本發(fā)明屬于藥物評價與篩選的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種簡便、經(jīng)濟(jì)、高通量的斑馬魚鰾損傷炎癥模型的應(yīng)用，尤其是用該斑馬魚模型評價肺損傷治療劑功效與誘導(dǎo)劑毒性的方法。

背景技術(shù)：

急慢性肺疾病，特別是肺損傷、肺部炎癥、肺部腫瘤是嚴(yán)重危害人來健康的疾病之一。大氣細(xì)顆粒物(PM_2.5)、吸煙、放射、化療等物理化學(xué)因素是引起急慢性肺損傷和肺癌的危險(xiǎn)因素，其中PM_2.5/吸煙等原因引起的慢性阻塞性肺損傷是一種不完全可逆的、對有害顆粒和氣體產(chǎn)生異常炎癥應(yīng)答的、氣流限制性呼吸系統(tǒng)疾病，可增加肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)今成為發(fā)病率較高的疾病之一。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)報(bào)告指出，在全球范圍內(nèi)，空氣污染導(dǎo)致了5％的氣管癌、支氣管癌和肺癌的發(fā)生，2％的心肺死亡率，以及1％呼吸系統(tǒng)感染的死亡率，相當(dāng)于80萬人死亡和790萬人肺損傷。PM_2.5表面吸附了大量有毒有害物質(zhì)，可通過呼吸而沉積在肺泡，引起肺損傷。世界衛(wèi)生組織、美國環(huán)境保護(hù)署等諸多機(jī)構(gòu)已經(jīng)公布PM_2.5是對人體健康危害最大且代表性最強(qiáng)的大氣污染物。目前肺損傷的治療主要有：通氣供氧、選用抗生素、糖皮質(zhì)激素、外源性肺表面活性物質(zhì)、血管擴(kuò)張劑、相關(guān)酶等。但現(xiàn)有的肺損傷治療藥物存在著或療效不佳，或毒副作用較大或費(fèi)用高等問題，因此開發(fā)新的肺損傷治療藥物顯得非常必要^[1-2]。

藥物篩選是發(fā)現(xiàn)、開發(fā)藥物過程中一個重要的環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)肺損傷模型的建立對評價與篩選肺損傷治療藥物至關(guān)重要。目前肺損傷動物模型主要被用來研究肺損傷的機(jī)制，但這些動物模型大多數(shù)是根據(jù)已知的誘發(fā)肺損傷的危險(xiǎn)因子復(fù)制的，例如膿毒血癥、繼發(fā)于骨折的脂肪栓塞、吸入酸性物質(zhì)、肺或末端血管床的缺血-再灌注以及其他的臨床危險(xiǎn)因素，但所有這些模型都不可能完全充分復(fù)制人類肺損傷的特征。理想的肺損傷實(shí)驗(yàn)動物模型應(yīng)能夠復(fù)制人類肺損傷發(fā)生的機(jī)制和后果。但是目前為止沒有任何一個實(shí)驗(yàn)動物模型可以完全復(fù)制人類肺損傷的所有特征，大多肺損傷實(shí)驗(yàn)動物模型只是針對人類肺損傷的單個或少數(shù)幾個病理生理特征進(jìn)行復(fù)制，如換氣功能異常、肺順應(yīng)性下降、肺實(shí)質(zhì)損傷和肺泡毛細(xì)血管膜通透性增加等，并且這些動物模型均存在造模操作復(fù)雜、技術(shù)要求高、手術(shù)創(chuàng)傷大、肺損傷發(fā)生率低、并發(fā)癥和死亡率高、模型建立不穩(wěn)定、可重復(fù)性差等缺點(diǎn)^[3-4]，不利于后續(xù)肺損傷治療藥物的評價與篩選工作，且實(shí)驗(yàn)周期長、費(fèi)用高、工作量大。體外細(xì)胞模型缺少藥物在生物整體的代謝轉(zhuǎn)化和體內(nèi)的循環(huán)分布，不能反映藥物在體內(nèi)的真實(shí)情況。因此建立一種能很好的模擬藥物在體內(nèi)的過程，又能快速方便的評價與篩選肺損傷治療藥物的動物模型具有重要的應(yīng)用價值。

肺泡作為一個基本單元，對外界致病菌的攻擊更為敏感^[5]，細(xì)菌和病毒對肺泡感染以及進(jìn)入肺泡的污染空氣中的顆粒均可引起ALI/ARDS疾病^[6-8]，而肺泡被感染后，會引起中性粒細(xì)胞的聚集，隨后中性粒細(xì)胞會釋放顆粒蛋白或活性氧簇(ROS)等物質(zhì)^[9]，這些物質(zhì)會進(jìn)一步加快ALI/ARDS的進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，在動物急性肺損傷疾病模型中，通過干擾中性粒細(xì)胞趨化、遷移、粘附和細(xì)胞滲出等行為，可以緩解動物的病情進(jìn)展^[10-12]。目前對急性肺損傷的研究雖已有幾十年的歷史，但對于中性粒細(xì)胞在急性肺損傷進(jìn)程中浸潤的機(jī)理尚不明確，但在某種程度上，主要是因?yàn)閯游锬Ｐ蜔o法為研究者提供對肺泡中性粒細(xì)胞行為進(jìn)行動態(tài)觀察的便利條件^[13]。

斑馬魚是一種新穎的脊椎模式動物，與人類基因同源性高達(dá)85％，其信號傳導(dǎo)通路與人類基本近似，生物結(jié)構(gòu)和生理功能與哺乳動物高度相似，具有體積小(可用微孔板分析)、發(fā)育周期短、體外受精、透明(可直接用肉眼和解剖顯微鏡觀察)、單次產(chǎn)卵數(shù)較高等特點(diǎn)^[14]。斑馬魚模型既具有體外實(shí)驗(yàn)快速、高效、低廉、用藥量小等優(yōu)勢，又具有哺乳類動物實(shí)驗(yàn)預(yù)測性強(qiáng)、可比度高、可觀察多個器官等優(yōu)點(diǎn)，近年已在化合物藥效、毒性評價中得到廣泛應(yīng)用^[15,16]。

