本發(fā)明涉及一種檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法與應用，其特別適于動物組織中呋喃唑酮代謝物殘留的檢測，屬于免疫學技術領域和獸藥殘留分析技術領域。

背景技術：

呋喃唑酮(Furazolidone，F(xiàn)ZD)，又名痢特靈，是一種硝基呋喃類藥物，對常見的革蘭氏陰性菌和陽性菌有抑制作用，作用于微生物酶系統(tǒng)，抑制乙酰輔酶A，干擾微生物糖代謝，從而起到抑菌作用。廣泛用于水產(chǎn)和禽類，用以治療菌痢、腸炎、球蟲等，以及養(yǎng)殖魚的疥瘡、赤鰭病、潰瘍等。因其殺菌能力強，抗菌譜廣，不易產(chǎn)生耐藥性，口服吸收迅速，與其他抗生素無交叉耐藥性等優(yōu)點，曾廣泛應用于臨床。呋喃唑酮具有很強的副作用，而且在動物體內(nèi)很快就代謝為3-氨基-2-唑烷酮(AOZ)，AOZ在胃酸條件下直接代謝成為具有強烈致突變性和致癌性的β-羥乙基肼，對人體健康與生態(tài)平衡具有潛在威脅。目前，歐盟、美國、日本、中國等規(guī)定禁止在食用動物中使用硝基呋喃類抗生素，我國農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)牧發(fā)[2002]1號文件規(guī)定食品性動物中呋喃唑酮的檢出限為不得檢出。

目前有關呋喃唑酮殘留的檢測技術主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜聯(lián)用法(LC-MS)、液相色譜串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)及免疫分析技術，前三種方法靈敏、準確，但操作繁瑣，對實驗設備和技術要求較高，不適合大批量樣品的快速檢測。免疫分析方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和膠體金免疫層析法(GICA)，具有靈敏度高、特異性好、成本低、操作方便等特點，適于大批量樣品篩選。開發(fā)呋喃唑酮代謝物免疫分析方法有助于AOZ殘留快速、準確的檢測，有效遏制其在水產(chǎn)品中的違規(guī)使用及殘留超標問題，提高人民群眾水產(chǎn)品餐桌質量安全水平。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術之缺陷提供一種檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，該酶聯(lián)免疫試劑盒具有靈敏度、精密度、準確度高，交叉反應率高，穩(wěn)定性好儲存時間長，操作簡單，快速，適合大批量樣品初篩的優(yōu)點。此外，本發(fā)明進一步提供該檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法與應用。

本發(fā)明所述技術問題是由以下技術方案實現(xiàn)的。

一種檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，該酶聯(lián)免疫試劑盒由包被有呋喃唑酮代謝物抗原的酶標板、抗呋喃唑酮代謝物單克隆抗體、酶標記物、呋喃唑酮代謝物標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、樣本復溶液組成。

上述酶聯(lián)免疫試劑盒，呋喃唑酮代謝物單克隆抗體為鼠源單克隆抗體，由CCTCC NO:C2016140的雜交瘤細胞株AOZ-4G3產(chǎn)生，該雜交瘤細胞株被命名為雜交瘤細胞株AOZ-4G3，于2016年7月31日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC NO:C2016140。

上述酶聯(lián)免疫試劑盒，所述呋喃唑酮代謝物單克隆抗體由呋喃唑酮代謝物抗原產(chǎn)生，該呋喃唑酮代謝物抗原為由呋喃唑酮代謝物與載體蛋白采用碳化二亞胺法合成的偶聯(lián)物，包括免疫原與檢測原；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、鼠血清白蛋白、免疫血清蛋白、甲狀腺蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或人血清白蛋白，免疫原優(yōu)選載體為牛血清白蛋白，檢測原優(yōu)選載體為卵清蛋白；所述酶標記物為酶標記抗原、酶標記抗體或酶標記抗抗體；所述酶標記物中的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。

上述酶聯(lián)免疫試劑盒，所述呋喃唑酮代謝物物單克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，優(yōu)選呋喃唑酮代謝物鼠源單克隆抗體；其由呋喃唑酮代謝物抗原免疫得到。

