本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種利用核酸適配體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換策略調(diào)控石墨烯量子點(diǎn)的聚集狀態(tài)，從而調(diào)控?zé)晒庑盘?hào)的淬滅和恢復(fù)來檢測霉菌毒素的方法。

背景技術(shù)：

霉菌毒素(mycotoxins)主要是指霉菌在其所污染的食品中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，是一種存在飼料和原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，是毒素很強(qiáng)的霉菌次生代謝產(chǎn)物。它們可通過飼料或食品進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，引起人和動(dòng)物的急性或慢性毒性，損害機(jī)體的肝臟、腎臟、神經(jīng)組織、造血組織及皮膚組織等，

赭曲霉素A(Ochratoxin A)，簡稱OTA，是曲霉素和青霉素的某些菌種產(chǎn)生的一組有毒代謝產(chǎn)物，對(duì)人和動(dòng)物都具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC將其定為IIB類致癌物。據(jù)報(bào)道，在全球范圍內(nèi)，赭曲霉素A對(duì)農(nóng)作物的污染都比較嚴(yán)重，廣泛存在于谷類(比如小麥、大麥、燕麥、玉米等)、豆類、香料、花生、咖啡豆和干果中，在飲料中(比如啤酒、葡萄酒、葡萄汁等)也可以檢測到OTA，葡萄酒中OTA由Zimmerli Brand等在1995年首次檢測出。歐洲整體膳食評(píng)估中心對(duì)食品中OTA進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)歐洲人從谷物中攝取到的OTA含量占到總攝取量的50％，而葡萄酒以13％僅次于谷物。因此，OTA在葡萄酒中的污染日趨受到人們的關(guān)注。葡萄酒作為一種健康時(shí)尚的飲品，在全世界都非常受歡迎，有著非常大的消費(fèi)量。目前，葡萄酒在我國也已經(jīng)受到越來越多人的喜愛，而且成為逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)白酒的健康飲品。我國葡萄酒的生產(chǎn)量和消費(fèi)量均逐年增加。因此，建立一種葡萄酒中赭曲霉素A的檢測方法有著重要的意義。

適配體作為一種可以和目標(biāo)物進(jìn)行高特異性結(jié)合的單鏈寡核普酸，和抗體相比，適配體更易于合成和標(biāo)記，穩(wěn)定性和選擇性更好，結(jié)合親和力更高，因此適配體的應(yīng)用越來越廣泛。其中OTA的適配體于2008年被Cruz-Aguado和Penner成功篩選，并將其應(yīng)用于OTA的檢測。

常用的檢測霉菌毒素的方法包括高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、抗體抗原、電化學(xué)方法等。以上檢測方法需要一定的操作過程如復(fù)雜的檢測樣品前處理，同時(shí)需較長時(shí)間檢測分析樣品，而且存在所用檢測的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備比較復(fù)雜昂貴等問題。而基于核酸適配體構(gòu)建熒光傳感器的方法，受限于傳統(tǒng)熒光染料基團(tuán)的光穩(wěn)定性差等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測霉菌毒素尤其赭曲霉素A的熒光傳感器及其制備方法，基于石墨烯量子點(diǎn)在聚集和解聚狀態(tài)下熒光信號(hào)的淬滅和恢復(fù)以及核酸適配體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換策略來快速、簡便的檢測霉菌毒素如赭曲霉素A。該方法對(duì)霉菌毒素如赭曲霉素A的檢測靈敏度高、特異性好。在一定的濃度范圍內(nèi)(如對(duì)赭曲霉素A在0-1ng/mL的濃度范圍內(nèi)，)檢測呈現(xiàn)良好的線性響應(yīng)，以及較低的檢測限，例如赭曲霉素A檢測限為13pg/mL。

一種霉菌毒素的熒光適配體傳感器:在兩組石墨烯量子點(diǎn)表面分別修飾上霉菌毒素對(duì)應(yīng)的核酸適配體DNA和與適配體DNA互補(bǔ)的探針DNA，通過DNA雜交使石墨烯量子點(diǎn)聚集，發(fā)生激子能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致石墨烯量子點(diǎn)熒光信號(hào)淬滅；隨后加入霉菌毒素，霉菌毒素與核酸適配體DNA特異性結(jié)合，結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，引起石墨烯量子點(diǎn)聚集體解組裝而重新分散，體系熒光強(qiáng)度恢復(fù)。

上述的霉菌毒素包括但不限于赭曲霉素A、黃曲霉毒素B1、玉米烯酮和赭曲霉素等，只要符合上述條件的均能作為霉菌毒素的熒光適配體傳感器。

本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種檢測霉菌毒素的熒光適配體傳感器的應(yīng)用方法，包括以下步驟：

