本發(fā)明屬于熒光顯微成像領(lǐng)域，具體地，涉及一種光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記生物組織包埋樣品的熒光控制方法。
背景技術(shù)：
：：某些熒光蛋白的光物理性質(zhì)能夠被光精確控制，這類熒光蛋白叫光控?zé)晒獾鞍住Ｋ辽侔ㄈ缦聝深?，光激活熒光蛋白和光轉(zhuǎn)換熒光蛋白。光激活熒光蛋白在初始狀態(tài)時(shí)不發(fā)熒光，經(jīng)過特定波長激活光激活后，能夠被激發(fā)出熒光，比如PAGFP。光轉(zhuǎn)換熒光蛋白在初始狀態(tài)時(shí)就可以發(fā)熒光，但是經(jīng)過激活光激活后，可以被激發(fā)出另外一種顏色的熒光，比如mEos3.1、mEos3.2等。光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記的生物組織和普通熒光蛋白標(biāo)記的生物組織，成像方法類似，常用普通的寬場成像方法或者用共聚焦、雙光子點(diǎn)掃描成像。對(duì)于大的生物組織，常常需要包埋劑包埋后進(jìn)行斷層成像。由于缺乏合適的熒光控制方法，導(dǎo)致現(xiàn)有技術(shù)采用光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記生物組織包埋樣品在成像時(shí)有一個(gè)巨大的缺陷：快速的寬場成像方法層析能力差，無法實(shí)現(xiàn)高分辨；而高分辨的點(diǎn)掃描成像方法，如共聚焦或雙光子成像，對(duì)于體積大的生物組織包埋樣品則成像太慢。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記生物組織包埋樣品的熒光控制方法，其目的在于通過對(duì)光敏感的光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記生物組織包埋樣品使用特定波長的激活光激活樣品表層光控?zé)晒獾鞍?，再通過相應(yīng)波長的激發(fā)光激發(fā)樣品表層的熒光蛋白，實(shí)現(xiàn)光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記生物組織包埋樣品的表層熒光的控制，且通過優(yōu)化熒光控制條件來使其表層激活厚度更薄，并將之應(yīng)用于熒光層析成像，表層被激活的厚度即為層析成像時(shí)的軸向分辨率，由此解決現(xiàn)有技術(shù)的熒光蛋白標(biāo)記生物組織由于缺乏有效的熒光控制方法而在快速寬場熒光成像時(shí)由于層析能力差、軸向分辨率低，而高分辨的點(diǎn)掃描成像方法對(duì)于體積大的生物組織包埋樣品成像太慢的技術(shù)問題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記生物組織包埋樣品的熒光控制方法，用激活光激活樣品表層的光控?zé)晒獾鞍?，用激發(fā)光激發(fā)所述表層的光控?zé)晒獾鞍走M(jìn)而發(fā)出熒光。優(yōu)選地，所述光控?zé)晒獾鞍诪楣饧せ顭晒獾鞍谆蚬廪D(zhuǎn)換熒光蛋白。優(yōu)選地，所述表層的厚度為0.5～5微米。優(yōu)選地，所述激活光為與所述光控?zé)晒獾鞍灼ヅ涞奶囟úㄩL的激活光。優(yōu)選地，所述激發(fā)光為與所述光控?zé)晒獾鞍灼ヅ涞奶囟úㄩL的激發(fā)光。優(yōu)選地，所述激活光的方向和樣品上表面的夾角為0～90°。優(yōu)選地，所述激活光的方向和樣品上表面的夾角為15°～30°。優(yōu)選地，所述生物組織包埋樣品的包埋劑優(yōu)選為樹脂。優(yōu)選地，所述樹脂為丙烯酸樹脂。優(yōu)選地，所述包埋劑中添加有吸收光的物質(zhì)。優(yōu)選地，所述吸收光的物質(zhì)為蘇丹黑?？傮w而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果。