上述酶聯(lián)免疫試劑盒，所述酶標記抗抗體為酶標記羊抗鼠抗抗體，其采用碘酸鈉法將標記酶與山羊抗鼠抗抗體偶聯(lián)得到。

為了方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述酶聯(lián)免疫試劑盒還包括呋喃唑酮代謝物標準液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、樣本復溶液，且均以工作液形式提供。

上述酶聯(lián)免疫試劑盒，所述呋喃唑酮代謝物標準品溶液的濃度分別為0ug/L、0.1ug/L、0.3ug/L、0.9ug/L、2.7ug/L、8.1ug/L；所述底物顯色液由底物A和底物B組成，底物A為過氧化氫或過氧化脲，底物B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，底物A和底物B按體積比1：1混混合均勻；所述終止液為1-2mol/L的硫酸溶液；所述濃縮洗液為含有1％吐溫-20的0.2mol/LPH7.4的磷酸緩沖液；所述樣本復溶液為含有0.1-5％脫脂奶粉的0.02mol/L PH7.4的磷酸緩沖液。

本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫試劑盒制備方法，包括如下步驟：

(1)制備呋喃唑酮代謝物抗原工作液：

(a)呋喃唑酮代謝物衍生化：取0.25g AOZ，用2mL左右的甲醇于室溫下攪拌使之溶解；取0.15g 3-羧基苯甲醛，用2mL甲醇使之溶解，在攪拌下緩慢滴入上述AOZ溶液中，室溫下攪拌反應5h，過濾，烘干濾渣即得呋喃唑酮代謝物的衍生物CPAOZ；

(b)免疫原的合成：稱取50mg的牛血清白蛋白(BSA)溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L的PBS中，加入N,N-二甲基酰胺(DMF)1mL，攪拌溶解；再將步驟(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中，攪拌下加入二環(huán)己基亞胺(DCC)14mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)6mg，4℃下密封攪拌過夜，8000r/min離心15分鐘，收集上清液裝入透析袋中，4℃條件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d，每天換液3-4次，得CPAOZ-BSA溶液；

(c)檢測原的合成：稱取40mg的卵清蛋白(OVA)溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L PBS中，加入N,N-二甲基酰胺(DMF)1mL，攪拌溶解；再將步驟(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中，攪拌下加入二環(huán)己基亞胺(DCC)14mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)6mg，4℃下密封攪拌過夜，8000r/min離心15分鐘，收集上清液裝入透析袋中，4℃條件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d，每天換液3-4次，得CPAOZ-OVA溶液；

(2)制備包被有呋喃唑酮代謝物抗原的酶標板：

(a)用包被緩沖液將呋喃唑酮代謝物抗原溶液稀釋成0.25mg/ml，100ul/孔加入到酶標板孔內(nèi)；

(b)4℃過夜或37℃孵育2h，傾去孔中液體，洗滌液洗滌4-5次，拍干；

(c)加入含有10％小牛血清的封閉液緩沖液，200ul/孔，37℃孵育2h；

(d)傾去孔中液體，拍干，室溫在真空干燥箱中抽干5h，用鋁箔袋真空塑封，即得包被有呋喃唑酮抗原的酶標板；

其中，所述包被緩沖液為pH9.6的0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，封閉緩沖液為10％的小牛血清溶液；

(3)制備呋喃唑酮代謝物單克隆抗體工作液：

(a)動物免疫：選擇載體蛋白為牛血清白蛋白的免疫原，免疫6-8周齡的雌性Blab/c小鼠，間隔2周免疫1次，三次免疫后斷尾取血測定效價和抑制率，選擇結果最佳的小鼠準備融合；

(b)細胞融合：取步驟(a)選定的小鼠的脾細胞和小鼠骨髓瘤SP2/O細胞進行融合，間接ELISA法測定上清液選取陽性高的孔，通過有限稀釋法對陽性孔進行亞克隆，直至建立產(chǎn)生單一抗呋喃唑酮代謝物的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

(c)單克隆抗體的大量制備：選取個體較大的雌性Blab/c小鼠，采用體內(nèi)誘生腹水法，大量制備腹水，并通過辛酸-硫酸銨沉淀純化腹水，分成小管，-20℃保存，得呋喃唑酮代謝物單克隆抗體；

