本發(fā)明屬于材料及生物傳感器領(lǐng)域，具體的說涉及一種仿生納米薄膜的制備方法及用該薄膜固定探針的方法。

背景技術(shù)：

生物芯片是一種具有劃時(shí)代意義的微量分析技術(shù)，在越來越多的領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，生物芯片研制的第一步是要制備生物芯片載體，在此過程中，需要對(duì)載體表面進(jìn)行化學(xué)處理，使之能特異、快速、高效地固定各種探針。載體的品質(zhì)直接影響微陣列的性能，對(duì)芯片的制備至關(guān)重要，它直接影響探針與載玻片的結(jié)合強(qiáng)度與效率，進(jìn)而影響雜交結(jié)果的靈敏度與準(zhǔn)確性。目前、載體表面處理方法主要有物理吸附和化學(xué)偶聯(lián)（共價(jià)鏈接）兩大類，傳統(tǒng)的物理吸附方法操作簡單，但存在鏈接效率低、穩(wěn)定性差，容易發(fā)生非特異性吸附等缺點(diǎn)。化學(xué)偶聯(lián)方法（即在載體表面生長活性基團(tuán)，使載體表面的活性基團(tuán)通過共價(jià)交聯(lián)有效地固定探針），該方法連接穩(wěn)定，但是步驟繁瑣，采用的化學(xué)試劑毒性較高，空間位阻比較大，修飾表面改變生物分子的天然構(gòu)象等。目前，芯片表面化學(xué)都是針對(duì)某一種特定的生物分子，但是將不同性質(zhì)的生物分子同時(shí)組裝與同一載體表面尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，因此開發(fā)一種綠色環(huán)保、操作簡便、通用性強(qiáng)的表面修飾及固定方法成為研究的熱點(diǎn)之一。

近年來，隨著納米科學(xué)的發(fā)展和納米材料制備技術(shù)的不斷發(fā)展，納米材料以其獨(dú)特的物理化學(xué)特性而被廣泛的應(yīng)用于生物芯片的表面修飾，人們一直致力于尋找具有良好生物相容性的新型的修飾方法。

現(xiàn)有的修飾方法對(duì)材料的外形和尺寸要求較高，還需要復(fù)雜的預(yù)處理，使用的有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染，修飾過程復(fù)雜，一次修飾能固定一種探針分子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種操作簡單、經(jīng)濟(jì)高效、綠色環(huán)保的仿生納米薄膜的制備方法，以解決現(xiàn)有的修飾方法存在的對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染、修飾過程復(fù)雜的問題。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用該薄膜固定探針的方法。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：一種仿生納米薄膜的制備方法，由以下步驟組成：

A、載體的預(yù)處理：將光學(xué)載玻片用氨水洗液浸泡后用超純水沖洗，再浸泡在鹽酸溶液中，然后用超純水沖洗，N₂吹干；

B、多巴胺-鹽酸溶液配制：稱取多巴胺-鹽酸，完全溶解于Tirs-HCl緩沖液中配制成0.5-4 mg/毫升的多巴胺-鹽酸溶液；

C、將經(jīng)過預(yù)處理的載玻片加入到多巴胺-鹽酸溶液中，在50-70℃的恒溫水浴振蕩器振搖1-48h后，用高純水沖洗，N₂吹干。

優(yōu)選地，所述步驟A中氨水洗液由體積比為1∶1∶5的氨水和過氧化氫及水組成。

優(yōu)選地，所述步驟A中鹽酸溶液由體積比為1∶1∶5的鹽酸、過氧化氫和水組成。

優(yōu)選地，所述步驟B中多巴胺-鹽酸溶液配制過程為稱取多巴胺-鹽酸，完全溶解于pH值為8.5的Tirs-HCl緩沖液中配制成2mg/毫升的多巴胺-鹽酸溶液。

