本發(fā)明涉及微電極生物傳感技術(shù)，具體地說，涉及一種基于微電極生物傳感技術(shù)的植物體茉莉酸甲酯檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

茉莉酸甲酯，廣泛存在于植物體的一類生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有多種生理效應(yīng)，如能提高幼苗對(duì)高低溫干旱的抵抗能力，可以刺激抗真菌蛋白的合成從而啟動(dòng)或加速與防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)的次生代謝，抑制生長分化，促進(jìn)生根成熟衰老等。目前，由于茉莉酸甲酯重要的生理效應(yīng)和在植物體中相對(duì)低的含量，茉莉酸甲酯的檢測(cè)愈來愈受到重視。

目前用于檢測(cè)植物體中的茉莉酸甲酯的方法主要是色譜法，包括氣質(zhì)聯(lián)用，液質(zhì)聯(lián)用，高效液相色譜，毛細(xì)管液相色譜等，也有酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)。這些方法所使用的儀器多數(shù)操作復(fù)雜，成本較高，周期較長，樣本破壞性大，無法實(shí)現(xiàn)植物生長在線檢測(cè)。電化學(xué)分析法因其操作方便、響應(yīng)迅速和靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)，最為適合植物活體在線的定性定量檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于微電極生物傳感技術(shù)的植物體茉莉酸甲酯檢測(cè)方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種微電極生物傳感器，所述微電極呈三棱錐形，長1-10cm，其尖端部分長2-20mm，另一端橫截面三角形的邊長為1-15mm(優(yōu)選另一端橫截面為等邊三角形)；所述微電極的基底電極材料為經(jīng)過絕緣處理的硅片、不銹鋼或有機(jī)玻璃等；在所述基底的每個(gè)面上，一端設(shè)置有用于連接電化學(xué)工作站的元件，另一端為檢測(cè)用的電極材料，所述元件與電極材料之間通過導(dǎo)線相連；所述微電極具有三電極體系，包含Ag/AgCl參比電極，鉑對(duì)電極以及由鉑、石墨烯和全氟磺酸樹脂修飾的金工作電極。

所述微電極生物傳感器可按如下方法制備得到：

1)采用微機(jī)電技術(shù)(MEMS)在基底上制備鉑對(duì)電極、Ag/AgCl參比電極以及金工作電極；

2)所述金工作電極用氧化鋁粉末在金相砂紙上拋光，分別用去離子水、乙醇進(jìn)行超聲清洗，隨后將微電極置于0.5M稀硫酸溶液中，在0-1.5V電位下進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到典型的循環(huán)伏安譜圖，確保電極表面干凈；

3)配制1mg/ml氧化石墨烯和1mM氯鉑酸混合溶液，將所述微電極浸入上述溶液中，在-0.8V電壓下通過計(jì)時(shí)安培法進(jìn)行電化學(xué)還原沉積0.5～2h(優(yōu)選1h)，然后用去離子水洗凈，得到修飾的石墨烯/鉑電極；

4)將濃度0.005～0.1％的全氟磺酸樹脂溶液(優(yōu)選0.02％)滴涂在所述石墨烯/鉑電極上，在50℃下干燥成膜(干燥溫度一般低于100℃，滿足干燥成膜的條件即可)，然后用去離子水洗凈，得到由鉑、石墨烯和全氟磺酸樹脂修飾的金工作電極，從而完成所述微電極生物傳感器的制備。

本發(fā)明還提供所述微電極生物傳感器在植物茉莉酸甲酯在線檢測(cè)中的應(yīng)用。其是將所述微電極生物傳感器插入待測(cè)植物組織中，連接電化學(xué)工作站進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物組織進(jìn)行在線茉莉酸甲酯檢測(cè)。