(1)DNA雜交使石墨烯量子點(diǎn)聚集，熒光信號(hào)猝滅：首先利用TE緩沖液分別離心溶解粉末狀霉菌毒素對(duì)應(yīng)的適配體DNA以及與適配體DNA互補(bǔ)的探針DNA；然后通過水熱法合成出石墨烯量子點(diǎn)，并在兩組石墨烯量子點(diǎn)表面分別修飾霉菌毒素適配體DNA以及探針DNA，然后將表面修飾有霉菌毒素適配體DNA的石墨烯量子點(diǎn)溶液和表面修飾有探針DNA的石墨烯量子點(diǎn)溶液混合，通過DNA雜交引起石墨烯量子點(diǎn)發(fā)生聚集，熒光信號(hào)猝滅；

(2)霉菌毒素?zé)晒鈾z測：把不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的霉菌毒素加入到步驟(1)熒光信號(hào)淬滅的溶液中，在室溫條件下孵育一段時(shí)間，設(shè)定熒光分光光度計(jì)激發(fā)發(fā)射波長及入射發(fā)射狹縫，取孵育好的反應(yīng)溶液加入石英比色皿中檢測，得出不同濃度的霉菌毒素對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，制備出曲線；

(3)檢測待測霉菌毒素的方法，步驟如下：把含霉菌毒素的樣品加入到對(duì)應(yīng)的石墨烯量子點(diǎn)熒光信號(hào)淬滅溶液中，在室溫條件下孵育一段時(shí)間，設(shè)定與步驟(2)一樣的熒光分光光度計(jì)激發(fā)發(fā)射波長及入射發(fā)射狹縫，取孵育好的反應(yīng)溶液加入石英比色皿中檢測，得出霉菌毒素的熒光強(qiáng)度，根據(jù)步驟(2)霉菌毒素濃度和熒光強(qiáng)度的關(guān)系曲線，得出待測霉菌毒素的濃度，進(jìn)一步計(jì)算轉(zhuǎn)換成含霉菌毒素的樣品中霉菌毒素的含量。

所述步驟(1)中所述的TE緩沖液優(yōu)選組成為40mMTris,2mM EDTA,pH＝7.4。

所述步驟(1)中如赭曲霉素A適配體DNA結(jié)構(gòu)優(yōu)選為5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-C₆H₁₂-NH₂-3’；互補(bǔ)的探針DNA結(jié)構(gòu)優(yōu)選為5’-NH₂-C₆H₁₂-TGTCCGATGCT-3’(可購自上海Sangon生物技術(shù)有限公司合成并分裝的)，使用前加入緩沖液離心溶解，離心速度優(yōu)選為10000rpm，時(shí)間10min。

步驟(2)熒光分光光度計(jì)激發(fā)發(fā)射波長為315nm，入射發(fā)射狹縫為5.0nm，發(fā)射譜檢測范圍為375-600nm。赭曲霉素A的標(biāo)準(zhǔn)濃度為0-20ng/mL。

所述步驟(1)中石墨烯量子點(diǎn)表面修飾霉菌毒素適配體DNA或探針DNA的方法，步驟如下：合成出的石墨烯量子點(diǎn)溶液，然后加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，調(diào)節(jié)溶液pH為5，反應(yīng)一段時(shí)間后，加入霉菌毒素適配體DNA或探針DNA，調(diào)節(jié)溶液pH為7.4，再反應(yīng)一段時(shí)間。

進(jìn)一步優(yōu)選：合成出0.1mg/mL的石墨烯量子點(diǎn)溶液，加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，調(diào)節(jié)溶液pH為5，反應(yīng)30min后，均分裝在兩個(gè)容器中，分別加入霉菌毒素適配體DNA溶液以及與適配體DNA互補(bǔ)的探針DNA溶液，霉菌毒素適配體DNA溶液以及與適配體DNA互補(bǔ)的探針DNA溶液濃度均為100μM，調(diào)節(jié)溶液pH為7.4，反應(yīng)2h，石墨烯量子點(diǎn)溶液：N-羥基琥珀酰亞胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽：霉菌毒素適配體DNA溶液：與適配體DNA互補(bǔ)的探針DNA溶液為10mL：(20-25)mg：(18-20mg)：24μL：24μL。