(d)單克隆抗體特性鑒定：對抗體的效價、親和力、亞型等特性進行鑒定。

(4)制備酶標記物濃縮工作液：

(a)羊抗鼠抗抗體的制備：以羊為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體；

(b)酶標記羊抗鼠抗抗體的制備：將辣根過氧化物酶與羊抗鼠抗抗體采用碘酸鈉法進行偶聯(lián)；

(5)組建用于檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括下述各組分：

(a)包被有呋喃唑酮代謝物抗原的酶標板；

(b)呋喃唑酮代謝物單克隆抗體工作液；

(c)酶標記物：辣根過氧化物酶-羊抗鼠抗抗體；

(d)呋喃唑酮代謝物標準品溶液：采用梯度稀釋法配制呋喃唑酮代謝物標準品溶液，1ml/瓶，濃度分別為0ug/L、0.1ug/L、0.3ug/L、0.9ug/L、2.7ug/L、8.1ug/L；

(e)底物顯色液A液為過氧化脲溶液，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液；

(f)終止液為1-2mol/L的硫酸溶液；

(g)濃縮洗滌液為含有1％吐溫-20的0.2mol/L PH7.4的磷酸鹽緩沖液；

(h)樣本復溶液為含有0.1-5％脫脂奶粉的0.02mol/L PH7.4的磷酸緩沖液。

上述酶聯(lián)免疫試劑盒在用于檢測動物組織、尿液和牛奶中呋喃唑酮代謝物中的應用。

上述酶聯(lián)免疫試劑盒在用于檢測動物組織、尿液和牛奶中呋喃唑酮代謝物中的應用，包括如下步驟：

(1)樣品前處理

(a)肉類、肝臟或水產(chǎn)品樣品的前處理

組織勻漿后，稱取2g于50ml離心管中，加入4mL去離子水，1mL 1mol/L鹽酸溶液，振蕩1min，再加入0.5mL對羧基苯甲醛，振蕩1min；取出后加入0.5mol/L磷酸氫二鈉溶液1mL，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7.5左右，振蕩1min，加入5mL乙酸乙酯，振蕩1min，5000rpm離心10min；移取上層乙酸乙酯層溶液于另一離心管中，水相再用5mL乙酸乙酯重復萃取兩次，合并后氮氣吹干；加入1ml正己烷，加蓋振蕩1min，然后加入0.5mL PBST緩沖液，振蕩1min，5000rpm離心10min；吸取下層水相溶液用于分析；

(b)尿樣前處理

將尿樣5000rpm離心5min至清亮，取上清50ul進行檢測；

(c)奶樣前處理

取奶樣2mL室溫條件下5000rpm離心10min，取下層溶液加入4mL去離子水，1mL 1mol/L鹽酸溶液，振蕩1min，再加入0.5mL對羧基苯甲醛，振蕩1min；取出后加入0.5mol/L磷酸氫二鈉溶液1mL，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7.5左右，振蕩1min，加入5mL乙酸乙酯，振蕩1min，5000rpm離心10min；移取上層乙酸乙酯層溶液于另一離心管中，水相再用5mL乙酸乙酯重復萃取兩次，合并后氮氣吹干；加入1ml正己烷，加蓋振蕩1min，然后加入0.5mL PBST緩沖液，振蕩1min，5000rpm離心10min；吸取下層水相溶液用于分析。

(2)使用試劑盒進行檢測

取出所述檢測呋喃唑酮代謝物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒，試劑恢復至室溫(20-25℃)，在室內(nèi)放置30min以上；按需要取出板條，放置在酶標板上；按需要的量將呋喃唑酮代謝物單克隆抗體工作液和酶標記物工作液按5:1比例混合；向孔內(nèi)依次加入標準品或待測樣品50ul、呋喃唑酮代謝物單克隆抗體工作液和酶標記物工作液的混合液50ul，輕輕振蕩混勻，25℃避光孵育30min；將孔內(nèi)液體甩干，將洗滌工作液用去離子水將20×濃縮洗滌液20倍稀釋后，250ul/孔，洗滌4次，拍干，；將顯色液A和顯色液B按體積比1:1比例混合，100ul/孔加入顯色，25℃避光孵育15min；加終止液50ul終止反應，酶標儀450nm下采用雙波長450nm/630nm測定，根據(jù)標準曲線進行定量或定性；