(1)本發(fā)明提供的光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記生物組織包埋樣品的熒光控制方法，通過選擇合適的激活光和激發(fā)光的波長范圍，同時(shí)控制合適的激活方向和樣品上表面的夾角，實(shí)現(xiàn)光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記生物組織包埋樣品表層熒光的精準(zhǔn)控制，激活方便，控制效果好；(2)本發(fā)明的熒光控制方法激活時(shí)只激活生物組織包埋樣品表層的熒光，應(yīng)用于生物組織包埋樣品的熒光層析成像時(shí)，激發(fā)光激發(fā)被激活表層而進(jìn)行熒光成像，樣品被激活表層的厚度即為熒光成像的軸向分辨率，通過優(yōu)化熒光控制條件，包括優(yōu)選激活光的波長、控制激活光與樣品的夾角以及采用包埋劑中添加吸收光的物質(zhì)來控制被激活表層的厚度，厚度可以低至1～2微米甚至更低，有望實(shí)現(xiàn)高分辨層析成像；(3)在用激活光激活光控?zé)晒獾鞍讜r(shí)，只激活包埋樣品的表層，而表層以下沒有被激活光激活，因此表層以下組織即使吸收了后續(xù)的激發(fā)光也無法發(fā)出熒光，從而避免了后續(xù)寬場成像時(shí)組織表層以下非焦面熒光的干擾；(4)本發(fā)明的熒光控制方法應(yīng)用于生物組織包埋樣品的熒光成像時(shí)，由于不存在焦面以下熒光的干擾，因此可以用于高通量面成像，即快速寬場成像，另外由于表層激活厚度即軸向分辨率可以達(dá)到1～2微米，甚至更薄，因此本發(fā)明的熒光控制方法應(yīng)用于熒光層析成像時(shí)，同時(shí)具備了寬場成像的高速度以及與點(diǎn)掃描成像近似的高分辨，實(shí)現(xiàn)了大體積生物組織包埋樣本的快速高分辨成像。附圖說明圖1是光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記生物組織包埋樣品熒光控制并成像的示意圖，其中①表示激活光，②表示激發(fā)光，③表示樣品，④表示激發(fā)和成像物鏡，⑤表示已激活樣品表層；圖2是實(shí)施例1所用光控?zé)晒獾鞍准せ罴ぐl(fā)前后熒光強(qiáng)度對(duì)比圖；圖2(A)為實(shí)施例1激活前激發(fā)的熒光強(qiáng)度；圖2(B)為實(shí)施例1激活后激發(fā)的熒光強(qiáng)度，其中激活光波長為405nm；圖3是實(shí)施例2所用光控?zé)晒獾鞍准せ罴ぐl(fā)前后熒光強(qiáng)度對(duì)比圖；圖3(A)為實(shí)施例2激活前激發(fā)的熒光強(qiáng)度；圖3(B)為實(shí)施例2激活后激發(fā)的熒光強(qiáng)度。在所有附圖中，相同的附圖標(biāo)記用來表示相同的元件或結(jié)構(gòu)，其中圖2的比例尺代表20微米。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。本發(fā)明提供的光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記生物組織的熒光控制方法，并應(yīng)用于生物組織包埋樣品的層析成像時(shí)，包括以下步驟：一、樣本包埋將光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記的生物組織用包埋劑包埋，包埋的具體過程參照包埋劑商品說明書或者公開文獻(xiàn)資料的一般步驟。所述生物組織包埋樣品的包埋劑優(yōu)選為樹脂，所述樹脂優(yōu)選為丙烯酸樹脂，包括HM20(lowicryls丙烯酸鹽類樹脂)、HM23(lowicryls丙烯酸鹽類樹脂)、T9100、倫敦白膠(LRwhite)等。二、不同方向激活激發(fā)圖1是光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記生物組織包埋樣品熒光控制并成像的示意圖，其中①表示激活光，②表示激發(fā)光，③表示樣品，④表示激發(fā)和成像物鏡，⑤表示已激活樣品表層。