魚鰾作為魚類浮力調(diào)節(jié)的重要器官，已經(jīng)被大量的研究在解剖學(xué)^[20]、形態(tài)學(xué)^[21]和轉(zhuǎn)錄組學(xué)^[22]等不同水平證實(shí)同陸生動物的肺為同源器官。2013和2014年，Cass和Robertson等分別在斑馬魚鰾上檢測到了肺表面活性物質(zhì)^[21,23]；雖然已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，斑馬魚鰾可以應(yīng)用于一些人類疾病的基礎(chǔ)研究，比如2013年，Gratacap等人通過研究斑馬魚對鰾念珠菌感染魚鰾后的反應(yīng)，探究了白色念珠菌、上皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞三者之間的交互關(guān)系；2015年Voelz等人通過斑馬魚對毛霉菌孢子感染斑馬魚后腦室和鰾后的反應(yīng)，探索了毛霉菌孢子與機(jī)體免疫系統(tǒng)的交互作用；然而，迄今為止，用斑馬魚鰾作為動物模型開展肺疾病研究的相關(guān)文獻(xiàn)尚未見報(bào)道。故，目前評價肺損傷治療劑與誘導(dǎo)劑的方法，仍舊是基于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)動物模型(如鼠類、犬類等)，尚未見有基于斑馬魚鰾損傷炎癥模型進(jìn)行藥物評價的文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：提供一種斑馬魚鰾損傷炎癥模型的建立方法，同時提供一種利用該模型評價肺損傷治療劑與誘導(dǎo)劑功效的方法。本發(fā)明提供的方法具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效、高通量等優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

內(nèi)容一：一種斑馬魚鰾損傷炎癥模型的建立方法，包括如下步驟：

(1)斑馬魚最佳發(fā)育階段的確定

取4～5對中性粒細(xì)胞綠色熒光轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚(MPO)親本交配，按照Westerfield^[26]的方法孵化胚胎；選擇不同發(fā)育階段的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根據(jù)微孔板規(guī)格放入不同數(shù)量的斑馬魚；

根據(jù)不同的發(fā)育階段將對應(yīng)的微孔板均設(shè)為3個實(shí)驗(yàn)組：1個為誘導(dǎo)劑處理組，該組中對斑馬魚鰾腔注射單濃度的誘導(dǎo)劑；1個為溶劑處理組，該組中對斑馬魚鰾腔注射等體積的PBS；1個為空白對照組，該組中對斑馬魚不進(jìn)行任何處理；然后，各實(shí)驗(yàn)組均加入相同體積的養(yǎng)魚用水，在相同溫度下恒溫培養(yǎng)；

當(dāng)誘導(dǎo)劑處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，用立體熒光顯微鏡對斑馬魚鰾位置拍照并保存，對斑馬魚鰾位置聚集的中性粒細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行定性和定量評價，確定斑馬魚的最佳發(fā)育階段；

所述不同發(fā)育階段的斑馬魚為4.5～6dpf的斑馬魚；所述最佳發(fā)育階段的斑馬魚為5dpf的斑馬魚；

(2)誘導(dǎo)劑最佳給藥濃度的確定

取5dpf的斑馬魚移入微孔板；

設(shè)置空白對照組、溶劑注射組和不同給藥濃度的誘導(dǎo)劑處理組：空白對照組對斑馬魚不進(jìn)行任何處理，溶劑注射組對斑馬魚鰾腔注射PBS，誘導(dǎo)劑處理組對斑馬魚鰾腔分別注射等體積但不同給藥濃度的誘導(dǎo)劑；然后，各實(shí)驗(yàn)組均加入相同體積的養(yǎng)殖用水，在相同溫度下恒溫培養(yǎng)；

當(dāng)誘導(dǎo)劑處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，用立體熒光顯微鏡對斑馬魚鰾位置拍照并保存，對斑馬魚鰾位置聚集的中性粒細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行定性和定量評價，確定誘導(dǎo)劑的最佳給藥濃度；

所述誘導(dǎo)劑的給藥濃度為1～10mg/mL，所述誘導(dǎo)劑的最佳給藥濃度為10mg/mL；

(3)構(gòu)建斑馬魚鰾損傷炎癥模型

取5dpf的斑馬魚移入微孔板；

設(shè)置3個實(shí)驗(yàn)組：1個為誘導(dǎo)劑處理組，該組中對斑馬魚鰾腔注射10mg/mL的誘導(dǎo)劑，1個為溶劑注射組，該組中對斑馬魚鰾腔注射等體積的PBS；然后，各實(shí)驗(yàn)組均加入相同體積的養(yǎng)殖用水，在相同溫度下恒溫培養(yǎng)；

當(dāng)誘導(dǎo)劑處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，用立體熒光顯微鏡對斑馬魚鰾位置拍照并保存，對斑馬魚鰾位置聚集的中性粒細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，判斷已建立了斑馬魚鰾損傷炎癥模型。

優(yōu)選的，養(yǎng)魚用水條件為：溶解氧質(zhì)量濃度為6-8mg/L，水溫為28℃，pH為7.2-7.6，總硬度為200-250mg/L。

優(yōu)選的，恒溫培養(yǎng)條件為：微孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，在28℃下培養(yǎng)4h。

內(nèi)容二：一種應(yīng)用斑馬魚鰾損傷炎癥模型、評價肺損傷誘導(dǎo)劑毒性的方法，包括如下步驟：

(1)斑馬魚選取

將處于5dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚移入微孔板中，根據(jù)微孔板規(guī)格放入不同數(shù)量的斑馬魚；規(guī)格可以為6、12、24、48、96或384孔。

