本發(fā)明屬于中藥成分分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定大青葉中11種有效成分含量的方法。

背景技術(shù)：

大青葉為十字花科(Cruciferae)菘藍(lán)屬(Isatis)兩年生草本植物菘藍(lán)(Isatis indigotica Fort.)的干燥葉，是常見(jiàn)的大宗藥材之一，主要分布于陜西、甘肅、河北、江蘇等地。大青葉的有效成分主要包括核苷、生物堿、有機(jī)酸等，核苷類成分，具有活血化瘀之功效，4(3H)-喹唑酮、色胺酮、靛玉紅等是抗病毒的有效成分，松柏苷和槲皮素具有抗氧化活性，靛藍(lán)主要作為色素染料?！吨腥A人民共和國(guó)藥典·一部》(2015版)僅對(duì)大青葉中靛玉紅的含量進(jìn)行了考察，并未對(duì)其所含有的其他有效成分進(jìn)行描述和評(píng)價(jià)，對(duì)于科學(xué)評(píng)價(jià)大青葉藥材品質(zhì)具有一定的局限性。大青葉含有多種有效成分，若能通過(guò)簡(jiǎn)單、快速、高效的方法同時(shí)測(cè)定多種有效成分，如胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛藍(lán)、靛玉紅等的含量，將有助于全面、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)大青葉藥材質(zhì)量，為其規(guī)范化栽培和生產(chǎn)提供合理依據(jù)。

已有研究人員分別對(duì)大青葉中黃酮類物質(zhì)、核苷類物質(zhì)、脂肪酸類物質(zhì)的含量進(jìn)行了測(cè)定，但同時(shí)測(cè)定大青葉中核苷類和生物堿類物質(zhì)，包括胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛藍(lán)、靛玉紅等11種有效成分的含量測(cè)定尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種同時(shí)測(cè)定大青葉中11種有效成分含量的方法，進(jìn)而比較不同產(chǎn)區(qū)大青葉在化學(xué)成分組成及含量上存在的異同，為大青葉藥材的品質(zhì)鑒定及質(zhì)量控制提供參考。

解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成：

1、制備11種有效成分的對(duì)照品溶液，所述的11種有效成分為胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅。

2、利用高效液相色譜法對(duì)步驟1中的對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，色譜條件為：采用C₁₈色譜柱，以水和甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～6min，5％甲醇；6～20min，5％～14％甲醇；20～30min，14％～25％甲醇；30～65min，25％～50％甲醇；65～75min，50％～75％甲醇；75～85min，75％～95％甲醇；以峰面積值為縱坐標(biāo)、對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，繪制各對(duì)照品的峰面積值隨含量變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3、制備大青葉供試品溶液。

4、按照步驟2的色譜條件對(duì)大青葉供試品溶液進(jìn)行分析，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算大青葉供試品溶液中胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅的含量。

上述步驟3中，優(yōu)選制備大青葉供試品溶液的方法為：將大青葉經(jīng)50℃烘干后粉碎過(guò)40目篩，所得藥材粉末與體積分?jǐn)?shù)為65％的甲醇水溶液按料液比為1g:30mL混合，30℃超聲提取30min，離心分離，上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜，即得大青葉供試品溶液。

上述方法中，進(jìn)一步優(yōu)選C₁₈色譜柱為T(mén)hermoC₁₈色譜柱，檢測(cè)柱溫為25～35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254～270nm，流動(dòng)相的流速為1.0mL/min。

本方法以甲醇-水為流動(dòng)相，應(yīng)用梯度洗脫的方法，建立了同時(shí)測(cè)定大青葉中11種有效成分的方法，該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，11種有效成分均能獲得有效分離，可為全面評(píng)價(jià)和控制大青葉藥材質(zhì)量提供有效參考。

