本發(fā)明涉及生化分析領(lǐng)域，具體涉及一種高茶氨酸茶樹資源快速篩選方法。
背景技術(shù)：
：茶氨酸是茶樹的特征性氨基酸。在茶葉中茶氨酸的含量是其干重的1%-2%，游離氨基酸的40%-70%。由于茶氨酸具有鎮(zhèn)靜安神等多項(xiàng)生理功能，因此篩選高茶氨酸茶樹資源具有重要應(yīng)用價值。目前對茶葉中茶氨酸的檢測方法主要有分光光度法，紙層析法、氣象色譜法、堿式碳酸銅沉淀法、薄層色譜法、核磁共振法、液相色譜法、氨基酸自動分析儀分析法及毛細(xì)管電泳法等，其中后3種是最常用的方法。由于茶氨酸無熒光發(fā)射特性，且紫外吸收尚未確定，因此在對其進(jìn)行檢測時通常都需要進(jìn)行顯色或者衍生化處理，從而導(dǎo)致檢測樣品費(fèi)時費(fèi)力。高茶氨酸茶樹資源在茶樹中的比例特別低，通過大規(guī)模群體篩選需要花費(fèi)很大的人力物力，因此不適合大規(guī)模篩選。通過96孔板進(jìn)行氨基酸含量測定，篩選出候選資源再進(jìn)一步測定可大大縮短時間。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的是提供一種高茶氨酸茶樹資源快速篩選方法。采用本發(fā)明的方法，可以快速、精確的定位高茶氨酸茶樹資源。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種高茶氨酸茶樹資源快速篩選方法，步驟如下：S1.候選資源的篩選：利用96孔板酶標(biāo)儀法，先篩選出氨基酸含量高的茶樹資源，將其作為候選資源；S2.高茶氨酸茶樹資源篩選：利用OPA柱前衍生-HPLC法測定候選資源中茶氨酸含量，根據(jù)茶氨酸含量高低來篩選出高茶氨酸茶樹資源。進(jìn)一步地，所述候選資源的篩選，具體步驟如下：S11.L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱量谷氨酸配置成母液，并配置成不同濃度梯度的工作液用于繪制L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；S12.茶湯的制備：將茶葉研磨成茶粉，準(zhǔn)確稱量0.1g樣品于10ml的離心管中，用移液管加入10ml的100℃水，混勻后置于100℃水浴鍋中加熱45min，每隔10min混勻一次；冷卻至室溫，低速離心后用1ml移液器抽取上清過0.22um濾膜至2mlEP管中備用；S13.測定吸光度：取1mlS12中茶湯或S1中L-谷氨酸工作液、0.5mlpH8.0的磷酸緩沖液及茚三酮溶液于2ml的EP管中混勻，置于100℃水浴鍋中加熱15min，期間每隔3min混勻一次；冷卻后，取20ul反應(yīng)液于96孔酶標(biāo)板上，并加入230ul水，利用酶標(biāo)儀測吸光值；S14.氨基酸含量的計算：根據(jù)茶湯氨基酸的吸光度，對照L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出氨基酸含量，選出氨基酸含量高的資源即可。進(jìn)一步地，所述候選資源中茶樹氨基酸含量≥3.57%。進(jìn)一步地，所述茶葉為春季采摘一芽二葉茶樹品種。進(jìn)一步地，所述L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為：0.1mg/ml、0.12mg/ml、0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml。進(jìn)一步地，所述高茶氨酸茶樹資源篩選，步驟還包括茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。進(jìn)一步地，所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，具體步驟為準(zhǔn)確稱取0.1g茶氨酸配置成母液，然后配置成不同濃度的工作液用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)一步地，所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、80ug/ml、100ug/ml。進(jìn)一步地，所述高效液相色譜法，具體色譜條件如下：色譜柱：4.6mm*250mm，C18柱（5um）流動相：A：40mMNa2HPO4pH8.0鹽溶液；B：乙腈：甲醇：水（45:45:10，v/v/v）流速：2ml/min波長：338nm梯度洗脫程序：0-1min，流動相A：90%，流動相B：10%；1-9.8min，流動相A：90%，流動相B：10%；9.8-10min，流動相A：43%，流動相B：57%；10-12min，流動相A：0%，流動相B：100%；12-12.5min，流動相A：0%，流動相B：100%；12.5-14min，流動相A：90%，流動相B：10%。本發(fā)明的有益效果是：與傳統(tǒng)的液相色譜檢測法相比，本發(fā)明的方法可以快速，準(zhǔn)確的定位高茶氨酸茶樹資源。附圖說明圖1：不同濃度L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色圖。圖2：L-谷氨酸吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖3:23個樣品氨基酸96孔板顯色圖。圖4：23個樣品氨基酸含量測定圖。圖5：茶氨酸吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖6：HPLC法測定茶氨酸色譜圖。圖7：23個品種資源氨基酸總量及茶氨酸含量。具體實(shí)施例方式下面利用實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。