本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體地，涉及一種免疫層析試紙條的包被緩沖液及其制備方法。

背景技術(shù)：

在制備免疫層析試紙條的過(guò)程中，包被緩沖液用于包被抗體包被在硝酸纖維素膜上，能有效保護(hù)抗體的效價(jià)和減少抗體的非特異結(jié)合，提高免疫層析試紙條的穩(wěn)定性和分辨率。目前，在免疫層析試紙條的制備上，都是采用傳統(tǒng)的包被緩沖液將抗體包被在硝酸纖維素膜上，烘干后再用封閉液對(duì)包被膜進(jìn)行封閉。傳統(tǒng)的包被緩沖液的配方為：1％BSA，余量為0.025M、pH＝7.4的PBS。使用傳統(tǒng)的包被緩沖液存在以下缺陷：(1)抗體包被于硝酸纖維素膜后，需再配制封閉液對(duì)其進(jìn)行封閉，操作步驟繁瑣，增加成本，延長(zhǎng)生產(chǎn)時(shí)間。(2)抗體一經(jīng)包被固化后，抗體效價(jià)降低，反應(yīng)熒光信號(hào)大幅下降，從而使整個(gè)試劑的檢測(cè)靈敏度和精密度降低，有效期縮短。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種用于免疫層析試紙條的包被液；本發(fā)明所添加的BSA含量較傳統(tǒng)配方含量高，對(duì)硝酸纖維素膜起到一定程度的封閉作用；添加較高含量的蔗糖和一定量的海藻糖能夠保護(hù)抗體；有利于提高試劑測(cè)試的靈敏度和延長(zhǎng)試劑有效期。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是為了提供一種上述用于免疫層析試紙條的包被液的制備方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過(guò)采取如下技術(shù)方案達(dá)到：

一種用于免疫層析試紙條的包被液，包括如下按重量分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分：

優(yōu)選地，所述緩沖液為Tris-HCl緩沖液或者磷酸鹽緩沖液。

優(yōu)選地，所述緩沖液的濃度為10mM-50mM。

優(yōu)選地，所述緩沖液的pH值為7.0–7.4。

優(yōu)選地，所述的包被液包括如下按重量分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分：

所述磷酸鹽緩沖液的濃度為10mM-50mM，pH為7.0-7.4。

優(yōu)選地，所述的包被液包括如下按重量分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分：

所述磷酸鹽緩沖液的濃度為30mM，pH為7.2。

優(yōu)選地，所述的包被液包括如下按重量分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分：

所述磷酸鹽緩沖液的濃度為30mM，pH為7.4。

本發(fā)明還提供一種用于免疫層析試紙條的包被液的制備方法，包括如下步驟：

1)用純水配置緩沖液作為基礎(chǔ)液；

2)稱取配方量的BSA、海藻糖、蔗糖、NaN₃，溶于配方量的基礎(chǔ)液中，混勻，調(diào)節(jié)pH至7.0-7.4；

3)采用濾膜過(guò)濾除菌獲得包被液。

優(yōu)選地，步驟3)所述濾膜的過(guò)濾孔徑為0.22～0.25μm。

優(yōu)選地，步驟2)所述的pH為7.2；步驟3)所述的濾膜的孔徑為0.22μm。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明的包被緩沖液配方中，BSA含量較傳統(tǒng)配方含量高，對(duì)硝酸纖維素膜起到一定程度的封閉作用，節(jié)省了包被膜再封閉的步驟，可顯著降低抗體與樣品發(fā)生非特異反應(yīng)，從而有利于提高測(cè)試的精密度和靈敏度。

2、本發(fā)明的包被緩沖液加入了較高含量的蔗糖和一定量的海藻糖，能進(jìn)一步提高抗體耐熱能力，有保護(hù)包被抗體效價(jià)的作用，可顯著降低抗體包被后，效價(jià)和反應(yīng)熒光信號(hào)大幅下降的問(wèn)題，從而有利于提高試劑測(cè)試的靈敏度和延長(zhǎng)試劑有效期。