本發(fā)明中，采用水熱法合成了分散性良好、粒徑均勻的石墨烯量子點(diǎn)，并在其表面分別修飾上霉菌毒素(如赭曲霉素A)核酸適配體DNA以及與其互補(bǔ)的短鏈探針DNA，將這兩種石墨烯量子點(diǎn)進(jìn)行混合，通過DNA雜交使石墨烯量子點(diǎn)聚集，發(fā)生激子能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致石墨烯量子點(diǎn)熒光信號(hào)淬滅；隨后加入目標(biāo)檢測物霉菌毒素(如赭曲霉素A)，其與核酸適配體DNA特異性結(jié)合，結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，與短鏈探針DNA脫離，引起石墨烯量子點(diǎn)聚集體解組裝而重新分散，體系熒光強(qiáng)度恢復(fù)。

本發(fā)明所述的用于檢測霉菌毒素(如赭曲霉素A)的熒光傳感器的制備方法，過程簡單易行、綠色環(huán)保、成本低、靈敏度高、特異性好，并成功用于實(shí)際紅酒樣品中赭曲霉素A的加標(biāo)回收。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述的基于適配體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換誘導(dǎo)石墨烯量子點(diǎn)由聚集到分散的熒光化學(xué)傳感器對(duì)霉菌毒素檢測的示意圖；

圖2為實(shí)施例1加入不同濃度赭曲霉素A后體系熒光強(qiáng)度發(fā)射曲線；

圖3根據(jù)實(shí)施例1不同赭曲霉素A濃度和熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制的擬合曲線；

圖4為實(shí)施例1同一濃度不同底物下的特異性柱狀圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明書，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

一種檢測赭曲霉素A的熒光適體傳感器：

(1)DNA雜交使石墨烯量子點(diǎn)聚集，熒光信號(hào)猝滅：首先利用TE緩沖液離心溶解粉末狀赭曲霉素A適配體DNA以及與其互補(bǔ)的短鏈探針DNA，然后通過水熱法合成出石墨烯量子點(diǎn)，并在其表面分別修飾赭曲霉素A適配體DNA以及與其互補(bǔ)的短鏈探針DNA，將兩種石墨烯量子點(diǎn)溶液混合，通過DNA雜交引起石墨烯量子點(diǎn)發(fā)生聚集，熒光信號(hào)猝滅；

(2)赭曲霉素A熒光檢測：把不同濃度的赭曲霉素A加入到淬滅溶液中，在室溫條件下孵育1h，設(shè)定熒光分光光度計(jì)激發(fā)發(fā)射波長及入射發(fā)射狹縫，取孵育好的反應(yīng)溶液加入石英比色皿中檢測，得出不同濃度的赭曲霉素A的熒光強(qiáng)度，根據(jù)不同濃度的赭曲霉素A的熒光強(qiáng)度，擬合出公式y(tǒng)＝73.55+114.3x，其中y為赭曲霉素A的熒光強(qiáng)度，x為赭曲霉素A的濃度。

TE緩沖液pH 7.4、緩沖液組成為40mMTris,2mM EDTA；赭曲霉素A適配體DNA結(jié)構(gòu)為5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-C6H12-NH2-3’；互補(bǔ)的短鏈探針DNA結(jié)構(gòu)為5’-NH2-C6H12-TGTCCGATGCT-3’,由上海Sangon生物技術(shù)有限公司合成并分裝。使用前加入緩沖液離心溶解，離心速度為10000rpm，時(shí)間10min。熒光分光光度計(jì)激發(fā)發(fā)射波長為315nm，入射發(fā)射狹縫為5.0nm，發(fā)射譜檢測范圍為375-600nm，赭曲霉素A的濃度為0-20ng/mL。

所述的石墨烯量子點(diǎn)修飾赭曲霉素A適配體DNA以及與適配體DNA互補(bǔ)的探針DNA的方法，具體步驟如下：10mL合成出的石墨烯量子點(diǎn)溶液(0.1mg/mL)，加入N-羥基琥珀酰亞胺22mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽19mg，調(diào)節(jié)溶液pH為5，反應(yīng)30min后，分裝在兩個(gè)燒瓶中，均為5mL，分別加入赭曲霉素A適配體DNA以及與適配體DNA互補(bǔ)的探針DNA，體積為24μL，調(diào)節(jié)溶液pH為7.4，反應(yīng)2h。

所述的檢測赭曲霉素A的方法，它的步驟如下：把含赭曲霉素A樣品加入到淬滅溶液中，在室溫條件下孵育1h，設(shè)定熒光分光光度計(jì)激發(fā)發(fā)射波長及入射發(fā)射狹縫，取400uL孵育好的反應(yīng)溶液加入石英比色皿中檢測，得出赭曲霉素A的熒光強(qiáng)度，根據(jù)公式y(tǒng)＝73.55+114.3x，得出赭曲霉素A的濃度。