將所述生物組織包埋樣品在非成像光路上用激活光激活樣品表層的光控?zé)晒獾鞍椎臒晒猓缓笤诔上窆饴飞嫌脤?duì)應(yīng)波長的激發(fā)光激發(fā)該熒光蛋白的熒光并成像。所述成像光路指接收發(fā)射光譜(即熒光信號(hào))的光路，所述非成像光路指成像光路之外的其他光路。所述“激活”是指，光控?zé)晒獾鞍自谔囟úㄩL激發(fā)光的激發(fā)下，幾乎不發(fā)某個(gè)波段的熒光，只有經(jīng)過另外某個(gè)波長的“激活光”激活后，開啟了熒光蛋白，使之接受特定波長“激發(fā)光”激發(fā)從而發(fā)出熒光。而“激發(fā)”是指熒光蛋白吸收某個(gè)波長的光發(fā)出熒光的過程。標(biāo)記生物組織的光控?zé)晒獾鞍装ü饧せ顭晒獾鞍?PhotoactivatableFPs，PAFPs)中的一種或多種，如PAGFP、PAmCherry1等；或者光轉(zhuǎn)換熒光蛋白(photoswitchableFPs，rsFPs)中的一種或多種，如Dendra2、mEos3.1等。所述激活光為與所述光控?zé)晒獾鞍灼ヅ涞奶囟úㄩL的激活光。所述激發(fā)光為與所述光控?zé)晒獾鞍灼ヅ涞奶囟úㄩL的激發(fā)光。所述的激活光的方向和所述樣品上表面的夾角為0～90°，優(yōu)選為15～30°。通過調(diào)節(jié)激活光與樣品上表面(即成像層或已激活樣品表層)的夾角，可以控制合適的激活厚度。激活光與樣品上表面的夾角可以在0度到90度范圍內(nèi)，15°～30°有利于激活更薄厚度的表層。當(dāng)激活光與樣品上表面的夾角為0°時(shí)，激活光平行于樣品上表層，此時(shí)需要對(duì)樣品進(jìn)行透明化處理，采用類似光片照明的方法從側(cè)面激活樣品表層。當(dāng)激活光與樣品上表面的夾角為90°時(shí)，激活光垂直照射樣品上表面，激活厚度相比于夾角15°～30°時(shí)的激活深度度更深一些。本發(fā)明的熒光控制方法通過選擇與所述光控?zé)晒獾鞍紫蚱ヅ涞募せ罟馀c激發(fā)光的波長，并且通過控制合適的激活光的方向，即激活光與樣品上表面的方向，使得在用特定波長的激活光激活光控?zé)晒獾鞍讜r(shí)，只有樣品表層的熒光蛋白被激活。激活光只能激活樣品的表層，原因有二：一是激活光相對(duì)于激發(fā)光來說，一般波長更短，其穿透組織的能力差一些，因此激活光只能穿透激活更表層的熒光蛋白；二是激活光的激活可以控制激活光與被激活樣品的角度，角度越小，表面反射越強(qiáng)，這樣深層的激活光不僅進(jìn)入的少了，而且進(jìn)入的能量密度低了。另外，也可以通過在樣品的包埋劑中添加吸收光的物質(zhì)，這樣當(dāng)激活光激活樣品時(shí)，即使激活光穿透組織進(jìn)入深層組織，吸收光的物質(zhì)會(huì)將其吸收而得不到激活，吸收光的物質(zhì)優(yōu)選為蘇丹黑。在包埋劑中添加蘇丹黑，蘇丹黑在包埋劑中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)優(yōu)選為0.05％～0.5％，優(yōu)選為0.3％。每一種光控?zé)晒獾鞍子信c其相匹配的最優(yōu)激活波長，選擇波長較短的激活光時(shí)，需要選擇最優(yōu)激活波長附近的較短波長的激活光，這樣同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)高效率和最佳厚度的樣品表層激活。對(duì)于光控?zé)晒獾鞍譖AGFP和mEos3.1，其激活波長都在近紫外區(qū)，最優(yōu)波長都在405nm。當(dāng)采用這兩種熒光蛋白標(biāo)記生物組織并采用本發(fā)明的熒光控制方法激活樣品表層時(shí)，優(yōu)選波長都為405nm的激活光。本發(fā)明選擇在樣品的非成像光路上，用激活光激活樣品表層的光控?zé)晒獾鞍?，然后在成像光路上用?duì)應(yīng)波長的激發(fā)光激發(fā)該熒光蛋白并成像，這樣來實(shí)現(xiàn)樣品的表層成像。