(2)誘導(dǎo)劑處理

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組：1個溶劑對照組、1個空白對照組、不同注射劑量的化合物處理組；空白對照組對斑馬魚不進(jìn)行任何處理，溶劑注射組對斑馬魚鰾腔注射PBS，化合物處理組對斑馬魚鰾腔分別注射0.1、10、100、500和1000ng的誘導(dǎo)劑；然后，各實(shí)驗(yàn)組均加入相同體積的養(yǎng)殖用水，在相同溫度下恒溫培養(yǎng)；

(3)對鰾位置中性粒細(xì)胞聚集數(shù)量進(jìn)行定性和定量評價

當(dāng)誘導(dǎo)劑處理至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，用立體熒光顯微鏡拍照并保存；觀察對比各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞聚集，定性評價肺損傷誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的鰾損傷；并采集、統(tǒng)計(jì)斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)量，定量評價肺損傷誘導(dǎo)劑引起的鰾損傷程度，鰾損傷程度以鰾炎癥誘發(fā)倍數(shù)表示，計(jì)算公式(b)為：

鰾損傷炎癥誘發(fā)倍數(shù)＝(N_化合物組-N_{溶劑對照組})/N_{溶劑對照組}

(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析肺損傷誘導(dǎo)劑的毒性程度

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用Dunnett’s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05為差異性顯著。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，評價肺損傷誘導(dǎo)劑引起的鰾損傷毒性程度。

優(yōu)選的，誘導(dǎo)劑為能夠誘發(fā)肺損傷的藥物或化學(xué)試劑，包括但不限于LPS、Poly I/C。

內(nèi)容三：一種應(yīng)用斑馬魚鰾損傷炎癥模型、評價肺損傷治療劑功效的方法，包括如下步驟：

(1)斑馬魚選取

將處于5dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚移入微孔板中，根據(jù)微孔板規(guī)格放入不同數(shù)量的斑馬魚；規(guī)格可以為6、12、24、48、96或384孔。

(2)誘導(dǎo)劑處理

空白對照組對斑馬魚不做任何處理，溶劑對照組對斑馬魚鰾腔注射5nL PBS，其它組斑馬魚均鰾腔注射50ng誘導(dǎo)劑；

(3)肺損傷治療劑處理

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組：1個空白對照組、1個溶劑對照組、1個模型對照組、不同濃度的化合物處理組；化合物處理組中斑馬魚以水溶或注射的方式給予0.1μM、1μM、10μM、100μM、1000μM的治療劑；模型對照組，溶劑對照組和空白對照組斑馬魚不做任何處理；然后，各實(shí)驗(yàn)組均加入相同體積的養(yǎng)殖用水，在相同溫度下恒溫培養(yǎng)；

(4)對鰾位置中性粒細(xì)胞聚集數(shù)量進(jìn)行定性和定量評價

當(dāng)治療劑處理至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，用立體熒光顯微鏡拍照并保存；觀察對比各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞聚集，定性評價肺損傷治療劑的抗炎作用；并采集、統(tǒng)計(jì)斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)量，定量評價肺損傷治療劑的抗炎作用，計(jì)算公式(a)為：

抗炎作用(％)＝(N_{模型對照組}-N_{化合物處理組})/N_{模型對照組}×100％；

(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析肺損傷治療劑的治療功效

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用Dunnett’s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05為差異性顯著。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，評價肺損傷治療劑的治療功效。

優(yōu)選的，治療劑為能夠治療肺損傷的藥物或化學(xué)試劑，包括但不限于PD98059、LY294002、sp600125、PHPS1。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明建立的斑馬魚鰾損傷炎癥模型，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)活體內(nèi)：實(shí)驗(yàn)材料為斑馬魚，作為一種脊椎動物，其篩選模型屬體內(nèi)模型，能夠真實(shí)反映藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄，真正反映藥物的整體生物活性。

(2)直觀：實(shí)驗(yàn)材料為中性粒細(xì)胞綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚，斑馬魚經(jīng)藥物處理后，借助熒光顯微鏡，可以無創(chuàng)傷地在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的任何時間點(diǎn)實(shí)時動態(tài)觀察中性粒細(xì)胞的行為學(xué)特點(diǎn)；而哺乳動物根本不可能完成這一操作。

(3)高通量：斑馬魚幼魚很小，只有1-4毫米，能夠在一個標(biāo)準(zhǔn)的6，12，24，48，96或384孔板內(nèi)進(jìn)行分析和實(shí)驗(yàn)周期短使斑馬魚成為一種能進(jìn)行高通量自動化體內(nèi)藥物致敏性評價的理想模型。

(4)經(jīng)濟(jì)：所需費(fèi)用低，以犬類為實(shí)驗(yàn)載體的篩選實(shí)驗(yàn)每只每天耗費(fèi)大于10美元，以豚鼠為實(shí)驗(yàn)載體的篩選實(shí)驗(yàn)每只每天耗費(fèi)大于1美元，而以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)載體的篩選實(shí)驗(yàn)每只每天耗費(fèi)小于0.01美元。

(5)化合物用量少：檢測化合物用量少，通常只需幾毫克，而傳統(tǒng)的篩選實(shí)驗(yàn)則需幾毫克以上的化合物。

(6)簡便：實(shí)驗(yàn)過程操作簡單，斑馬魚經(jīng)藥物處理后，即可進(jìn)行定量、分析該藥物的致敏性，而傳統(tǒng)動物實(shí)驗(yàn)操作過程復(fù)雜，判斷指標(biāo)主觀，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

(7)快速：實(shí)驗(yàn)周期短，可在1天內(nèi)完成；而豚鼠常需要數(shù)周到數(shù)月的時間，犬常需要數(shù)月至數(shù)年的時間。斑馬魚在第一個72小時以內(nèi)完成胚胎發(fā)育。多數(shù)的內(nèi)部器官，包括心血管系統(tǒng)、腸、肝臟和腎，在24-48小時內(nèi)快速成型，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)載體老鼠和猴子則分別需要21天和9個月方可完成胚胎發(fā)育。

