本發(fā)明涉及檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種甲砜霉素檢測方法。

背景技術(shù)：

甲砜霉素，用于敏感菌如流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、沙門菌屬等所致的呼吸道、尿路、腸道等感染。甲砜霉素的主要毒副作用是抑制造血機(jī)能，發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的再生障礙性貧血。人和幼齡動(dòng)物對甲砜霉素均非常敏感。歐盟、中國以及許多國家將甲砜霉素列為食品動(dòng)物禁用獸藥，在動(dòng)物性食品中規(guī)定甲砜霉素是不得檢出的。但是，一些違法使用甲砜霉素的現(xiàn)象非常嚴(yán)重，已經(jīng)造成嚴(yán)重國際影響。目前甲砜霉素殘留的檢測方法大致可分為3大類：微生物測定法、免疫分析法和化學(xué)方法。目前這些方法都不能避免乙酸乙酯提取過程中產(chǎn)生的乳化現(xiàn)象，會(huì)使得甲砜霉素的提取不完全，而目前一般采用內(nèi)標(biāo)法來避免這一問題帶來的檢測不準(zhǔn)確，但由于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)價(jià)格昂貴，檢測單個(gè)樣品成本會(huì)較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種重現(xiàn)性好、精密度高的甲砜霉素檢測方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種甲砜霉素檢測方法，包括以下步驟：

1）稱取1-5g待測樣品，加入10-20mL乙酸乙酯，渦旋混勻，超聲提取20min，10000r/min下離心8-20min，取上清液，于40℃±2℃氮?dú)獯蹈缮锨逡海频锰崛∥顰；

2）加入0.5-3mL甲醇溶解提取物A，接著加入3-8mL去離子水稀釋后渦旋混勻，再加入3-8mL正己烷，渦旋混勻，3000-4000r/min下離心3-10min，棄去上層液體，制得提取物B；

3）將提取物B過固相萃取柱，接著用3-10mL水淋洗，抽干，加入5-10mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃±2℃氮?dú)獯蹈桑?-5mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-20％的乙腈溶液溶解氮?dú)獯蹈珊蟮臍堄辔?，濾膜過濾，制得待測液；

4）利用液相色譜法測定。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：濾膜采用0.22μm微孔濾膜。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：液相色譜法采用甲醇、0.05mol/L的磷酸二氫鉀溶液、三乙胺為流動(dòng)相，且甲醇：0.05mol/L的磷酸二氫鉀溶液：三乙胺的質(zhì)量比例為20：80：0.05，混勻后用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：還包括制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用液相色譜儀分析標(biāo)準(zhǔn)液的色譜峰結(jié)果以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量甲砜霉素殘留。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測波長為 226nm；柱溫：30℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的檢測方法重現(xiàn)性好、精密度高、操作方便，能夠很好的檢測甲砜霉素的質(zhì)量，真正確保了臨床用藥的安全、有效、可控；本發(fā)明適用于甲砜霉素的質(zhì)量檢測。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

本發(fā)明實(shí)施例中，一種甲砜霉素檢測方法，包括以下步驟：

1）稱取1g待測樣品，加入10mL乙酸乙酯，渦旋混勻，超聲提取20min，10000r/min下離心8min，取上清液，于40℃±2℃氮?dú)獯蹈缮锨逡?，制得提取物A。

2）加入0.5mL甲醇溶解提取物A，接著加入3mL去離子水稀釋后渦旋混勻，再加入3mL正己烷，渦旋混勻，3000r/min下離心3min，棄去上層液體，制得提取物B。

3）將提取物B過固相萃取柱，接著用3mL水淋洗，抽干，加入5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃±2℃氮?dú)獯蹈?，?mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的乙腈溶液溶解氮?dú)獯蹈珊蟮臍堄辔?，渦旋混勻，0.22μm微孔濾膜過濾，制得待測液。

4）利用液相色譜法測定：液相色譜法采用甲醇、0.05mol/L的磷酸二氫鉀溶液、三乙胺為流動(dòng)相，且甲醇：0.05mol/L的磷酸二氫鉀溶液：三乙胺的質(zhì)量比例為20：80：0.05，混勻后用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測波長為 226nm；柱溫：30℃。