對(duì)于光激活熒光蛋白，其本身并不發(fā)熒光，可以通過控制激活光波長、激活光和樣品夾角以及樹脂中添加蘇丹黑B等吸收光的物質(zhì)來控制只有表層被激活，因此激發(fā)光激發(fā)時(shí)表層以下也不會(huì)發(fā)出熒光，這樣表層熒光成像時(shí)表層以下不存在背景熒光，即焦面以下熒光干擾的問題。對(duì)于光轉(zhuǎn)換熒光蛋白，其本身發(fā)出特定波長的熒光，比如mEos3.1發(fā)綠色熒光，通過光轉(zhuǎn)換使之顯紅色，可以通過控制激活光波長、激活光和樣品夾角以及樹脂中添加蘇丹黑B等吸收光的物質(zhì)，使這種光轉(zhuǎn)換只發(fā)生在樣品表層，使表層發(fā)出紅色熒光。當(dāng)對(duì)表層紅色的熒光進(jìn)行成像時(shí)，由于表層以下仍顯綠色，對(duì)于接收紅色波段信號(hào)來說就不存在背景的綠色熒光干擾的問題。三、層析成像將本發(fā)明的熒光控制方法應(yīng)用于層析成像技術(shù)時(shí)，由于本發(fā)明的熒光控制方法可以精確控制樣品表層被激活的厚度，被激活的表層經(jīng)激發(fā)光的激發(fā)進(jìn)行表層熒光成像，表層熒光圖像得到以后，可以通過切削掉成像過的樣品表層，再用激活光激活新的表層，然后再用激發(fā)光激發(fā)已激活的新的表層熒光并采集發(fā)射的熒光信號(hào)進(jìn)行成像，之后再重復(fù)“切削”、“激活光激活”、“激發(fā)成像”的過程，如此反復(fù)斷層成像直至獲取整個(gè)樣品的所有二維圖像。所獲取的二維圖像可以通過自動(dòng)配準(zhǔn)等方法疊加從而獲取光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記生物組織的完整三維圖像。本發(fā)明的熒光控制方法激活時(shí)只有樣品的表層被激活，表層被激活的厚度即為熒光層析成像的軸向分辨率，可以通過控制激活光波長、激活光和樣品上表面的夾角以及包埋樹脂中添加蘇丹黑B等吸收光的物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)盡可能薄的表層厚度。本發(fā)明的熒光控制方法得到被激活表層的厚度可以低至1～2微米甚至更低，因此本發(fā)明的光控?zé)晒獾鞍讟?biāo)記的生物組織包埋樣品的熒光控制方法應(yīng)用于樣品的層析成像時(shí)，可以獲得微米級(jí)甚至更低的軸向分辨率，另外由于不存在背景干擾的問題，可以采用寬場成像的模式實(shí)現(xiàn)高通量的成像，對(duì)于大體積的生物樣品這種高通量的優(yōu)勢(shì)更加凸顯，因此解決了現(xiàn)有光學(xué)成像技術(shù)分辨率低、對(duì)于體積大的生物組織樹脂包埋樣品成像太慢的技術(shù)問題。以下為實(shí)施例：實(shí)施例1mEos3.1是一種常見的光轉(zhuǎn)換熒光蛋白。其光學(xué)特性是，未在紫外405nm波長激活之前，只發(fā)綠色熒光(激發(fā)波長488nm)，不發(fā)紅色熒光；經(jīng)過紫外405nm波長短時(shí)間激活后，在561nm激發(fā)光下，發(fā)紅色熒光(發(fā)射光譜在550nm以上)。大腦皮層注射有Rv-dg-mEos3.1的小鼠全腦的包埋及光片熒光控制方法及熒光層析成像，包括以下步驟：(1)樣本固定將Rv-dg-mEos3.1感染的小鼠全腦用化學(xué)固定手段固定，得到固定的mEos3.1標(biāo)記的生物組織。具體步驟如下：在4攝氏度下，將心臟灌流后，解剖出的小鼠全腦經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的PFA溶液浸泡約12小時(shí)，PFA溶液用量為20ml每只，然后用PBS溶液漂洗三次，每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗四小時(shí)。(2)樣本脫水將固定的mEos3.1標(biāo)記的小鼠全腦用乙醇置換，使得所述生物組織脫水，得到脫水后的mEos3.1標(biāo)記的小鼠全腦。