附圖說(shuō)明

圖1為用實(shí)施例1包被液制備的CRP定量檢測(cè)免疫層析試紙條的檢測(cè)結(jié)果。

圖2為用實(shí)施例2包被液制備的CRP定量檢測(cè)免疫層析試紙條的檢測(cè)結(jié)果。

圖3為用實(shí)施例3包被液制備的CRP定量檢測(cè)免疫層析試紙條的檢測(cè)結(jié)果。

圖4為用傳統(tǒng)技術(shù)的包被液制備的CRP定量檢測(cè)免疫層析試紙條的檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面，結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：

實(shí)施例1：

一種用于免疫層析試紙條的包被液，包括如下按重量分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分：

所述緩沖液為緩沖液為磷酸鹽緩沖液，濃度為10mM，pH為7.0。

所述的包被液由以下方法制備而成：

1)用純水配置緩沖液作為基礎(chǔ)液；

2)稱取配方量的BSA、海藻糖、蔗糖、NaN₃，溶于配方量的基礎(chǔ)液中，混勻，調(diào)節(jié)pH至7.0；

3)采用孔徑為0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌獲得包被液。

實(shí)施例2：

一種用于免疫層析試紙條的包被液，包括如下按重量分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分：

所述緩沖液為緩沖液為Tris-HCl緩沖液，濃度為50mM，pH為7.2。

所述的包被液由以下方法制備而成：

1)用純水配置緩沖液作為基礎(chǔ)液；

2)稱取配方量的BSA、海藻糖、蔗糖、NaN₃，溶于配方量的基礎(chǔ)液中，混勻，調(diào)節(jié)pH至7.2；

3)采用孔徑為0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌獲得包被液。

實(shí)施例3：

一種用于免疫層析試紙條的包被液，包括如下按重量分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分：

所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為30mM，pH為7.2。

所述的包被液由以下方法制備而成：

1)用純水配置緩沖液作為基礎(chǔ)液；

2)稱取配方量的BSA、海藻糖、蔗糖、NaN₃，溶于配方量的基礎(chǔ)液中，混勻，調(diào)節(jié)pH至7.2；

3)采用孔徑為0.23μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌獲得包被液。

實(shí)施例4：

一種用于免疫層析試紙條的包被液，包括如下按重量分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分：

所述緩沖液為緩沖液為磷酸鹽緩沖液，濃度為20mM，pH為7.2。

所述的包被液由以下方法制備而成：

1)用純水配置緩沖液作為基礎(chǔ)液；

2)稱取配方量的BSA、海藻糖、蔗糖、NaN₃，溶于配方量的基礎(chǔ)液中，混勻，調(diào)節(jié)pH至7.2；

3)采用孔徑為0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌獲得包被液。

實(shí)施例5：

一種用于免疫層析試紙條的包被液，包括如下按重量分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分：

所述緩沖液為緩沖液為磷酸鹽緩沖液，濃度為20mM，pH為7.4。

所述的包被液由以下方法制備而成：

1)用純水配置緩沖液作為基礎(chǔ)液；

2)稱取配方量的BSA、海藻糖、蔗糖、NaN₃，溶于配方量的基礎(chǔ)液中，混勻，調(diào)節(jié)pH至7.4；

3)采用孔徑為0.25μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌獲得包被液。

實(shí)施例6：

一種用于免疫層析試紙條的包被液，包括如下按重量分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分：

所述緩沖液為緩沖液為Tris-HCl緩沖液，濃度為50mM，pH為7.4。

所述的包被液由以下方法制備而成：

1)用純水配置緩沖液作為基礎(chǔ)液；

2)稱取配方量的BSA、海藻糖、蔗糖、NaN₃，溶于配方量的基礎(chǔ)液中，混勻，調(diào)節(jié)pH至7.4；

3)采用孔徑為0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌獲得包被液。

實(shí)施例7：

一種用于免疫層析試紙條的包被液，包括如下按重量分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分：

所述緩沖液為緩沖液為磷酸鹽緩沖液，濃度為30mM，pH為7.4。

所述的包被液由以下方法制備而成：

1)用純水配置緩沖液作為基礎(chǔ)液；

2)稱取配方量的BSA、海藻糖、蔗糖、NaN₃，溶于配方量的基礎(chǔ)液中，混勻，調(diào)節(jié)pH至7.4；

3)采用孔徑為0.25μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌獲得包被液。

對(duì)比例1

1％BSA，余量為0.025M、pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液。制得傳統(tǒng)技術(shù)的包被液。