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用液相色譜儀分析標(biāo)準(zhǔn)液的色譜峰結(jié)果以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量甲砜霉素殘留。

實(shí)施例2

本發(fā)明實(shí)施例中，一種甲砜霉素檢測方法，包括以下步驟：

1）稱取5g待測樣品，加入20mL乙酸乙酯，渦旋混勻，超聲提取20min，10000r/min下離心20min，取上清液，于40℃±2℃氮?dú)獯蹈缮锨逡海频锰崛∥顰。

2）加入3mL甲醇溶解提取物A，接著加入8mL去離子水稀釋后渦旋混勻，再加入8mL正己烷，渦旋混勻，4000r/min下離心10min，棄去上層液體，制得提取物B。

3）將提取物B過固相萃取柱，接著用10mL水淋洗，抽干，加入10mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃±2℃氮?dú)獯蹈?，?mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的乙腈溶液溶解氮?dú)獯蹈珊蟮臍堄辔?，渦旋混勻，0.22μm微孔濾膜過濾，制得待測液。

4）利用液相色譜法測定：液相色譜法采用甲醇、0.05mol/L的磷酸二氫鉀溶液、三乙胺為流動(dòng)相，且甲醇：0.05mol/L的磷酸二氫鉀溶液：三乙胺的質(zhì)量比例為20：80：0.05，混勻后用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測波長為 226nm；柱溫：30℃。

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用液相色譜儀分析標(biāo)準(zhǔn)液的色譜峰結(jié)果以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量甲砜霉素殘留。

實(shí)施例3

本發(fā)明實(shí)施例中，一種甲砜霉素檢測方法，包括以下步驟：

1）稱取3g待測樣品，加入15mL乙酸乙酯，渦旋混勻，超聲提取20min，10000r/min下離心10min，取上清液，于40℃±2℃氮?dú)獯蹈缮锨逡海频锰崛∥顰。

2）加入2mL甲醇溶解提取物A，接著加入5mL去離子水稀釋后渦旋混勻，再加入5mL正己烷，渦旋混勻，4000r/min下離心5min，棄去上層液體，制得提取物B。

3）將提取物B過固相萃取柱，接著用8mL水淋洗，抽干，加入8mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃±2℃氮?dú)獯蹈?，?mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的乙腈溶液溶解氮?dú)獯蹈珊蟮臍堄辔?，渦旋混勻，0.22μm微孔濾膜過濾，制得待測液。

4）利用液相色譜法測定：液相色譜法采用甲醇、0.05mol/L的磷酸二氫鉀溶液、三乙胺為流動(dòng)相，且甲醇：0.05mol/L的磷酸二氫鉀溶液：三乙胺的質(zhì)量比例為20：80：0.05，混勻后用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測波長為 226nm；柱溫：30℃。

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用液相色譜儀分析標(biāo)準(zhǔn)液的色譜峰結(jié)果以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量甲砜霉素殘留。

1、實(shí)際樣品測定

選取了具有代表性的滅菌乳、乳粉、冰淇淋作為實(shí)際測定樣品，按前面相應(yīng)的樣品處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣測定。再分別加入0.5ng/mL、1.5ng/mL、2.5ng/mL甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣。

將已制備好的試樣液利用液相色譜儀分析標(biāo)準(zhǔn)液的色譜峰結(jié)果以及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

得出樣品中定量檢出限為(以乳計(jì))：甲砜霉素檢出限：0.1μg/kg。

選用上述樣品加入甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率測定，回收率范圍在62％～100％之間，符合《GB/T27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量恐控制規(guī)范食品理化檢測》的要求。

制備甲砜霉素的陽性樣品作為待測樣品，重復(fù)測試6次，精密度范圍在0.01～15％，符合《GB/T27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量恐控制規(guī)范食品理化檢測》。

利用上述方法測得乳粉中甲砜霉素測定值為0.256，滅菌乳中甲砜霉素測定值為0.136，冰淇淋中甲砜霉素測定值為0.108。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。