附圖說(shuō)明

圖1是11種對(duì)照品的色譜圖，其中1是胞苷、2是尿苷、3是腺嘌呤、4是鳥(niǎo)苷、5是腺苷、6是松柏苷、7是4(3H)-喹唑酮、8是槲皮素、9是色胺酮、10是靛藍(lán)、11是靛玉紅。

圖2是10個(gè)產(chǎn)區(qū)的大青葉供試品溶液的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

本實(shí)施例采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定10個(gè)不同產(chǎn)地的大青葉中的11種有效成分的含量，其11種有效成分為胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅；大青葉于2015年7月收集自陜西渭南、陜西商洛、陜西西安、河南輝縣、河北安國(guó)、安徽亳州、甘肅甘谷、江蘇無(wú)錫、湖南長(zhǎng)沙、山東菏澤10個(gè)產(chǎn)區(qū)，具體測(cè)試方法如下：

1、制備11種有效成分的對(duì)照品溶液

精密稱取胞苷(西瑪實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：0715)、尿苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：887-200202)、腺嘌呤(西瑪實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：07S15)、鳥(niǎo)苷(西瑪實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：09S14)、腺苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，110879-200202)、松柏苷(西瑪實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：05W16)、4(3H)-喹唑酮(西瑪實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：01A16)、槲皮素(中國(guó)藥品生物制品檢定所，100081-200907)對(duì)照品各5.0mg，分別置于5mL容量瓶中，以色譜甲醇溶解并定容；精密稱取色胺酮(西瑪實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：07S15)、靛藍(lán)(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：MUST-13031101)、靛玉紅(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110717-200204)對(duì)照品各2.0mg，分別置于5mL容量瓶中，以少量二甲基亞砜助溶，并以色譜甲醇定容。將上述溶液分別稀釋100、100、50、50、25、100、100、100、20、20、20倍，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，即得0.01mg/mL胞苷、0.01mg/mL尿苷、0.02mg/mL腺嘌呤、0.02mg/mL鳥(niǎo)苷、0.04mg/mL腺苷、0.01mg/mL松柏苷、0.01mg/mL 4(3H)-喹唑酮、0.01mg/mL槲皮素、0.02mg/mL色胺酮、0.02mg/mL靛藍(lán)和0.02mg/mL靛玉紅對(duì)照品溶液。

2、利用高效液相色譜儀(Agilent公司，型號(hào)：1260)對(duì)步驟1中的11種對(duì)照品溶液分別進(jìn)行分析，色譜條件為：采用Thermo C₁₈色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，以水和甲醇(色譜純)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，洗脫程序?yàn)椋?～6min，5％甲醇；6～20min，5％～14％甲醇；20～30min，14％～25％甲醇；30～65min，25％～50％甲醇；65～75min，50％～75％甲醇；75～85min，75％～95％甲醇；11種對(duì)照品溶液均分別以1μL、5μL、10μL、15μL、20μL體積進(jìn)樣，以峰面積值為縱坐標(biāo)、樣品含量為橫坐標(biāo)，繪制各對(duì)照品的峰面積值隨含量變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到表1所示的線性回歸方程。

表1線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果(n＝3)

同時(shí)以甲醇為溶劑，配制11種有效成分的混合液，混合液中胞苷的濃度為0.025mμg/mL、尿苷的濃度為0.0163mg/mL、腺嘌呤的濃度為0.0163mg/mL、鳥(niǎo)苷的濃度為0.025mg/mL、腺苷的濃度為0.015mg/mL、松柏苷的濃度為0.0156mg/mL、4(3H)-喹唑酮的濃度為0.0125mg/mL、槲皮素的濃度為0.0025mg/mL、色胺酮的濃度為0.01mg/mL、靛藍(lán)的濃度為0.1875mg/mL、靛玉紅的濃度為0.044mg/mL。按照上述測(cè)試條件，進(jìn)樣量為10μL，得到圖1所示的11種對(duì)照品的色譜圖。由圖1可見(jiàn)，混合樣中11中有效成分均得到有效分離。