(3)分析檢測結果

(a)定量分析：分別計算標準品和待測樣本的平均吸光度值，標準品或待測樣本的吸光度值(B)除以0μg/L標準品的吸光度值(B₀)再乘以100％，即為百分吸光度值，百分吸光度值＝(B/B₀)×100％；以百分吸光度值為縱坐標，標準濃度的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線；將待測樣本的百分吸光度值代入標準曲線，即可求出對應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣本的實際殘留；

(b)定性分析：用待測樣本的平均吸光度值和標準品的吸光度值相比較，即可得出待測樣本的濃度范圍，測試范圍為0.1ug/ml-8.1ug/ml。

本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測原理為微孔條上包被有呋喃唑酮代謝物偶聯(lián)抗原，當加入待測樣本時，待測樣本中呋喃唑酮代謝物與預包被的偶聯(lián)抗原競爭呋喃唑酮代謝物特異性抗體，同時加入酶標物，顯色后終止，吸光度值與待測樣品中呋喃唑酮代謝物含量呈負相關。本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫試劑盒的曲線范圍在0.1-8.1ug/L范圍內(nèi)；組織中呋喃唑酮代謝物回收率分別為95.60±6.48、86.24±8.05、78.02±7.57，批內(nèi)變異系數(shù)均在9.82％以下，批間變異系數(shù)均在11.05％以下；尿液中呋喃唑酮代謝物回收率分別為96.66±6.29、84.05±6.69、83.76±7.93，批內(nèi)變異系數(shù)均在10.05％以下，批間變異系數(shù)均在11.32％以下；牛奶中呋喃唑酮代謝物回收率分別為81.28±6.38、77.72±6.42、85.36±5.76，批內(nèi)變異系數(shù)均在8.53％以下，批間變異系數(shù)均在8.90％以下，符合《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號文件中規(guī)定的試劑盒備案參考評判標準中的精密度和準確度規(guī)定。此外，通過測定呋喃唑酮代謝物類似物(呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物)及動物組織中常檢的其他藥物(氯霉素、四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類)等幾種藥物的交叉反應率，呋喃唑酮代謝物的交叉反應率為100.00％，與其它幾種相似物和常檢藥物無交叉反應；通過將酶聯(lián)免疫試劑盒放置在2℃-8℃保存12個月，期間每隔1個月檢測一次，測定試劑盒的IC50值、ODmax、回收率等各項參數(shù)，結果顯示各參數(shù)均在正常范圍內(nèi)，同時將試劑盒放置在37℃和-20℃放置6天，每天檢測一次，測定試劑盒的IC50％、ODmax、回收率等各項參數(shù)均在正常范圍之內(nèi)，因此，此試劑盒可以在2℃-8℃保存至少12個月。

附圖說明

圖1本發(fā)明所述呋喃唑酮代謝物單克隆抗體親和力測定圖

圖2本發(fā)明所述呋喃唑酮代謝物單克隆抗體亞型測定圖

圖3本發(fā)明所述酶聯(lián)免疫試劑盒的呋喃唑酮代謝物的標準曲線圖

本發(fā)明所述產(chǎn)生呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的雜交瘤細胞株AOZ-4G3，已于2016年7月31日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址：武漢大學，中國典型培養(yǎng)物保藏中心，郵編：430072)保藏，保藏號為CCTCC NO:C2016140。

具體實施方式

下面結合具體的實例來進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例一本發(fā)明所述呋喃唑酮代謝物抗原的制備

(1)呋喃唑酮代謝物衍生化：取0.25g AOZ，用2mL左右的甲醇于室溫下攪拌使之溶解；取0.15g 3-羧基苯甲醛，用2mL甲醇使之溶解，在攪拌下緩慢滴入上述AOZ溶液中，室溫下攪拌反應5h，過濾，烘干濾渣即得呋喃唑酮代謝物衍生物CPAOZ；