檢測(cè)前選取不同濃度的茉莉酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行差分脈沖伏安法掃描，根據(jù)茉莉酸甲酯濃度與電流關(guān)系獲得微電極檢測(cè)茉莉酸甲酯工作曲線；檢測(cè)條件為：電位0.9-1.4V，電位增量0.004V，振幅0.05V，脈沖寬度0.02s，脈沖周期0.5s，靜止時(shí)間20s。

其中，所述不同濃度的茉莉酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液使用pH6.0的10mM磷酸緩沖液配制。

所述微電極生物傳感器最低檢測(cè)限為0.5μmol/L，線性范圍為1-100μM，茉莉酸甲酯溶液濃度與響應(yīng)峰電流的線性方程為：I＝0.682+1.71C，相關(guān)性系數(shù)為0.9847；其中，I表示電流，單位為μA，C表示濃度，單位為μM。

本發(fā)明的檢測(cè)對(duì)象包括植物的根、莖、葉或果實(shí)等部位，插入深度為0.5cm左右。檢測(cè)目標(biāo)材料是植物生長的不同時(shí)期，例如小麥幼苗的莖部。

前述的應(yīng)用，還包括檢測(cè)前對(duì)所述微電極生物傳感器進(jìn)行校正的步驟，具體方法如下：對(duì)微電極進(jìn)行清洗，然后分別用兩份標(biāo)準(zhǔn)濃度(例如5μM和50μM)的茉莉酸甲酯溶液進(jìn)行電化學(xué)校準(zhǔn)，如果工作曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率偏差在15％以內(nèi)，判定電極可正常工作。

校正后對(duì)樣品進(jìn)行差分脈沖伏安掃描，檢測(cè)條件為：電位0.9-1.4V，電位增量0.004V，振幅0.05V，脈沖寬度0.02s，脈沖周期0.5s，靜止時(shí)間20s。

連接電化學(xué)工作站，系統(tǒng)活化20min后，穩(wěn)定運(yùn)行1min-10min采集電流數(shù)據(jù)代入線性方程，得到植物組織中茉莉酸甲酯的濃度。

本發(fā)明提供的一種基于微電極生物傳感技術(shù)的植物在線茉莉酸甲酯檢測(cè)方法，該方法具有準(zhǔn)確度高、樣本破壞小、操作簡單、便于攜帶的特點(diǎn)，在時(shí)間和空間層面上，實(shí)現(xiàn)植物體中茉莉酸甲酯信息的同步獲取，為植物體研究提供了技術(shù)支持。與傳統(tǒng)的生物鑒定、化學(xué)檢測(cè)方法相比，該方法樣品前處理簡單，檢測(cè)部位無需離體、微損、無本質(zhì)傷害，不會(huì)對(duì)植物造成實(shí)質(zhì)性的損害，檢測(cè)結(jié)果可靠，靈敏度高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中制備的微電極生物傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，A面-工作電極，B面-參比電極，C面-對(duì)電極。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中微電極生物傳感器的工作電極修飾示意圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1 微電極生物傳感器及其制備方法

本實(shí)施例采用微機(jī)電技術(shù)在經(jīng)過絕緣處理的不銹鋼基底上制備微電極，所述微電極呈三棱錐形，總長度為5cm，尖端部分長度為5mm，另一端橫截面為等邊三角形，邊長為3mm；在所述基底的每個(gè)面上，一端設(shè)置有用于連接電化學(xué)工作站的元件，另一端為檢測(cè)用的電極材料，所述元件與電極材料之間通過導(dǎo)線相連；所述微電極具有三電極體系，包含Ag/AgCl參比電極，鉑對(duì)電極以及由鉑、石墨烯和全氟磺酸樹脂修飾的金工作電極(圖1和圖2)。

所述由鉑、石墨烯和全氟磺酸樹脂修飾的金工作電極可按如下方法制備得到：

1、將金工作電極用氧化鋁粉末在金相砂紙上拋光，分別用去離子水、乙醇進(jìn)行超聲清洗，隨后將微電極置于0.5M稀硫酸溶液中，在0-1.5V電位下進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到典型的循環(huán)伏安譜圖，確保電極表面干凈；

