結(jié)果
從表1可以看出，本發(fā)明的試劑盒對阿爾茲海默綜合癥患者的陽性檢出率明顯高于ELISA試劑盒，對正常人血清檢測均為陰性，可見本發(fā)明的試劑盒比ELISA試劑盒更敏感、特異、準(zhǔn)確。說明本發(fā)明試劑盒具有更高的臨床符合率，可為目前阿爾茲海默綜合癥的檢測提供更準(zhǔn)確、可靠的價值。
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