優(yōu)選地，所述步驟C中振搖時(shí)間為24h。

優(yōu)選地，所述步驟C中恒溫水浴的溫度為60℃，恒溫水浴振蕩器的速度為70 rpm。

用上述制得的薄膜固定探針的方法，探針為異硫氰酸熒光素5^，端修飾的20個(gè)氨基長度的單鏈DNA，將其鏈接到聚多巴胺修飾的載玻片上，具體方法如下：

A、碳酸鹽緩沖液的配制：將0.6g無水碳酸鈉與3.7g碳酸氫鈉分別溶于80 毫升去離子水中后，定容到100 毫升；

B、熒光探針溶液配制：取10 微克探針溶于1 毫升碳酸鹽緩沖液中配成10 微克/毫升的溶液；

C、探針的鏈接：將聚多巴胺修飾的玻片浸泡到熒光探針溶液中，于70 rpm的搖床振搖1-8h后，用去離子水沖洗，洗掉未結(jié)合的熒光探針。

優(yōu)選地，薄膜固定探針的方法，所述步驟C中搖床振搖時(shí)間為4h。

本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，避免了使用有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境造成的污染，且對(duì)材料表面的改性一步到位，操作步驟簡單，反應(yīng)條件與改性過程易于控制。

本發(fā)明主要通過多巴胺在堿性溶液中發(fā)生自聚合形成聚多巴胺薄膜的原理制備，該過程模擬海洋貽貝分泌的二羥基苯丙氨酸（DOPA），在海水中粘附的原理，該物質(zhì)可以使貽貝強(qiáng)力吸附在各種物體表面，且對(duì)材料的外形和尺寸沒有限制，整個(gè)過程在水溶液中完成;同時(shí)其強(qiáng)大的粘附能力可以對(duì)所有的有機(jī)和無機(jī)材料表面進(jìn)行修飾，具有通用性和普及性。因此經(jīng)濟(jì)高效、綠色環(huán)保、操作簡便，通過試驗(yàn)優(yōu)化制備條件，從而研制出能同時(shí)適合固定不同性質(zhì)生物分子的新方法。

聚多巴胺作為仿生材料，幾乎能在任何一種材料表面形成一層超強(qiáng)附著的復(fù)合納米薄膜，且對(duì)材料的外形和尺寸沒有限制，本申請(qǐng)首次將這種高生物親和性的仿生自聚合材料引入生物芯片表面修飾中，用以改善生物分子的固定化量、活性與穩(wěn)定性。

本發(fā)明仿生聚多巴胺納米薄膜修飾芯片表面，通過自聚-復(fù)合技術(shù)在芯片表面形成仿生納米薄膜，以薄膜表面的活性基團(tuán)固定生物分子。聚多巴胺納米薄膜表面含有豐富的活性基團(tuán)，水溶液中, 多巴胺發(fā)生氧化聚合-交聯(lián)反應(yīng)，材料表面復(fù)合的聚多巴胺層中含有豐富的鄰苯二酚基團(tuán)，堿性環(huán)境下,這些基團(tuán)很容易被氧化成醌式結(jié)構(gòu), 從而與含有硫醇(-SH) 、氨基(-NH₂)，或亞氨基(-NH )的DNA探針發(fā)生邁克爾加成( Michael addition)和席夫堿反應(yīng)( Schiff base reaction)，將生物分子引入材料表面，可滿足多種生物分子的固定要求，簡易實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片表面生物分子的固定化需求。

本發(fā)明形成的納米薄膜，主要由15-20nm納米顆粒構(gòu)成，該結(jié)構(gòu)具有更大的比表面積，能夠結(jié)合更多的熒光探針。同時(shí)，顆粒組成的薄膜結(jié)構(gòu)具有更低的空間位阻，提高熒光探針的固定效率及固定量，因此該方法優(yōu)于其他的固定方法。

上述仿生納米薄膜的制備中最佳條件為：多巴胺-鹽酸溶液的最佳濃度為2 mg/毫升，pH為8.5，浸泡時(shí)間為24 h（即浸泡時(shí)間為24h）。即實(shí)施例15的條件，經(jīng)過上述條件形成的納米薄膜，通過SEM對(duì)聚合后的納米薄膜進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)如圖1所示，圖1中A、B分別為樣品放大10000倍和放大50000倍的圖片，從圖1A中可以看出，樣品納米薄膜表面由的均勻、致密的顆粒構(gòu)成。當(dāng)放大到50000倍時(shí)，可以看到顆粒尺寸均一，顆粒粒徑尺寸為15-20 nm，未見團(tuán)聚現(xiàn)象（圖1B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用該生物仿生的方式能夠在基體的表面形成一層均勻、致密的薄膜，為后續(xù)熒光探針的固定搭建了很好的平臺(tái)。