2、配制1mg/ml氧化石墨烯和1mM氯鉑酸混合溶液，將所述微電極浸入上述溶液中，在-0.8V電壓下通過計(jì)時(shí)安培法進(jìn)行電化學(xué)還原沉積1h，然后用去離子水洗凈，得到修飾的石墨烯/鉑電極；

3、將濃度0.02％的全氟磺酸樹脂溶液滴涂在所述石墨烯/鉑電極上，在50℃下干燥成膜，然后用去離子水洗凈，得到由鉑、石墨烯和全氟磺酸樹脂修飾的金工作電極，從而完成所述微電極生物傳感器的制備。

實(shí)施例2 利用微電極生物傳感器對(duì)植物茉莉酸甲酯進(jìn)行實(shí)時(shí)在線檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象

待測(cè)植物為北京市農(nóng)林科學(xué)院種植的小麥品種‘農(nóng)大6812’，選取兩株小麥幼苗的莖部作為檢測(cè)樣本。

清潔后，將實(shí)施例1制備的微電極插入待測(cè)樣本莖部，開始電化學(xué)檢測(cè)。

2、實(shí)驗(yàn)儀器及耗材

實(shí)驗(yàn)儀器采用上海辰華電化學(xué)工作站760e。

3、實(shí)驗(yàn)方法

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

檢測(cè)前選取不同濃度的茉莉酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行差分脈沖伏安法掃描，根據(jù)茉莉酸甲酯濃度與電流關(guān)系獲得微電極檢測(cè)茉莉酸甲酯工作曲線；檢測(cè)條件為：電位0.9-1.4V，電位增量0.004V，振幅0.05V，脈沖寬度0.02s，脈沖周期0.5s，靜止時(shí)間20s。

其中，所述不同濃度的茉莉酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液使用pH6.0的10mM磷酸緩沖液配制。

所述微電極生物傳感器最低檢測(cè)限為0.5μmol/L，線性范圍為1-100μM，茉莉酸甲酯溶液濃度與響應(yīng)峰電流的線性方程為：I＝0.682+1.71C，相關(guān)性系數(shù)為0.9847；其中，I表示電流，單位為μA，C表示濃度，單位為μM。

(2)實(shí)驗(yàn)步驟：

檢測(cè)前對(duì)所述微電極生物傳感器進(jìn)行校正，方法如下：對(duì)微電極進(jìn)行清洗，然后分別用兩份標(biāo)準(zhǔn)濃度(5μM和50μM)的茉莉酸甲酯溶液進(jìn)行電化學(xué)校準(zhǔn)，如果工作曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率偏差在15％以內(nèi)，判定電極可正常工作。

校正后對(duì)樣品進(jìn)行差分脈沖伏安掃描，檢測(cè)條件為：電位0.9-1.4V，電位增量0.004V，振幅0.05V，脈沖寬度0.02s，脈沖周期0.5s，靜止時(shí)間20s。

連接電化學(xué)工作站，系統(tǒng)活化20min后，穩(wěn)定運(yùn)行1min-10min采集電流數(shù)據(jù)代入線性方程，得到植物組織中茉莉酸甲酯的濃度。

4、實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果

采用HPLC法以及本發(fā)明的在線檢測(cè)分析兩株小麥幼苗莖部的茉莉酸甲酯含量比較結(jié)果見表1?？梢钥闯觯痉椒z測(cè)結(jié)果可靠，通過電化學(xué)工作站可以實(shí)現(xiàn)茉莉酸甲酯在線動(dòng)態(tài)檢測(cè)分析，為活體在線研究植物茉莉酸甲酯含量提供了新方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)手段的補(bǔ)充。

表1小麥幼苗莖部的茉莉酸甲酯測(cè)試結(jié)果(單位，μg/g)

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。