(8)可靠的預(yù)測性：斑馬魚的基因與人類基因的相似度高達(dá)85％左右，其生物學(xué)功能與哺乳動物及人類高度相似，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性強(qiáng)，預(yù)測性好。

(9)穩(wěn)定性高、重復(fù)性好：本發(fā)明重復(fù)實(shí)驗(yàn)十幾次，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明基于斑馬魚鰾損傷炎癥模型的評價肺損傷治療劑與誘導(dǎo)劑的方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)目前肺損傷動物模型主要被用來研究肺損傷的機(jī)制，但這些動物模型大多數(shù)是根據(jù)已知的誘發(fā)肺損傷的危險(xiǎn)因子復(fù)制的，并且這些動物模型均存在造模操作復(fù)雜、技術(shù)要求高、手術(shù)創(chuàng)傷大、肺損傷發(fā)生率低、并發(fā)癥和死亡率高、模型建立不穩(wěn)定、可重復(fù)性差等缺點(diǎn)，不利于后續(xù)肺損傷治療藥物的評價與篩選工作，且實(shí)驗(yàn)周期長、費(fèi)用高、工作量大；而體外細(xì)胞模型缺少藥物在生物整體的代謝轉(zhuǎn)化和體內(nèi)的循環(huán)分布，不能反映藥物在體內(nèi)的真實(shí)情況。

(2)本發(fā)明中，發(fā)明人在建立了斑馬魚鰾損傷炎癥模型的基礎(chǔ)上，又提供了一種利用該模型評價肺損傷誘導(dǎo)劑毒性與治療劑功效的方法，這是一種全新的藥物評價模型與評價方法，能準(zhǔn)確反映藥物在體內(nèi)的真實(shí)情況，可實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)高通量評價藥物對治療急性肺損傷炎癥的功效，具有可靠、快速、高效、低廉、高性價比等優(yōu)點(diǎn)。

(3)本發(fā)明的評價方法，既可用于評價已公開藥物(如已知的誘導(dǎo)劑、治療劑)的毒性或功效，還可用于篩選具有未公開藥物(如結(jié)構(gòu)全新、藥效不明的化合物，常用于first、me-better、me-too等等的新藥開發(fā))的毒性或功效，應(yīng)用廣泛，意義重大。

附圖說明

圖1：圖像定性評價確定斑馬魚最佳發(fā)育階段

圖2：LPS對不同階段斑馬魚誘發(fā)的鰾損傷炎癥反應(yīng)定量評價

圖3：通過圖像分析定性確定斑馬魚鰾炎癥模型

圖4：劑量及時間依賴性的LPS誘導(dǎo)的鰾損傷炎癥反應(yīng)定量分析

圖5：斑馬魚鰾光鏡觀察

圖6：斑馬魚鰾電鏡觀察上皮細(xì)胞損傷

圖7：斑馬魚鰾電鏡觀察線粒體損傷

圖8：LPS在注射后不同時間點(diǎn)對LI-1β表達(dá)水平的影響

圖9：LPS在注射后不同時間點(diǎn)對LI-6表達(dá)水平的影響

圖10：通過圖像分析定性確定斑馬魚鰾損傷炎癥模型

圖11：50ng LPS誘導(dǎo)的鰾損傷炎癥定量分析

圖12：通過圖像分析定性確定PD98059對斑馬魚鰾損傷炎癥模型的抗炎作用

圖13：PD98059顯著抑制LPS誘發(fā)的斑馬魚鰾損傷炎癥反應(yīng)

圖14：通過圖像分析定性確定LY294002對斑馬魚鰾損傷炎癥模型的抗炎作用

圖15：LY294002顯著抑制LPS誘發(fā)的斑馬魚鰾炎癥反應(yīng)

圖16：通過圖像分析定性確定sp600125對斑馬魚鰾損傷炎癥模型的抗炎作用

圖17：sp600125顯著抑制LPS誘發(fā)的斑馬魚鰾炎癥反應(yīng)

圖18：通過圖像分析定性確定PHPS1對斑馬魚鰾損傷炎癥模型的抗炎作用

圖19：PHPS1顯著抑制LPS誘發(fā)的斑馬魚鰾損傷炎癥反應(yīng)

圖20：通過圖像分析定性確定Poly I/C引起斑馬魚鰾損傷炎癥反應(yīng)

圖21：Poly I/C可誘發(fā)斑馬魚鰾炎癥反應(yīng)

具體實(shí)施方式

以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1 確定斑馬魚最佳發(fā)育階段

1 斑馬魚選取

取4～5對中性粒細(xì)胞綠色熒光轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚(MPO)親本交配，按照Westerfield^[26]的方法孵化胚胎。斑馬魚發(fā)育到4.5dpf時，前鰾已經(jīng)充氣形成。將4.5dpf、5dpf、6dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚分別移入三個6孔板中，每孔30尾。(注：本發(fā)明中的dpf＝day post fertilization，中文是指斑馬魚受精后天數(shù)，如5dpf是指斑馬魚受精后五天。)

2 誘導(dǎo)劑LPS處理

設(shè)置3個實(shí)驗(yàn)組(每組分別為4.5dpf、5dpf、6dpf的斑馬魚)，每個實(shí)驗(yàn)組包括1個誘導(dǎo)劑處理組、1個溶劑對照組和1個空白對照組。誘導(dǎo)劑處理組中斑馬魚鰾腔注射50ng LPS；溶劑對照組中斑馬魚鰾腔注射等體積PBS(即PBS與LPS等量)；空白對照組中斑馬魚不做任何處理；每個實(shí)驗(yàn)組按照微孔板的規(guī)格均加入相等體積的養(yǎng)殖用水，并將微孔板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。