1.原理驗(yàn)證及相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示，當(dāng)將霉菌毒素適配體修飾的石墨烯量子點(diǎn)aptamer-GQDs和互補(bǔ)的短鏈探針DNA修飾的石墨烯量子點(diǎn)cDNA-GQDs混合之后，通過DNA的雜交使得石墨烯量子點(diǎn)聚集，發(fā)生激子能量轉(zhuǎn)移，從而使石墨烯量子點(diǎn)的熒光信號(hào)猝滅。而后加入目標(biāo)檢測物霉菌毒素，其與核酸適配體DNA特異性結(jié)合，適配體DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，與短鏈探針DNA脫離，引起石墨烯量子點(diǎn)聚集體解組裝而重新分散，體系熒光強(qiáng)度恢復(fù)。

2.石墨烯量子點(diǎn)修飾赭曲霉素A適配體DNA以及與適配體DNA互補(bǔ)的探針DNA，具體步驟如下：10mL合成出的石墨烯量子點(diǎn)溶液(0.1mg/mL)，加入N-羥基琥珀酰亞胺22mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽19mg，調(diào)節(jié)溶液pH為5，反應(yīng)30min后，分裝在兩個(gè)燒瓶中，均為5mL，分別加入赭曲霉素A適配體DNA以及與適配體DNA互補(bǔ)的探針DNA，體積為24μL，調(diào)節(jié)溶液pH為7.4，反應(yīng)2h。

3.赭曲霉素A檢測實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:

A:取0.5ml的aptmater-GQDs溶液和等體積的cDNA-GQDs溶液，在室溫下混合均勻，孵育1h,使石墨烯量子點(diǎn)發(fā)生聚集,體系熒光信號(hào)猝滅；

B:取0.5mL完全猝滅的石墨烯量子點(diǎn),加入不同濃度赭曲霉素A，濃度分別為0ng/mL,0.05ng/mL,0.1ng/mL,0.2ng/mL,0.4ng/mL,0.6ng/mL,0.8ng/mL,1ng/mL,3ng/mL,5ng/mL,7ng/mL,9ng/mL,11ng/mL,15ng/mL,20ng/mL,室溫下混合均勻，孵育1h后檢測體系的熒光強(qiáng)度。

設(shè)定光熒光分光光度計(jì)激發(fā)波長315nm，入射發(fā)射狹縫均為5nm，發(fā)射波長檢測范圍為375-600nm，取孵育好的反應(yīng)溶液加入石英比色皿中檢測，得出不同濃度的赭曲霉素A的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見附圖2。根據(jù)不同濃度的赭曲霉素A的熒光強(qiáng)度，在發(fā)射波長433nm處，根據(jù)不同赭曲霉素A濃度和熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制曲線，結(jié)果見附圖3。

4.實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

本發(fā)明分別對(duì)實(shí)驗(yàn)中石墨烯量子點(diǎn)熒光猝滅和恢復(fù)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，在等體積的aptmater-GQDs溶液和cDNA-GQDs溶液混合均勻后，設(shè)計(jì)了孵育時(shí)間分別為10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min后檢測反應(yīng)液熒光強(qiáng)度；通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析本發(fā)明選擇最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件：熒光猝滅時(shí)間為40min，熒光恢復(fù)時(shí)間為30min。

5.特異性實(shí)驗(yàn)

在淬滅溶液中，加入20ng/mL的赭曲霉素A以及相同濃度的黃曲霉毒素B1,玉米烯酮和赭曲霉素B,在設(shè)定條件下檢測反應(yīng)溶液中熒光強(qiáng)度。其結(jié)果如圖4,可以看出本發(fā)明特異性很好。

6.實(shí)際紅酒樣品中赭曲霉素A的加標(biāo)回收

將赭曲霉素A樣品加入到稀釋為5％的紅葡萄酒樣品中，濃度分別為0.05ng/mL,0.1ng/mL,0.5ng/mL,1ng/mL。測定赭曲霉素A的熒光強(qiáng)度，根據(jù)公式y(tǒng)＝36.660+0.1474x，計(jì)算得出赭曲霉素A的濃度并與實(shí)際加入濃度進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果如表1所示，從表中可以看出，該傳感器的回收率處于92.4％-109.9％的合理范圍內(nèi)，表明該方法在實(shí)際樣品操作中具有很好的準(zhǔn)確度和可操作性。

表1為本發(fā)明所述的熒光傳感器在實(shí)際紅酒樣品中的加標(biāo)回收應(yīng)用；

表1