進(jìn)一步通過紅外光譜分析聚多巴胺修飾玻片的化學(xué)鍵組成，圖2為多巴胺和聚合多巴胺的紅外光譜圖。由圖可知，多巴胺在3437cm-1出現(xiàn)峰，為羥基和氨基伸縮振動(dòng)峰。而聚合多巴胺在3343 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)尖峰，為氨基伸縮振動(dòng)峰，可能為聚合后聚合物中含有更多的氨基。二者在1609 cm-1處同時(shí)出現(xiàn)一個(gè)峰，為—NH2的彎曲振動(dòng)峰。同多巴胺相比，聚多巴胺在1504cm-1處出現(xiàn)一個(gè)新峰，為苯環(huán)振動(dòng)峰。以上結(jié)果表明多巴胺成功聚合為聚多巴胺。

聚多巴胺納米薄膜的制備條件的優(yōu)化，主要用來研究其對(duì)探針的固定效果。首先跟目前常用的固定方法（氨基修飾法和多聚賴氨酸修飾法）的對(duì)比圖見圖3，從熒光顯微鏡的光學(xué)照片上對(duì)比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過聚多巴胺修飾的玻片表面比未修飾的玻片、氨基修飾的玻片及多聚賴氨酸修飾的玻片表面出現(xiàn)更加致密的熒光亮點(diǎn)，能夠固定更多的熒光探針，且熒光探針的熒光強(qiáng)度高，熒光點(diǎn)分布更均勻。采用Image J軟件對(duì)上述四種方式的熒光亮點(diǎn)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表1，表1說明本發(fā)明修飾方法同傳統(tǒng)的修飾方法做對(duì)比，突出了聚多巴胺在芯片表面修飾的優(yōu)勢(shì)。

附圖說明

圖1 是實(shí)施例15的納米薄膜的掃描電鏡圖；

圖2是多巴胺和聚合多巴胺的紅外光譜圖；

圖3是實(shí)施例15固定探針的方法同傳統(tǒng)固定方法的對(duì)比圖；

圖4 是實(shí)施例1-4中不同多巴胺濃度對(duì)固定探針的影響效果的熒光顯微鏡照片圖；

圖5是實(shí)施例5-10中不同聚合時(shí)間對(duì)固定探針的影響效果的熒光顯微鏡照片圖；

圖6是實(shí)施例11-14中不同固定時(shí)間對(duì)固定探針的影響效果的熒光顯微鏡照片圖。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例可以進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

具體實(shí)施例分為兩步，第一步為仿生納米薄膜的制備，第二步為探針分子的固定，芯片表面修飾的目的就是為了固定各種分子探針，納米薄膜的制備的效果必須通過固定探針后的熒光點(diǎn)數(shù)效果來反應(yīng)。

實(shí)施例1、

1、芯片表面修飾有仿生納米薄膜的制備：

A、載體的預(yù)處理；25mm×25mm光學(xué)載玻片用氨水洗液(體積比為氨水∶過氧化氫∶水=1∶1∶5) 浸泡1h 后用超純水沖洗，再浸泡在鹽酸溶液(體積比為鹽酸∶過氧化氫∶水=1∶1∶5) 中1h 后用超純水沖洗，N₂吹干；

B、多巴胺-鹽酸溶液配制：準(zhǔn)確稱取0.5mg多巴胺-鹽酸，完全溶解于pH8.5的Tirs-HCl緩沖液中配制0.5 mg/毫升的多巴胺-鹽酸溶液；

C、將經(jīng)過預(yù)處理的載玻片加入到多巴胺-鹽酸溶液中，溫度（60℃），恒溫水浴振蕩器70 rpm 振搖24 h后，用高純水沖洗至面無多余聚多巴胺，N₂吹干。