3 對鰾位置中性粒細(xì)胞聚集數(shù)量進(jìn)行定性和定量評價

誘導(dǎo)劑LPS處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，利用立體熒光顯微鏡對個處理組斑馬魚拍照并保存。一方面通過觀察對比各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞聚集程度定性確定斑馬魚最佳發(fā)育階段(見圖1.)另一方面利用尼康NIS-Elements D3.10高級圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，采集并統(tǒng)計(jì)斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量，定量評價誘導(dǎo)劑LPS引起的鰾損傷程度，其鰾損傷程度計(jì)算公式見(b)。

空白對照組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量基本沒有。隨著斑馬魚年齡的增加，誘導(dǎo)劑LPS處理組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，5dpf斑馬魚鰾損傷程度最大(見圖2.)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示：4.5dpf、5dpf、6dpf的斑馬魚鰾損傷率分別為(69.97±3.69)％、(45.18±2.98)％、(30.39±1.23)％(見圖2.)，這表明隨著斑馬魚年齡的增加，鰾損傷率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，5dpf的斑馬魚鰾損傷率最高。通過方差分析，誘導(dǎo)劑處理組的鰾損傷率明顯高于溶劑對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；5dpf的斑馬魚與4.5dpf和6dpf的斑馬魚髓鞘損傷率相比，p<0.05。

圖1：圖像定性評價確定斑馬魚最佳發(fā)育階段

其中，Control為空白對照組，Vehicle為溶劑對照組；5dpf斑馬魚經(jīng)誘導(dǎo)劑處理后，鰾腔中性粒細(xì)胞聚集最密集，誘發(fā)強(qiáng)度最為激烈，4.5dpf和6dpf時，中性粒細(xì)胞聚集相對稀疏，誘發(fā)強(qiáng)度相對溫和。

圖2：LPS對不同階段斑馬魚誘發(fā)的鰾損傷炎癥反應(yīng)定量評價

與模型對照組比較，*p＜0.001。Control為空白對照組，Vehicle為溶劑對照組；5dpf斑馬魚經(jīng)誘導(dǎo)劑處理后，鰾腔中性粒細(xì)胞聚集最密集，誘發(fā)強(qiáng)度最為激烈，誘發(fā)倍數(shù)高達(dá)13.8倍；4.5dpf和6dpf時，中性粒細(xì)胞聚集相對稀疏，誘發(fā)強(qiáng)度相對溫和，誘發(fā)倍數(shù)分別為5.3和3.4。

綜上，確定斑馬魚的最佳發(fā)育階段為5dpf。

實(shí)施例2 確定誘導(dǎo)劑LPS最佳處理時間長度和注射劑量

1 斑馬魚選取

將5dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚分別移入五個6孔板中，每孔30尾。

2 化合物處理

設(shè)置6個實(shí)驗(yàn)組：4個誘導(dǎo)劑LPS處理組、1個溶劑注射組、1個空白對照組。誘導(dǎo)劑組斑馬魚鰾腔分別注射不同劑量的LPS(脂多糖)，注射劑量分別為5ng、12.5ng、25ng和50ng(濃度分別為1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL和10mg/mL的LPS分別鰾腔注射5nL)；溶劑注射組斑馬魚鰾腔注射5nL PBS；空白對照組斑馬魚不做任何處理。各實(shí)驗(yàn)組按照微孔板規(guī)格均加入相同體積的養(yǎng)殖用水，并將微孔板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時間(比如1h、2h、4h、8h、16h、24h等)。

3 對鰾位置中性粒細(xì)胞聚集數(shù)量進(jìn)行定性和定量評價

誘導(dǎo)劑LPS處理斑馬魚至不同實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，利用立體熒光顯微鏡對斑馬魚鰾位置拍照并保存；觀察并統(tǒng)計(jì)斑馬魚鰾位置聚集的中性粒細(xì)胞數(shù)量(見圖3.)，對不同劑量的誘導(dǎo)劑LPS在注射后不同時間點(diǎn)(x hpi：x hours post injection，注射后x小時)誘發(fā)的鰾炎癥反應(yīng)進(jìn)行定量評價(見圖4.)。

圖3：通過圖像分析定性確定斑馬魚鰾炎癥模型

LPS注射組中性粒細(xì)胞聚集特點(diǎn)：1hpi～4hpi近血管端中性粒細(xì)胞數(shù)量逐漸變多，逐漸向鰾中央遷移；4hpi和8hpi達(dá)到高峰；16hpi～24hpi中性粒細(xì)胞在中央位置逐漸減少，最后在近血管端位置接近消失。

圖4：劑量及時間依賴性的LPS誘導(dǎo)的鰾損傷炎癥反應(yīng)定量分析

與溶劑對照組比較，*p＜0.001。1hpi～4hpi斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞顯著增加，呈現(xiàn)劑量正相關(guān)性；4hpi和8hpi達(dá)到高峰；16hpi～24hpi逐漸減少，但與溶劑對照組比較，仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4 組織病理學(xué)檢測(光鏡觀察)

誘導(dǎo)劑LPS處理斑馬魚分別至1hpi、4hpi和24hpi后，分別采集斑馬魚樣本，并用4％多聚甲醛固定24h,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片,H&E染色,在顯微鏡下觀察并拍照，對斑馬魚進(jìn)行鰾病理學(xué)分析(見圖5.)。

圖5：斑馬魚鰾光鏡觀察

50ng LPS注射組斑馬魚在1hpi和4hpi時，炎癥細(xì)胞增多，24hpi鰾壁增厚，炎癥細(xì)胞減少。

5 超微病理學(xué)檢測(電鏡觀察)