(2)免疫原的合成：稱取50mg的牛血清白蛋白(BSA)溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L的PBS中，加入N,N-二甲基酰胺(DMF)1mL，攪拌溶解；再將步驟(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中，攪拌下加入二環(huán)己基亞胺(DCC)14mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)6mg，4℃下密封攪拌過夜，8000r/min離心15分鐘，收集上清液裝入透析袋中，4℃條件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d，每天換液3-4次，得CPAOZ-BSA溶液；

(3)檢測原的合成：稱取40mg的卵清蛋白(OVA)溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L PBS中，加入N,N-二甲基酰胺(DMF)1mL，攪拌溶解；再將步驟(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中，攪拌下加入二環(huán)己基亞胺(DCC)14mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)6mg，4℃下密封攪拌過夜，8000r/min離心15分鐘，收集上清液裝入透析袋中，4℃條件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d，每天換液3-4次，得CPAOZ-OVA溶液。

實施例二本發(fā)明所述包被有呋喃唑酮代謝物抗原的酶標板的制備

用PH9.6的碳酸鹽緩沖液將呋喃唑酮代謝物藥物抗原稀釋成0.25mg/ml，100ul/孔加入到酶標板孔上，其中呋喃唑酮代謝物抗原包括免疫原、檢測原，免疫原牛血清白蛋白為載體，檢測原卵清蛋白為載體；4℃過夜或37℃孵育2h，洗滌4-5次，拍干；加入含有10％小牛血清的封閉緩沖液，200ul/孔，37℃孵育2h；室溫在真空干燥箱中抽干5h，用鋁箔袋真空塑封。

實施例三本發(fā)明所述呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的制備

(1)動物免疫：載體蛋白為牛血清白蛋白的免疫原免疫6-8周齡的雌性Blab/c小鼠，間隔2周免疫1次，三免后斷尾取血測定效價和抑制率，選擇結果最佳的小鼠準備融合；

(2)細胞融合：取小鼠的脾細胞和小鼠骨髓瘤SP2/O細胞，進行融合，間接ELISA法測定上清選取陽性高的孔，通過有限稀釋法對陽性孔進行亞克隆，直至建立產(chǎn)生單一抗呋喃唑酮代謝物的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

(3)單克隆抗體的大量制備：選取個體較大的雌性Blab/c小鼠，采用體內(nèi)誘生腹水法，大量制備腹水，并通過辛酸-硫酸銨沉淀純化腹水，分成小管，-20℃保存，得呋喃唑酮代謝物單克隆抗體。

實施例四本發(fā)明所述呋喃唑酮代謝物單克隆抗體特性鑒定

1、親和力測定

采用非競爭酶聯(lián)免疫法測定呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的親和常數(shù)，結果如圖1所示，親和常數(shù)Ka＝1.6×10⁹L/mol。

2、亞型測定

采用購自Sigma公司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒進行亞型測定，結果見圖2所示，呋喃唑酮代謝物單克隆抗體亞型為IgG1。

3、效價測定

以1：40000稀釋包被原包被檢測板，將純化后的單克隆抗體進行1:200，1:400，1:800，……1:800000稀釋，加入到酶標板孔內(nèi)，反應后加入HRP標記的羊抗鼠二抗，最后用TMB顯色，結果顯示純化后的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體濃度為1mg/ml時的效價達1：1024000。

實施例五本發(fā)明所述酶標記羊抗鼠抗抗體的制備

羊抗鼠抗抗體的制備：以羊為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體；

酶標記羊抗鼠抗抗體(酶標記抗抗體)的制備：將辣根過氧化物酶與羊抗鼠抗抗體采用碘酸鈉法進行偶聯(lián)。

實施例五本發(fā)明所述用于檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建

組建呋喃唑酮代謝物酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括下述各組分：

(1)包被有呋喃唑酮代謝物抗原的酶標板；

(2)呋喃唑酮代謝物單克隆抗體工作液；

(3)酶標記抗抗體：辣根過氧化物酶-羊抗鼠抗抗體；

(4)呋喃唑酮代謝物標準品溶液：采用梯度稀釋法配制呋喃唑酮代謝物標準品溶液，1ml/瓶，濃度分別為0ug/L、0.1ug/L、0.3ug/L、0.9ug/L、2.7ug/L、8.1ug/L；