本對(duì)比例所述的包被液由一下方法制得：

1)用純水配置磷酸鹽緩沖液作為基礎(chǔ)液；

2)稱取配方量的BSA溶于配方量的基礎(chǔ)液中，混勻，調(diào)節(jié)pH至7.4；

3)采用孔徑為0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌獲得包被液。

驗(yàn)證實(shí)施例

以CRP定量檢測(cè)免疫層析試紙條為例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的包被液與傳統(tǒng)技術(shù)的包被液靈敏度、精密度和穩(wěn)定性對(duì)比。所述CRP定量檢測(cè)免疫層析試紙條包括底襯及設(shè)在所述底襯上的包被膜，所述包被膜的兩端分別搭接有樣品墊和吸水紙，所述樣品墊上噴有熒光膠乳標(biāo)記CRP單克隆抗體和兔IgG抗體，包被膜上設(shè)置有包被線區(qū)，所述包被線區(qū)包括從靠近所述樣品墊端至靠近所述吸水紙端依次平行設(shè)置的包被羊抗兔IgG抗體的質(zhì)控線、包被能與待檢抗原CRP特異性結(jié)合的另一株CRP單克隆抗體的檢測(cè)線。

CRP定量檢測(cè)免疫層析試紙條的制備方法如下，包括以下步驟：

(1)、熒光膠乳的共價(jià)活化

超聲波處理膠乳微球體30秒后，調(diào)節(jié)膠乳微球體濃度為1.0×1012/ml，15000xg離心20分鐘，離心后收集沉淀物用蒸餾水或者100mMpH6.0磷酸鹽溶液溶解，并超聲波200W處理30秒；先加入30μl的100mg/mlEDC，震蕩混勻，再加入30μl的20mg/mlSμlfo-NHS，震蕩混勻；室溫孵育30分鐘后15000xg、離心20分鐘，沉淀用100mM、pH6.0的檸檬酸緩沖液溶解，放置在2～8℃條件下備用；

(2)、熒光膠乳微粒標(biāo)記蛋白的制備

將活化后的熒光膠乳超聲波200W處理30秒后，按照50μg標(biāo)記抗體/100μl熒光膠乳的比例加入兔IgG抗體、CRP單克隆抗體，混勻后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，離心洗滌3次，每次15000xg、離心20分鐘，沉淀用PBS-TBN溶解并超聲波100W處理30秒，用PBS-TBN恢復(fù)離心前體積，4℃保存，備用；

(3)、制備樣品墊

用標(biāo)記稀釋液稀釋標(biāo)記有CRP單克隆抗體的熒光膠乳標(biāo)記有兔IgG抗體的熒光膠乳，將這兩種標(biāo)記抗體的膠乳混合，噴于樣品墊上。熒光膠乳標(biāo)記的CRP單克隆抗體的濃度為0.5mg/ml，按20％的稀釋比，8μl/cm的用量噴在樣品墊上；熒光膠乳標(biāo)記的兔IgG抗體的濃度為0.5mg/ml，按2％的稀釋比，8μl/cm的用量噴在樣品墊上。

(4)、硝酸纖維素膜上質(zhì)控線和檢測(cè)線的制備

用包被緩沖液稀釋(實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3和傳統(tǒng)技術(shù)的包被液)羊抗兔IgG抗體以及能與待檢抗原特異結(jié)合的另一位點(diǎn)的單克隆抗體，并將稀釋后的兩種抗體分別依次平行地劃線于硝酸纖維素膜上，所述質(zhì)控線靠近樣品墊一端。質(zhì)控線包被的羊抗兔IgG抗體的濃度為1mg/ml，用量為20μl/27-35cm，CRP檢測(cè)線包被的CRP單克隆抗體的濃度為1mg/ml，用量為20μl/27-35cm。質(zhì)控線、CRP檢測(cè)線相互間隔4mm。將包被好的硝酸纖維素膜置于濕度<30％的50℃的烘箱，干燥72h后，于2℃～30℃密封干燥平衡7天以上封袋備用。