誘導(dǎo)劑LPS處理斑馬魚分別至1hpi、4hpi和24hpi后，分別采集斑馬魚樣本，用2.0％(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛和2.0％(體積分?jǐn)?shù))戊二醛溶液前固定24h(4℃)后,用磷酸緩沖液(pH 7.12)沖洗，然后置于1％(體積分?jǐn)?shù))鋨酸中后固定2h，雙蒸水沖洗后系列酒精脫水、包埋、超薄切片機(jī)切片(60～90nm)，醋酸鈾-檸檬酸鉛復(fù)染，透射電鏡下觀察并拍照，對斑馬魚進(jìn)行鰾電鏡超微病理學(xué)分析(見圖6.和圖7.)。

圖6：斑馬魚鰾電鏡觀察上皮細(xì)胞損傷

誘導(dǎo)劑50ng LPS在1hpi、4hpi和24hpi時，均引起不同程度的上皮細(xì)胞損傷(箭頭所示)。

圖7：斑馬魚鰾電鏡觀察線粒體損傷

誘導(dǎo)劑50ng LPS在4hpi和24hpi時，均引起不同程度的線粒體損傷(箭頭所示)。

6 炎癥因子IL-1β和IL-6表達(dá)水平分析

誘導(dǎo)劑LPS處理斑馬魚至不同實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，如1hpi(hours post injection)、2hpi、3hpi、4hpi、8hpi等，采集樣本，利用q-PCR方法檢測IL-1β和IL-6的表達(dá)水平(見圖8.和圖9.)。

圖8：LPS在注射后不同時間點(diǎn)對LI-1β表達(dá)水平的影響

與溶劑對照組比較，**p＜0.001。50ng LPS注射后0-1小時，IL-1β表達(dá)呈現(xiàn)激增趨勢，并在1hp達(dá)到峰值，隨后1-24hpi呈現(xiàn)下降趨勢，除在4hpi時與溶劑對照組比較，仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001)外，在其余時間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。

圖9：LPS在注射后不同時間點(diǎn)對LI-6表達(dá)水平的影響

與溶劑對照組比較，*p＜0.01。50ng LPS注射后0-1小時，IL-6表達(dá)呈現(xiàn)激增趨勢，并在1hp達(dá)到峰值，隨后1-24hpi呈現(xiàn)下降趨勢，除在4hpi時與溶劑對照組比較，仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001)外，其余時間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用JMP8.0軟件對上述圖像分析統(tǒng)計(jì)所得的鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量、炎癥因子IL-1β和LI-6表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用Dunnett’s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05為差異性顯著。

綜上，確定誘導(dǎo)劑LPS的最佳給藥濃度為10mg/mL(相當(dāng)于最佳注射劑量為50ng)，最佳處理時間為4h。

實(shí)施例3 斑馬魚鰾損傷炎癥模型的構(gòu)建方法

基于實(shí)施例1和2中的斑馬魚最佳發(fā)育階段、化合物最佳處理時間長度和注射劑量，通過優(yōu)化LPS的濃度建立斑馬魚急性肺損傷炎癥模型。設(shè)計(jì)方案如下：

1 斑馬魚選取

將5dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚分別移入六孔板中，每孔30尾。

2 誘導(dǎo)劑LPS處理

設(shè)置3個實(shí)驗(yàn)組：1個誘導(dǎo)劑處理組、1個溶劑注射組、1個空白對照組。誘導(dǎo)劑組斑馬魚鰾腔分別注射50ng LPS(10mg/mL濃度注射5nL)；溶劑對照組斑馬魚鰾腔注射5nL PBS；正常對照組斑馬魚不做任何處理。各實(shí)驗(yàn)組均按照微孔板規(guī)格加入相等體積的養(yǎng)殖用水，并將微孔板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。

3 統(tǒng)計(jì)分析斑馬魚鰾位置的中性粒細(xì)胞聚集數(shù)量，確認(rèn)已建立斑馬魚鰾損傷炎癥模型

誘導(dǎo)劑LPS處理斑馬魚至4h后，利用立體熒光顯微鏡對斑馬魚鰾位置拍照并保存；觀察并統(tǒng)計(jì)斑馬魚鰾位置聚集的中性粒細(xì)胞數(shù)量(圖10.)，對鰾位置聚集的中性粒細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果，判斷已建立了斑馬魚鰾損傷炎癥模型(圖11.)。

圖10：通過圖像分析定性確定斑馬魚鰾損傷炎癥模型

50ng的LPS鰾腔注射后4小時，誘發(fā)斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞大量聚集。

圖11：50ng LPS誘導(dǎo)的鰾損傷炎癥定量分析

與溶劑對照組比較，*p＜0.001。50ng LPS誘發(fā)斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量大量聚集，誘導(dǎo)倍數(shù)高達(dá)10倍，與溶劑對照組比較具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

實(shí)施例4 用斑馬魚鰾損傷炎癥模型評價已知肺損傷治療劑的功效

實(shí)驗(yàn)一：評價已知肺損傷治療劑PD98059的抗炎作用

PD98059可用于治療急性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)，是已知的肺損傷治療劑。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)施例3構(gòu)建的斑馬魚鰾損傷炎癥模型，評價肺損傷治療劑PD98059的抗炎作用。

1 斑馬魚選取

將5dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚移入6孔板中，每孔30尾。

2 LPS處理

正常對照組斑馬魚不做任何處理，溶劑對照組斑馬魚鰾腔注射5nL PBS，

其它組斑馬魚均鰾腔注射50ng LPS，隨后立即開展步驟3。

3 PD98059處理

設(shè)置8個實(shí)驗(yàn)組：5個化合物處理組、1個模型對照組、1個溶劑對照組、1個空白對照組。5個PD98059處理組分別為濃度為6.25、12.5、25、50和100μM的PD98059，每個實(shí)驗(yàn)組藥液體積為3mL；模型對照組，溶劑對照組和空白對照組斑馬魚不做任何處理，每個實(shí)驗(yàn)組均加入3mL養(yǎng)殖用水。