(5)底物顯色液A液為過氧化脲溶液，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液；

(6)終止液為1-2mol/L的硫酸溶液；

(7)濃縮洗滌液為含有1％吐溫-20的0.2mol/L PH7.4的磷酸鹽緩沖液；

(8)樣本復溶液為含有0.1-5％脫脂奶粉的0.02mol/L PH7.4的磷酸緩沖液。

實施例六使用本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣本中呋喃唑酮代謝物

1、樣本的前處理

(1)肉類、肝臟或水產(chǎn)品樣品的前處理

組織勻漿后，稱取2g于50ml離心管中，加入4mL去離子水，1mL 1mol/L鹽酸溶液，振蕩1min，再加入0.5mL對羧基苯甲醛，振蕩1min；取出后加入0.5mol/L磷酸氫二鈉溶液1mL，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7.5左右，振蕩1min，加入5mL乙酸乙酯，振蕩1min，5000rpm離心10min；移取上層乙酸乙酯層溶液于另一離心管中，水相再用5mL乙酸乙酯重復萃取兩次，合并后氮氣吹干；加入1ml正己烷，加蓋振蕩1min，然后加入0.5mL PBST緩沖液，振蕩1min，5000rpm離心10min；吸取下層水相溶液用于分析；

(2)尿樣前處理

將尿樣5000rpm離心5min至清亮，取上清50ul進行檢測；

(3)奶樣前處理

取奶樣2mL室溫條件下5000rpm離心10min，取下層溶液加入4mL去離子水，1mL 1mol/L鹽酸溶液，振蕩1min，再加入0.5mL對羧基苯甲醛，振蕩1min；取出后加入0.5mol/L磷酸氫二鈉溶液1mL，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7.5左右，振蕩1min，加入5mL乙酸乙酯，振蕩1min，5000rpm離心10min；移取上層乙酸乙酯層溶液于另一離心管中，水相再用5mL乙酸乙酯重復萃取兩次，合并后氮氣吹干；加入1ml正己烷，加蓋振蕩1min，然后加入0.5mL PBST緩沖液，振蕩1min，5000rpm離心10min；吸取下層水相溶液用于分析；

2、檢測方法

(1)取出酶聯(lián)免疫試劑盒，試劑恢復至室溫(20-25℃)，至少在室內(nèi)放置30min；

(2)按需要取出板條，放置在酶標板上；

(3)按需要的量將呋喃唑酮代謝物單克隆抗體工作液和酶標記物工作液按5:1比例混合；

(4)向孔內(nèi)依次加入標準品(或待測樣品)50ul、呋喃唑酮代謝物單克隆抗體工作液和酶標記物工作液的混合液50ul，輕輕振蕩混勻，25℃避光孵育30min；

(5)將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液(用去離子水將20×濃縮洗滌液20倍稀釋)250ul/孔，洗滌4次，拍干；

(6)將顯色液A和顯色液B按1:1比例混合，100ul/孔加入顯色，25℃避光孵育15min；

(7)加終止液50ul終止反應，酶標儀450nm下測定(建議采用雙波長450/630測定)，根據(jù)標準曲線進行定量或定性。

3、檢測結果

((a)定量分析：分別計算標準品和待測樣本的平均吸光度值，標準品或待測樣本的吸光度值(B)除以0μg/L標準品的吸光度值(B₀)再乘以100％，即為百分吸光度值，百分吸光度值＝(B/B₀)×100％；以百分吸光度值為縱坐標，標準濃度的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線；將待測樣本的百分吸光度值代入標準曲線，即可求出對應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣本的實際殘留；

(2)定性分析：用待測樣本的平均吸光度值和標準品的吸光度值相比較，即可得出待測樣本的濃度范圍。

檢測結果也可以用專業(yè)的計算機軟件進行計算，測試范圍為0.1ug/ml-8.1ug/ml。

實施例七本發(fā)明所述酶聯(lián)免疫試劑盒靈敏度、特異性、精密度、準確度和保質期實驗

1、試劑盒靈敏度測定

靈敏度以最低檢測限(mg/kg或ug/kg)表示。分別測定20份蝦肉組織、豬尿和牛奶等空白樣品，及20份呋喃唑酮代謝物標準品。求(B/B₀)％值的平均值(X)和標準差(SD)，從標準曲線上求出X-2SD值對應的標準品濃度，作為各樣本的最低檢測限。