2、熒光探針的固定方法：探針為異硫氰酸熒光素（FITC）5^，端修飾的20個(gè)氨基長度的DNA，將其鏈接到聚多巴胺修飾的玻片上的具體方法如下，

A、0.5M、pH 9.0碳酸鹽緩沖液的配制：將0.6g無水碳酸鈉與3.7g碳酸氫鈉分別溶于80 毫升去離子水中后，定容到100 毫升。

B、熒光探針溶液配制：取10微克熒光探針溶于1毫升碳酸鹽緩沖液中配成10 微克/毫升的溶液。

C、熒光探針的鏈接：將聚多巴胺修飾的玻片浸泡到熒光探針溶液中，于70rpm的搖床振搖4h后，用去離子水多次沖洗，洗掉未結(jié)合的熒光探針。

實(shí)施例2-4

實(shí)施例2-4步驟同實(shí)施例1，只改變步驟B中的多巴胺-鹽酸溶液的濃度，來探討最佳的多巴胺用量，熒光成像如圖4，采用Image J軟件對(duì)上述四種方式的熒光亮點(diǎn)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表2。當(dāng)多巴胺的濃度為0.5mg/毫升時(shí)，熒光點(diǎn)數(shù)量較少，且熒光發(fā)生團(tuán)聚。當(dāng)多巴胺的濃度為1 mg/毫升和2 mg/毫升時(shí)，熒光點(diǎn)數(shù)量多分布相對(duì)均一，然而1mg/毫升的熒光亮度低于2mg/毫升的熒光亮度。當(dāng)其濃度為4mg/毫升，形成大塊的不均勻的熒光亮點(diǎn)，對(duì)比后發(fā)現(xiàn)最優(yōu)的多巴胺濃度為2mg/毫升。

實(shí)施例5

1、仿生納米薄膜的制備：

A、載體的預(yù)處理25mm×25mm光學(xué)載玻片用氨水洗液(體積比為氨水∶過氧化氫∶水=1∶1∶5) 浸泡1h 后用超純水沖洗，再浸泡在鹽酸溶液(體積比為鹽酸∶過氧化氫∶水= 1∶1∶5) 中1h后用超純水沖洗，N₂吹干；

B、多巴胺-鹽酸溶液配制：準(zhǔn)確稱取2mg多巴胺-鹽酸，完全溶解于1毫升 0.1MpH8.5的Tirs-HCl緩沖液中配制2mg/毫升的多巴胺-鹽酸溶液；

C、將經(jīng)過預(yù)處理的載玻片加入到多巴胺-鹽酸溶液中，溫度（70℃），恒溫水浴振蕩器70rpm 振搖 1 h后，用高純水沖洗至面無多余聚多巴胺，N₂吹干。

2、熒光探針的固定方法：探針為異硫氰酸熒光素（FITC）5^，端修飾的20個(gè)氨基長度的DNA，將其鏈接到聚多巴胺修飾的玻片上的具體方法如下，

A、0.5M、pH 9.0碳酸鹽緩沖液的配制：將0.6g無水碳酸鈉與3.7g碳酸氫鈉分別溶于80 毫升去離子水中后，定容到100毫升；

B、熒光探針溶液配制：取10 微克 熒光探針溶于1 毫升碳酸鹽緩沖液中配成10 微克/毫升的溶液；

C、熒光探針的鏈接：將聚多巴胺修飾的玻片浸泡到熒光探針溶液中，于70rpm的搖床振搖4h后，用去離子水多次沖洗，洗掉未結(jié)合的熒光探針。

實(shí)施例6-10：實(shí)施例6-10的其他步驟同實(shí)施例5，只改變聚多巴胺納米薄膜制備中聚合時(shí)間的控制，熒光成像如圖5，采用Image J軟件對(duì)上述四種方式的熒光亮點(diǎn)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3。1h處理的玻片，未出現(xiàn)熒光。4h處理的玻片出現(xiàn)幾個(gè)亮點(diǎn)的熒光。當(dāng)時(shí)間延長到8h，熒光亮點(diǎn)比4h的多，但是仍然比12h的少很多。當(dāng)時(shí)間為48 h，其熒光強(qiáng)度和亮點(diǎn)數(shù)量同24 h的相當(dāng)，因此最佳的聚合時(shí)間為24h。

實(shí)施例11

1、仿生納米薄膜的制備：

A、載體的預(yù)處理25mm×25mm光學(xué)載玻片用氨水洗液(體積比為氨水∶過氧化氫∶水=1∶1∶5) 浸泡1h 后用超純水沖洗，再浸泡在鹽酸溶液(體積比為鹽酸∶過氧化氫∶水= 1∶1∶5) 中1h后用超純水沖洗，N₂吹干；