4 對鰾位置中性粒細(xì)胞聚集數(shù)量進(jìn)行定性和定量評價

誘導(dǎo)劑LPS和藥物PD98059共同處理斑馬魚至4h后，利用立體熒光顯微鏡對斑馬魚鰾位置拍照并保存；觀察并統(tǒng)計(jì)斑馬魚鰾位置聚集的中性粒細(xì)胞數(shù)量N(圖12.)，對PD98059對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚鰾損傷炎癥模型的抗炎作用進(jìn)行量分析(圖13.)，并計(jì)算抗炎作用，抗炎作用公式見(a)。

圖12：通過圖像分析定性確定PD98059對斑馬魚鰾損傷炎癥模型的抗炎作用

其中，Control為正常對照組，Vehicle為溶劑對照組，Model為模型對照組。PD98059五個濃度組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量，較模型對照組斑馬魚明顯減少。

圖13：PD98059顯著抑制LPS誘發(fā)的斑馬魚鰾損傷炎癥反應(yīng)

與模型對照組比較，*p＜0.001。PD98059各濃度組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量與模型組比較顯著減少(圖A)，提示PD98059各濃度組均顯著抑制LPS誘發(fā)的斑馬魚鰾炎癥反應(yīng)，且抑制率呈現(xiàn)上圖所示的劑量相關(guān)性增加(圖B)。

實(shí)驗(yàn)二：評價已知肺損傷治療劑LY294002的抗炎作用

LY294002可用于治療急性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)，是已知的肺損傷治療劑。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)施例3構(gòu)建的斑馬魚鰾損傷炎癥模型，評價肺損傷治療劑LY294002的抗炎作用。

1 斑馬魚選取

將5dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚移入6孔板中，每孔30尾。

2 誘導(dǎo)劑LPS處理

正常對照組斑馬魚不做任何處理，溶劑對照組斑馬魚鰾腔注射5nL PBS，

其它組斑馬魚均鰾腔注射50ng LPS，隨后立即開展步驟3。

3 LY294002處理

設(shè)置6個實(shí)驗(yàn)組：3個化合物組合處理組、1個模型對照組、1個溶劑對照組、1個空白對照組。3個LY294002處理組分別為濃度為37.5、75和150μM的LY294002，每個實(shí)驗(yàn)組藥液體積為3mL；模型對照組，溶劑對照組和空白對照組斑馬魚不做任何處理，每個實(shí)驗(yàn)組均加入3mL養(yǎng)殖用水。

4 對鰾位置中性粒細(xì)胞聚集數(shù)量進(jìn)行定性和定量評價

誘導(dǎo)劑LPS和LY294002共同處理斑馬魚至4h后，利用立體熒光顯微鏡對斑馬魚鰾位置拍照并保存；觀察并統(tǒng)計(jì)斑馬魚鰾位置聚集的中性粒細(xì)胞數(shù)量N(圖14.)，對LY294002對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚鰾損傷炎癥模型的抗炎作用進(jìn)行量分析(圖15.)，并計(jì)算抗炎作用，其中抗炎作用公式同a。

圖14：通過圖像分析定性確定LY294002對斑馬魚鰾損傷炎癥模型的抗炎作用

其中，Control為正常對照組，Vehicle為溶劑對照組，Model為模型對照組。LY294002三個濃度組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量，較模型對照組斑馬魚明顯減少。

圖15：LY294002顯著抑制LPS誘發(fā)的斑馬魚鰾炎癥反應(yīng)

與模型對照組比較，*p＜0.001。LY294002各濃度組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量與模型組比較顯著減少(圖A)，提示LY294002各濃度組均顯著抑制LPS誘發(fā)的斑馬魚鰾炎癥反應(yīng)，且抑制率呈現(xiàn)上圖所示的劑量相關(guān)性增加(圖B)。

實(shí)驗(yàn)三：評價已知肺損傷治療劑sp600125的抗炎作用

sp600125可用于治療急性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)，是已知的肺損傷治療劑。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)施例3構(gòu)建的斑馬魚鰾損傷炎癥模型，評價肺損傷治療劑sp600125的抗炎作用。

1 斑馬魚選取

將5dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚移入6孔板中，每孔30尾。

2 誘導(dǎo)劑LPS處理

正常對照組斑馬魚不做任何處理，溶劑對照組斑馬魚鰾腔注射5nL PBS，其它組斑馬魚均鰾腔注射50ng LPS，隨后立即開展步驟3。

3 sp600125處理

設(shè)置6個實(shí)驗(yàn)組：3個化合物組合處理組、1個模型對照組、1個溶劑對照組、1個空白對照組。3個sp600125處理組分別為濃度為37.5、75和150μM的sp600125，每個實(shí)驗(yàn)組藥液體積為3mL；模型對照組，溶劑對照組和空白對照組斑馬魚不做任何處理，每個實(shí)驗(yàn)組均加入3mL養(yǎng)殖用水。

4 對鰾位置中性粒細(xì)胞聚集數(shù)量進(jìn)行定性和定量評價

誘導(dǎo)劑LPS和sp600125共同處理斑馬魚至4h后，利用立體熒光顯微鏡對斑馬魚鰾位置拍照并保存；觀察并統(tǒng)計(jì)斑馬魚鰾位置聚集的中性粒細(xì)胞數(shù)量N(圖16.)，對sp600125對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚鰾損傷炎癥模型的抗炎作用進(jìn)行量分析(圖17.)，并計(jì)算抗炎作用，其中抗炎作用公式同a。

圖16：通過圖像分析定性確定sp600125對斑馬魚鰾損傷炎癥模型的抗炎作用

其中，Control為正常對照組，Vehicle為溶劑對照組，Model為模型對照組。sp600125的三個濃度量組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量，較模型對照組斑馬魚明顯減少。