一)L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱量0.1g谷氨酸試劑，在燒杯中溶解于70ml的水中，在100ml的容量瓶中定容，配置成1mg/ml的谷氨酸母液。用移液管分別吸取0.5ml、0.75ml、1ml、1.25ml、1.5ml、1.75ml、2ml、2.25ml、2.5ml的母液于5ml容量瓶中并進(jìn)行定容配置成濃度為0.1mg/ml、0.12mg/ml、0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml。二)茶湯的制備春季采集23個茶樹品種一芽二葉制備蒸清樣，并研磨成茶粉，準(zhǔn)確稱量0.1g樣品于10ml的玻璃離心管中，用移液管加入10ml100℃的雙蒸水，蓋上螺紋蓋并混勻。混勻后置于100℃水浴鍋中加熱45min，期間每隔10min混勻一次，每個樣品4次重復(fù)。三)96孔板法測定樣品氨基酸含量將樣品從水浴鍋中取出，冷卻至室溫后低速離心，用注射器抽取上清1ml并用0.22um的濾膜進(jìn)行過濾，濾液保存在2ml的EP管中。用移液器分別抽取1ml茶湯或L-谷氨酸工作液、0.5mlpH8.0的磷酸緩沖液及茚三酮溶液于2ml的EP管中，混勻。置于100℃水浴鍋中加熱15min，期間每隔3min混勻一次。取出，在室溫下冷卻。取20ul反應(yīng)后產(chǎn)物于96孔酶標(biāo)板上，并加入230ul水進(jìn)行稀釋。搖勻后，利用酶標(biāo)儀檢測吸光值。通過96孔板進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，不同濃度L-谷氨酸通過顯色反應(yīng)顯示出不同深度的顏色，濃度越高，顏色越深，如圖1所示，其中1-9孔L-谷氨酸的濃度分別為0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml和0.5mg/ml，10孔為空白對照。通過對23個樣品測定后顏色深淺度(如圖3所示)，可初步判斷氨基酸含量高低，其中23個樣品分布于96孔板情況如下表：L-谷氨酸吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，從圖2得到線性回歸方程為Y=-0.265+3.02143X，樣品氨基酸含量則可根據(jù)吸光值及推算氨基酸含量公式計算得出，公式如下：其中，C為氨基酸濃度百分比，OD為吸光度，M/n為樣品干重。四)高茶氨酸茶樹候選資源篩選根據(jù)茶樹茶氨酸占其氨基酸總量的40%-70%，高茶氨酸茶樹資源其茶氨酸含量大于其干重的2.5%，因此通過酶標(biāo)儀利用96孔板篩選茶樹氨基酸含量≥3.57%的資源作為篩選高茶氨酸的候選資源。通過吸光度推算，其中14號和22號樣品氨基酸含量大于3.57%，其氨基酸含量分別為3.57%和3.62%，可進(jìn)一步進(jìn)行茶氨酸含量測定。五)高茶氨酸茶樹候選資源茶氨酸含量的檢測茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱量茶氨酸0.1g溶解于80ml水中，并用容量瓶定容到100ml，配置成1mg/ml母液，并分別取20ul、40ul、60ul、80ul及100ul并用水稀釋定容到100ml，制備成20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、80ug/ml、100ug/ml的工作液。將候選資源茶湯及茶氨酸工作液進(jìn)行柱前衍生并進(jìn)行HPLC檢測。衍生條件如下：從瓶1中吸取2.5ul（硼酸鹽緩沖液）吸取0.5u樣品，“在空氣中”混合3ul，最大速度，2次。等待0.5分鐘。從瓶2中吸取0ul水（用未加蓋瓶中水清洗針頭）。從瓶3中吸取0.5ulOPA?！霸诳諝庵小被旌?ul，最大速度，6次。從瓶2中吸取0ul水（用未加蓋瓶中水清洗針頭）。從瓶4中吸取32ul水?！霸诳諝庵小被旌?8ul，最大速度，2次。進(jìn)樣。色譜條件如下：色譜柱：4.6mm*250mm，C18柱（5um）流動相：A：40mMNa2HPO4pH8.0鹽溶液；B：乙腈：甲醇：水（45:45:10，v/v/v）流速：2ml/min波長：338nm梯度洗脫程序：0-1min，流動相A：90%，流動相B：10%；1-9.8min，流動相A：90%，流動相B：10%；9.8-10min，流動相A：43%，流動相B：57%；10-12min，流動相A：0%，流動相B：100%；12-12.5min，流動相A：0%，流動相B：100%；12.5-14min，流動相A：90%，流動相B：10%。通過篩選獲得14號和22號樣品氨基酸含量大于3.57%，利用HPLC進(jìn)行檢測其茶氨酸含量分別為2.37%和2.62%。其中22號資源茶氨酸含量大于2.5%，為高茶氨酸資源。同時對其他19份資源也進(jìn)行了檢測，其結(jié)果如圖7所示。與傳統(tǒng)的液相色譜檢測法相比，分析23份資源，可節(jié)約用時21.5小時，而測定的結(jié)果基本一致。因此，本發(fā)明比傳統(tǒng)方法具有通量高、快速而準(zhǔn)確的優(yōu)勢。方法樣品數(shù)耗時（分鐘）鑒定的高茶氨酸種質(zhì)數(shù)量本發(fā)明23205.51傳統(tǒng)液相色譜檢測231497.51六)對照例實(shí)施方式茶湯制備：春季采集23個茶樹品種一芽二葉制備蒸清樣，并研磨成茶粉，準(zhǔn)確稱量1g樣品于100ml的錐形瓶中，加入90ml沸水，然后將其置于沸水浴中浸提45min，每10min震蕩一次。浸提完畢后，趁熱過濾，待茶湯冷卻至室溫后定容至100ml，備用。將23個茶樹品種按照（五）中方法進(jìn)行HPLC方法檢測。當(dāng)前第1頁1 2 3