B、多巴胺-鹽酸溶液配制：準(zhǔn)確稱取2mg多巴胺-鹽酸，完全溶解于1毫升0.1MpH8.5的Tirs-HCl緩沖液中配制2%的多巴胺-鹽酸溶液；

C、將經(jīng)過預(yù)處理的載玻片加入到多巴胺-鹽酸溶液中，溫度（50℃），恒溫水浴振蕩器70rpm 振搖24h后，用高純水沖洗至面無多余聚多巴胺，N₂吹干。

2、熒光探針的固定方法：探針為異硫氰酸熒光素（FITC）5^，端修飾的20個(gè)氨基長度的單鏈DNA，將其鏈接到聚多巴胺修飾的玻片上的具體方法如下：

A、0.5 M、pH9.0碳酸鹽緩沖液的配制：將0.6g無水碳酸鈉與3.7g碳酸氫鈉分別溶于80 毫升去離子水中后，定容到100 毫升；

B、熒光探針溶液配制：取10微克熒光探針溶于1毫升碳酸鹽緩沖液中配成10微克/毫升的溶液；

C、熒光探針的鏈接：將聚多巴胺修飾的玻片浸泡到熒光探針溶液中，于70rpm的搖床振搖1h后，用去離子水多次沖洗，洗掉未結(jié)合的熒光探針。

實(shí)施例12-14：步驟同實(shí)施例11，只改變步驟C中的探針固定時(shí)間，熒光成像如圖6，采用Image J軟件對(duì)上述四種方式的熒光亮點(diǎn)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表4。

實(shí)施例11-14為探針固定條件的優(yōu)化，主要對(duì)探針固定時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，熒光成像觀察可知（圖6），1h固定時(shí)間，僅出現(xiàn)幾個(gè)熒光亮點(diǎn)，表明固定效果差。當(dāng)2h后，亮點(diǎn)數(shù)量有所增多，但是效果仍不甚理想。延長固定時(shí)間到4h后，在四個(gè)不同時(shí)間段，該時(shí)間點(diǎn)固定的熒光亮點(diǎn)數(shù)量最多，且亮點(diǎn)分布均勻，亮度最強(qiáng)。當(dāng)時(shí)間到8 h后，亮點(diǎn)數(shù)量減少，且強(qiáng)度低，部分顆粒團(tuán)聚變大，主要原因是由于形成的聚多巴胺薄膜在振搖過程中發(fā)生破裂，影響探針固定效果，因此最佳時(shí)間為4h。

實(shí)施例15、（本實(shí)施例為最佳實(shí)施例）。

1、仿生納米薄膜的制備：

A、載體的預(yù)處理：25mm×25mm光學(xué)載玻片用氨水洗液(體積比為氨水∶過氧化氫∶水=1∶1∶5) 浸泡1h 后用超純水沖洗，再浸泡在鹽酸溶液(體積比為鹽酸∶過氧化氫∶水= 1∶1∶5) 中1h 后用超純水沖洗，N₂吹干；

B、多巴胺-鹽酸溶液配制：準(zhǔn)確稱取2mg多巴胺-鹽酸，完全溶解于pH8.5的Tirs-HCl緩沖液中配制2mg/毫升的多巴胺-鹽酸溶液；

C、將經(jīng)過預(yù)處理的載玻片加入到多巴胺-鹽酸溶液中，溫度（60℃），恒溫水浴振蕩器70 rpm振搖24h后，用高純水沖洗至面無多余聚多巴胺，N₂吹干。

2、熒光探針的固定方法：探針為異硫氰酸熒光素（FITC）5^，端修飾的20個(gè)氨基長度的DNA，將其鏈接到聚多巴胺修飾的玻片上的具體方法如下：

A、0.5 M pH 9.0碳酸鹽緩沖液的配制：將0.6g無水碳酸鈉與3.7g碳酸氫鈉分別溶于80 毫升去離子水中后，定容到100 毫升。

B、熒光探針溶液配制：取10 微克 熒光探針溶于1 毫升碳酸鹽緩沖液中配成10 微克/毫升的溶液。

C、熒光探針的鏈接：將聚多巴胺修飾的玻片浸泡到熒光探針溶液中，于70rpm的搖床振搖1-8h后，用去離子水多次沖洗，洗掉未結(jié)合的熒光探針。