圖17：sp600125顯著抑制LPS誘發(fā)的斑馬魚鰾炎癥反應(yīng)

與模型對照組比較，*p＜0.001。sp600125各濃度組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量與模型組比較顯著減少(圖A)，提示sp600125各濃度組均顯著抑制LPS誘發(fā)的斑馬魚鰾炎癥反應(yīng)，且抑制率呈現(xiàn)上圖所示的劑量相關(guān)性增加(圖B)。

實(shí)施例5 用斑馬魚鰾損傷炎癥模型評價PHPS1的抗炎作用

PHPS1是蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2的抑制劑，但其對急性肺損傷是否具有治療效果，尚未見報(bào)道。實(shí)施例4用已知肺損傷治療劑，驗(yàn)證了用斑馬魚鰾損傷炎癥模型的評價治療劑功效的可行性，因此本實(shí)施例可利用該模型評價PHPS1的抗炎作用，已判斷其是否具有肺損傷治療的功效。

1 斑馬魚選取

將5dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚分別微孔板中。

2 誘導(dǎo)劑LPS處理

正常對照組斑馬魚不做任何處理，其它實(shí)驗(yàn)組斑馬魚均鰾腔注射50ng LPS，之后立即進(jìn)行步驟3。

3 待測藥物PHPS1處理

設(shè)置8個實(shí)驗(yàn)組：3個PHPS1處理組、1個模型對照組、1個正常對照組。3個PHPS1處理組分別為3.75、7.5和15ng PHPS1(靜脈注射)；模型對照組和正常對照組斑馬魚不做任何處理。各實(shí)驗(yàn)組按照微孔板的規(guī)格加入相等體積的養(yǎng)殖用水，并將微孔板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。

4 對鰾位置中性粒細(xì)胞聚集數(shù)量進(jìn)行定性和定量評價

誘導(dǎo)劑LPS和藥物PHPS1共同處理斑馬魚至4h后，利用立體熒光顯微鏡對斑馬魚鰾位置拍照并保存；觀察并統(tǒng)計(jì)斑馬魚鰾位置聚集的中性粒細(xì)胞數(shù)量N(圖18.)，對PHPS1對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚鰾損傷炎癥模型的抗炎作用進(jìn)行量分析(圖19.)，并計(jì)算抗炎作用，計(jì)算公式同a.

圖18：通過圖像分析定性確定PHPS1對斑馬魚鰾損傷炎癥模型的抗炎作用

PHPS1顯著抑制LPS誘導(dǎo)的鰾位置中性粒細(xì)胞的聚集。

圖19：PHPS1顯著抑制LPS誘發(fā)的斑馬魚鰾損傷炎癥反應(yīng)

與模型對照組比較，*p＜0.001。PHPS1各劑量注射組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量與模型組比較顯著減少，提示PHPS1各劑量組均可顯著抑制LPS誘發(fā)的斑馬魚鰾炎癥反應(yīng)，且抑制率呈現(xiàn)上圖所示的劑量相關(guān)性增加。

實(shí)施例6 用斑馬魚鰾損傷炎癥模型評價Poly I/C的誘發(fā)炎癥作用

Poly I/C為人工合成的雙鏈RNA[polyriboinosinic polyribocytidy-lic acid，poly(I:C)]，常被用來模擬RNA病毒感染及病毒致病機(jī)制的相關(guān)研究，但其能否誘發(fā)急性肺損傷炎癥，尚未見報(bào)道。實(shí)施例3用已知肺損傷誘導(dǎo)劑，驗(yàn)證了所構(gòu)建的斑馬魚鰾損傷炎癥模型有效，因此本實(shí)施例可利用該模型評價Poly I/C的誘發(fā)炎癥作用，評價Poly I/C對斑馬魚鰾誘發(fā)的炎癥反應(yīng)程度(即誘導(dǎo)劑的毒性評價)。

1 斑馬魚選取

將5dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚移入6孔板中，每孔30尾。

2 Poly I/C處理

設(shè)置6個實(shí)驗(yàn)組：4個化合物組合處理組、1個溶劑對照組、1個空白對照組。4個化合物處理組分別為注射劑量為10、20、40和80ng的Poly I/C；每個實(shí)驗(yàn)組均加入3mL養(yǎng)殖用水。

3 對鰾位置中性粒細(xì)胞聚集數(shù)量進(jìn)行定性和定量評價

Poly I/C處理斑馬魚至4h或不同時間段(1h、4h、8h等)后，利用立體熒光顯微鏡對斑馬魚鰾位置拍照并保存；觀察并統(tǒng)計(jì)斑馬魚鰾位置聚集的中性粒細(xì)胞數(shù)量N(圖20.)，對Poly I/C引起的斑馬魚鰾炎癥反應(yīng)進(jìn)行定量分析(圖21.)，并計(jì)算鰾損傷炎癥誘發(fā)倍數(shù)，計(jì)算公式同b。

圖20：通過圖像分析定性確定Poly I/C引起斑馬魚鰾損傷炎癥反應(yīng)

Control為正常對照組，Vehicle為溶劑對照組，Poly I/C5的四個劑量組斑馬魚鰾位置中性粒細(xì)胞數(shù)量，較溶劑對照組斑馬魚在1-4hpi呈現(xiàn)時間和劑量相關(guān)性增加，隨后呈現(xiàn)時間相關(guān)性減少。

圖21：Poly I/C可誘發(fā)斑馬魚鰾炎癥反應(yīng)

與溶劑對照組比較，**p＜0.05，***p＜0.001。在0～4hpi呈現(xiàn)劑量和時間相關(guān)性增加(p＜0.001)，并在4hpi時達(dá)到峰值，為溶劑對照組的2.6～4.4倍；在4hpi～24hpi呈現(xiàn)劑量和時間相關(guān)性減少(p＜0.001或0.05)，在24hpi時各注射組與溶劑PBS注射組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。

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