(5)、制備試紙條

在底襯上搭接粘貼包被膜，在包被膜靠近標(biāo)記線的一端搭接粘貼樣品墊，在包被膜另一端搭接粘貼吸水紙，得到試紙板，按照要求切割成適當(dāng)寬度的試紙條。

在本驗(yàn)證例中，試紙條的結(jié)構(gòu)及其它參數(shù)都是相同的，不同之處僅在于：抗體包被在試紙條上(即質(zhì)控線和檢測(cè)線制備)所使用的包被緩沖液不相同。

在相同的加樣量下，考察實(shí)施例3包被液與傳統(tǒng)技術(shù)的包被液對(duì)免疫層析試紙的靈敏度、精確度的影響。試驗(yàn)結(jié)果如下所示。

1.1靈敏度(最低檢測(cè)限)

以5％人血清白蛋白為空白樣本，用實(shí)施例3包被液制備的試紙條與用傳統(tǒng)包被液制備的試紙條進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)20次，結(jié)果為：

實(shí)施例3包被液制備的試紙條計(jì)算結(jié)果均值為0.02，標(biāo)準(zhǔn)差SD為0.036，用稀釋后濃度分別為0.10mg/L、0.25mg/L和0.5mg/LCRP標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)定,測(cè)定結(jié)果分別為0.098mg/L、0.253mg/L、0.498mg/L，因此實(shí)施例3包被液制備的試紙條檢測(cè)CRP靈敏度為0.10mg/L；

傳統(tǒng)包被液制備的試紙條計(jì)算結(jié)果均值為0.08，標(biāo)準(zhǔn)差SD為0.046，

用稀釋后濃度分別為0.10mg/L、0.25mg/L和0.5mg/L CRP標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)定,測(cè)定結(jié)果分別為0.2mg/L、0.246mg/L、0.501mg/L，因此傳統(tǒng)包被液制備的試紙條檢測(cè)CRP靈敏度為0.25mg/L。

2.2精密度

隨機(jī)抽取用實(shí)施例3包被液制備的試紙條10份，分別對(duì)濃度為10.0mg/L的CRP校準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果平均值為10.11，標(biāo)準(zhǔn)差SD為0.7258，變異系數(shù)為1.0％；

隨機(jī)抽取用傳統(tǒng)包被液制備的試紙條10份，分別對(duì)濃度為10.0mg/L的CRP校準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果平均值為10.24，標(biāo)準(zhǔn)差SD為0.9258，變異系數(shù)為3.5％；

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，用實(shí)施例3包被液制備的試紙條比用傳統(tǒng)包被液的制備的試紙條靈敏度、精密度都要高。

用CRP定量檢測(cè)免疫層析試紙條來(lái)比較本發(fā)明包被液制備的試紙條與傳統(tǒng)包被液制備的試紙條的有效期。

將組裝好的試紙條，按以下設(shè)計(jì)進(jìn)行加速破壞試驗(yàn)：

(1)對(duì)照：室溫保存。

(2)破壞組：50℃破壞(保存)1周(W)；50℃破壞2周(W)；50℃破壞3周(W)；50℃破壞周(W)。

對(duì)照與破壞組平行測(cè)定各濃度水平在各破壞條件下靈敏度、線性水平、線性范圍的一致性，觀察各條件下反應(yīng)曲線的重合度。

CRP定量檢測(cè)免疫層析試紙條的試驗(yàn)結(jié)果如圖1-4所示。

從圖1-3可以看出，采用實(shí)施例1-3包被液制備的試紙條，對(duì)照組和破壞組都有比較好的曲線重合度，其中以實(shí)施例3的最優(yōu)，實(shí)施例1和實(shí)施例2次之，從圖4可以看出，傳統(tǒng)的包被液制備的試紙?jiān)谄茐?W后，其T/C值已經(jīng)下降的很快，不能與對(duì)照線重合，因此，本發(fā)明的包被液與傳統(tǒng)包被液相比，具有更好的熱破壞穩(wěn)定性。

綜上所述，本發(fā)明的包被稀釋液與傳統(tǒng)稀釋液相比，操作簡(jiǎn)便、成本低、靈敏度高、精密度好，且熱穩(wěn)定性高，使試劑具有更長(zhǎng)的保質(zhì)期。

對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。