具體步驟為：在4攝氏度下，將固定的mEos3.1標(biāo)記的小鼠全腦依次通過梯度乙醇雙蒸水溶液20ml，浸泡2小時(shí)，進(jìn)行脫水。乙醇雙蒸水溶液濃度梯度為乙醇按照體積百分比為50％，75％，95％，100％，100％。(3)包埋劑滲透處理將脫水后的mEos3.1標(biāo)記的小鼠全腦進(jìn)行HM20包埋劑滲透處理，獲得HM20包埋劑工作液填充的mEos3.1標(biāo)記的小鼠全腦。具體步驟為：在4攝氏度下，將脫水后的mEos3.1標(biāo)記的小鼠全腦依次通過梯度HM20的二甲苯溶液5ml以上，進(jìn)行包埋劑滲透。HM20的二甲苯溶液梯度為HM20按照體積百分比為50％，75％，100％，100％，100％，100％，前三個(gè)梯度每個(gè)梯度浸泡2小時(shí)，第四組和第五組各浸泡24小時(shí)，第六組浸泡14小時(shí)。(4)包埋劑聚合使所述HM20包埋劑發(fā)生聚合反應(yīng)，獲得mEos3.1標(biāo)記的生物組織的樹脂包埋樣品。具體步驟為：將1.1mL的HM2O包埋劑工作液注入安裝在底座上的9mm口徑的明膠膠囊，然后將HM20包埋劑工作液填充的mEos3.1標(biāo)記的小鼠全腦放入膠囊中，調(diào)整好位置并蓋上膠囊蓋子，移入真空干燥箱中進(jìn)行梯度升溫聚合：37攝氏度12小時(shí)，42攝氏度3小時(shí)，45攝氏度12小時(shí)，50攝氏度3小時(shí)。(5)激活激發(fā)光控?zé)晒獾鞍讓⑺鰳渲裥∈笕X樣品的表層切削平整后，用紫外405nm波長激活光激活樣品表層，激活表層厚度為3～4um，然后用561nm激發(fā)光激發(fā)熒光并成像，激活光方向和樣品的夾角為30°。激活光激活處理前和激活處理后分別激發(fā)的熒光亮度如圖2所示。圖2A為沒有用405nm激活光激活而采用561nm激發(fā)光去激發(fā)觀察到的熒光信號(hào)結(jié)果，可以看出如果沒有用405nm激活光激活，即使用561nm激發(fā)光去激發(fā)，也沒有任何真熒光信號(hào)(散布的亮度只是干擾噪聲)；圖2B為經(jīng)過405nm激活光激活后，再使用561nm激發(fā)光激發(fā)得到的熒光信號(hào)結(jié)果圖，可以看出經(jīng)過405nm激活光激活后，mEos3.1可以被561nm激發(fā)光激發(fā)出明亮的紅色熒光，圖2B顯示出了一個(gè)神經(jīng)元的胞體形態(tài)。實(shí)施例2過表達(dá)PAGFP的Hela細(xì)胞包埋后熒光控制方法，包括以下步驟：(1)樣本固定將過表達(dá)PAGFP的Hela細(xì)胞用化學(xué)固定手段固定，得到固定的PAGFP標(biāo)記的生物組織。具體步驟如下：在4攝氏度下，將Hela細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的PFA溶液浸泡約12小時(shí)，然后用PBS溶液漂洗3次，每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗1小時(shí)。(2)樣本脫水將固定的PAGFP標(biāo)記的Hela細(xì)胞用乙醇置換，使得所述樣本脫水，得到脫水后的PAGFP標(biāo)記的細(xì)胞樣本。具體步驟為：在4攝氏度下，將固定的PAGFP標(biāo)記的Hela細(xì)胞依次通過梯度乙醇雙蒸水溶液20ml，浸泡2小時(shí)，進(jìn)行脫水。乙醇雙蒸水溶液濃度梯度為乙醇按照體積百分比為50％，75％，95％，100％，100％。(3)包埋劑滲透處理將脫水后的PAGFP標(biāo)記的小鼠全腦進(jìn)行HM20包埋劑滲透處理，獲得HM20包埋劑工作液填充的PAGFP標(biāo)記的細(xì)胞樣本。具體步驟為：在4攝氏度下，將脫水后的PAGFP標(biāo)記的Hela細(xì)胞依次通過梯度HM20的二甲苯溶液5ml，進(jìn)行包埋劑滲透。HM20的二甲苯溶液梯度為HM20按照體積百分比為50％，75％，100％，100％，100％，100％，前三個(gè)梯度每個(gè)梯度浸泡2小時(shí)，第四組和第五組各浸泡24小時(shí)，第六組浸泡14小時(shí)。