3、制備大青葉供試品溶液

分別將不同產(chǎn)區(qū)的大青葉在50℃下烘干后，用手提式粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司，型號(hào)：DFT-50)粉碎并過(guò)40目篩，然后精密稱取所得大青葉粉末0.5g，置于50mL離心管中，再加入15mL體積分?jǐn)?shù)為65％的甲醇水溶液，稱重，用超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，型號(hào)：SB25-12DTD)，在30℃下超聲提取(功率400W)30min，取出再稱重，用體積分?jǐn)?shù)為65％的甲醇水溶液補(bǔ)足減失質(zhì)量，提取完后用超低溫高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司，型號(hào)：Sorvall ST 16R)在5000r/min下離心10min，取上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜，所得濾液作為大青葉供試品溶液。

4、按照步驟2的色譜條件對(duì)步驟3的大青葉供試品溶液進(jìn)行分析，進(jìn)樣量為10μL，測(cè)定各成分峰面積值，然后通過(guò)步驟2所得線性回歸方程計(jì)算大青葉供試品溶液中胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅的含量，結(jié)果見(jiàn)圖2及表2。

表2不同產(chǎn)區(qū)大青葉中11種有效成分的含量測(cè)定結(jié)果(mg/g，n＝3，)

注：表中“—”表示未檢出。

由圖2及表2可知，不同產(chǎn)區(qū)大青葉中11種有效成分的含量存在差異?？傮w而言，湖南長(zhǎng)沙大青葉中的胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮含量均高于其他產(chǎn)區(qū)；陜西渭南和河北安國(guó)的大青葉中未檢測(cè)到松柏苷，而陜西西安和河北安國(guó)的大青葉中靛藍(lán)含量較高；河南輝縣大青葉中色胺酮含量遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)區(qū)，但其他目標(biāo)物含量均低于各物質(zhì)平均含量；此外，河北安國(guó)、河南輝縣和江蘇無(wú)錫的藥材中未檢測(cè)到4(3H)-喹唑酮?？梢?jiàn)，環(huán)境因素對(duì)于藥用植物次生代謝產(chǎn)物的合成積累存在影響，一定程度上影響了藥材品質(zhì)。因此，應(yīng)該重點(diǎn)加強(qiáng)大青葉藥材的規(guī)范化生產(chǎn)，注重優(yōu)良大青葉品種的篩選和培育，進(jìn)一步提高藥材品質(zhì)。

為了證明本發(fā)明方法的可行性，發(fā)明人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)室研究試驗(yàn)，具體試驗(yàn)情況如下：

1、精密度試驗(yàn)

精密吸取大青葉供試品溶液按照實(shí)施例1中的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量為10μL，測(cè)定胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅的峰面積值，經(jīng)計(jì)算其RSD值范圍為1.26％～2.81％(見(jiàn)表3)，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2、重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取與試驗(yàn)1相同的大青葉供試品溶液按照實(shí)施例1中的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量為10μL，測(cè)定胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅的峰面積值，經(jīng)計(jì)算其RSD值范圍為0.63％～2.96％(見(jiàn)表3)，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

3、穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取與試驗(yàn)1相同的大青葉供試品溶液，分別于0h、2h、4h、8h、12h、24h進(jìn)樣10μL，測(cè)定胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅的峰面積值，經(jīng)計(jì)算其RSD值范圍為0.1％～2.88％(見(jiàn)表3)，結(jié)果表明11種有效成分的大青葉供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

4、加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱量已知11中有效成分含量的大青葉粉末3份，分別加入11種對(duì)照品，按照實(shí)施例1的方法制備大青葉供試品溶液，測(cè)定胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅的峰面積值，根據(jù)表1中的線性回歸方程計(jì)算大青葉供試品溶液中各成分的含量，并計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 11種有效成分的回收率試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

由表4可見(jiàn)，各成分的的加標(biāo)回收率范圍為95.67％～100.95％，RSD值范圍為0.26％～3.36％，表明該方法穩(wěn)定可靠。