試劑盒的曲線范圍在0.1-8.1ug/L范圍內(nèi)(見圖3)，組織中呋喃唑酮代謝物檢測限為0.4ug/L，尿液中檢測限為0.3ug/L，牛奶中檢測限為0.3ug/L。

2、試劑盒準確度及精確度測定

準確度是指測定值與真實值間的符合程度，常用回收率表示；精密度是反應測定方法對某一特定樣本多次測定所得結果的重復程度，常用變異系數(shù)表示。從檢測合格的試劑盒中選取同一批次和不同批次的酶標板，在組織(蝦肉)、尿液和牛奶中添加終濃度為0.9ug/L、2.7ug/L、8.1ug/L的呋喃唑酮代謝物標準品根據(jù)以上所述的處理方法提取，同一批次、不同批次分別重復5次，測定批內(nèi)、批間變異系數(shù)及回收率。結果見表1、表2和表3。

表1組織(蝦肉)樣品批內(nèi)、批間變異系數(shù)及回收率測定

表1為蝦肉組織中呋喃唑酮代謝物添加回收率和變異系數(shù)。結果表明，在3個添加濃度下，對應的蝦肉組織中呋喃唑酮代謝物回收率分別為95.60±6.48、86.24±8.05、78.02±7.57，批內(nèi)變異系數(shù)均在9.82％以下，批間變異系數(shù)均在11.05％以下。

表2尿液樣品批內(nèi)、批間變異系數(shù)及回收率測定

表2為尿液中呋喃唑酮代謝物添加回收率和變異系數(shù)。結果表明，在3個添加濃度下，對應的尿液中呋喃唑酮代謝物回收率分別為96.66±6.29、84.05±6.69、83.76±7.93，批內(nèi)變異系數(shù)均在10.05％以下，批間變異系數(shù)均在11.32％以下。

表3牛奶樣品批內(nèi)、批間變異系數(shù)及回收率測定

表3為牛奶中呋喃唑酮代謝物添加回收率和變異系數(shù)。結果表明，在3個添加濃度下，對應的牛奶中呋喃唑酮代謝物回收率分別為81.28±6.38、77.72±6.42、85.36±5.76，批內(nèi)變異系數(shù)均在8.53％以下，批間變異系數(shù)均在8.90％以下。

綜上所述，針對組織(蝦肉)、尿液、牛奶的添加回收率實驗，回收率均在77％-86％之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均在15％以下，符合《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號文件中規(guī)定的試劑盒備案參考評判標準中的精密度和準確度規(guī)定。

3、交叉反應率測定

選擇如下所示呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物)及動物組織中常檢的其他藥物(氯霉素、四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類)等幾種藥物的交叉反應率，結果如表4所示。交叉反應率CR＝(呋喃唑酮代謝物的IC50/各結構類似物的IC50)×100℅。

表4試劑盒的交叉反應性

4、試劑盒保存期實驗

將試劑盒放置在2℃-8℃保存12個月，期間每隔1個月檢測一次，測定試劑盒的IC50值、ODmax、回收率等各項參數(shù)均在正常范圍內(nèi)。同時將試劑盒放置在37℃和-20℃放置6天，每天檢測一次，測定試劑盒的IC50％、ODmax、回收率等各項參數(shù)均在正常范圍之內(nèi)。

從以上結果看出，三種條件保存試驗，本試劑盒的各項指標均符合質量要求，因此，此試劑盒可以在2℃-8℃保存至少12個月。

上述實施例只為說明本發(fā)明的技術構思和優(yōu)點，本發(fā)明也可以具有其它的形式變化，如本領域技術人員所熟知，上述實施例僅僅起到對上述發(fā)明保護范圍內(nèi)的示范作用，對本領域普通技術人員來說，在本發(fā)明所限定的保護范圍內(nèi)還有很多常規(guī)變形和其它實施例，這些變形和實施例都將在本發(fā)明待批的保護范圍之內(nèi)。