(4)包埋劑聚合使所述HM20包埋劑發(fā)生聚合反應(yīng)，獲得PAGFP標(biāo)記的樹脂包埋的細(xì)胞樣本。具體步驟為：將HM2O包埋劑工作液滴到長有Hela細(xì)胞的玻片上面，然后將該玻片蓋上蓋玻片，移入真空干燥箱中進(jìn)行梯度升溫聚合：37攝氏度12小時(shí)，42攝氏度3小時(shí)，45攝氏度12小時(shí)，50攝氏度3小時(shí)。(5)激活激發(fā)光控?zé)晒獾鞍讓⑺鰳渲竦腍ela細(xì)胞樣品，用激活光405nm激光激活樣品表層，然后用激發(fā)光504nm激光激發(fā)熒光并成像，激活光方向和樣品方向夾角為15°。使用激光器激活激發(fā)PAGFP后，熒光亮度增加倍數(shù)顯著，從幾乎沒有熒光到所有表達(dá)PAGFP的細(xì)胞都非常明亮，激活表層的厚度為1～2um。實(shí)施例3過表達(dá)PAGFP的Hela細(xì)胞包埋后熒光控制方法，包括以下步驟：(1)樣本固定將過表達(dá)PAGFP的Hela細(xì)胞用化學(xué)固定手段固定，得到固定的PAGFP標(biāo)記的生物組織。具體步驟如下：在4攝氏度下，將Hela細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的PFA溶液浸泡約12小時(shí)，然后用PBS溶液漂洗3次，每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗1小時(shí)。(2)樣本脫水將固定的PAGFP標(biāo)記的Hela細(xì)胞用乙醇置換，使得所述樣本脫水，得到脫水后的PAGFP標(biāo)記的細(xì)胞樣本。具體步驟為：在4攝氏度下，將固定的PAGFP標(biāo)記的Hela細(xì)胞依次通過梯度乙醇雙蒸水溶液20ml，浸泡2小時(shí)，進(jìn)行脫水。乙醇雙蒸水溶液濃度梯度為乙醇按照體積百分比為50％，75％，95％，100％，100％。(3)包埋劑滲透處理將脫水后的PAGFP標(biāo)記的小鼠全腦進(jìn)行HM20包埋劑滲透處理，其中包埋劑中含0.3％質(zhì)量分?jǐn)?shù)蘇丹黑B，獲得HM20包埋劑工作液填充的PAGFP標(biāo)記的細(xì)胞樣本。具體步驟為：在4攝氏度下，將脫水后的PAGFP標(biāo)記的Hela細(xì)胞依次通過梯度HM20的二甲苯溶液5ml，進(jìn)行包埋劑滲透。HM20的二甲苯溶液梯度為HM20按照體積百分比為50％，75％，100％，100％，100％，100％，前三個(gè)梯度每個(gè)梯度浸泡2小時(shí)，第四組和第五組各浸泡24小時(shí)，第六組浸泡14小時(shí)，其中第三到第六組所用100％HM20溶液均含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3％的蘇丹黑B。(4)包埋劑聚合使所述HM20包埋劑發(fā)生聚合反應(yīng)，獲得PAGFP標(biāo)記的樹脂包埋的細(xì)胞樣本。具體步驟為：將HM2O包埋劑工作液滴到長有Hela細(xì)胞的玻片上面，然后將該玻片蓋上蓋玻片，移入真空干燥箱中進(jìn)行梯度升溫聚合：37攝氏度12小時(shí)，42攝氏度3小時(shí)，45攝氏度12小時(shí)，50攝氏度3小時(shí)。(5)激活激發(fā)光控?zé)晒獾鞍讓⑺鰳渲竦腍ela細(xì)胞樣品，用激活光405nm激光激活樣品表層，然后用激發(fā)光504nm激光激發(fā)熒光并成像，激活光方向和樣品方向夾角為15°。激活光激活處理前和激活處理后分別激發(fā)的熒光亮度如圖3A和圖3B所示。使用激光器激活激發(fā)PAGFP后，熒光亮度增加倍數(shù)顯著，從幾乎沒有熒光到所有表達(dá)PAGFP的細(xì)胞都非常明亮，激活表層的厚度為1～2um。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3