本發(fā)明涉及中藥活性成分分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是涉及一測多評法與面積歸一化法相結(jié)合的測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法。

背景技術(shù)：

西紅花(Crocus sativus L.)又稱藏紅花，僅以雌蕊上部三根紅色柱頭入藥，人工采摘100000-150000朵花才能獲得一公斤藏紅花干品，因此價格昂貴，為名貴中藥材，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神之功效。主要有效成分為西紅花苷(crocins)，是一種紅色的水溶性胡蘿卜素類化合物，是西紅花酸與葡萄糖或龍膽二糖結(jié)合而成的一系列酯苷類，目前已分離得到苷元均為西紅花酸的16種不同順反異構(gòu)體的西紅花苷。世界各地不同來源西紅花中均以西紅花苷-Ⅰ含量最高，其次為西紅花苷-Ⅱ，西紅花苷產(chǎn)地栽培、干燥與儲存等對西紅花苷含量影響很大，因此在西紅花生產(chǎn)加工和質(zhì)量控制方面均需要適當(dāng)?shù)牟丶t花苷含量測定方法，《中國藥典》2015年版以西紅花苷中的西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ為指標(biāo)對西紅花質(zhì)量控制，要求兩者總含量不低于10％，但西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ在某些樣品中只占各西紅花總苷的70％左右，且隨著儲存時間的增加，反式的西紅花-Ⅰ和苷-Ⅱ會發(fā)生降解或異構(gòu)化，部分轉(zhuǎn)為其他順式異構(gòu)體，而西紅花苷口服給藥后，所有西紅花苷均會水解為苷元西紅花酸被吸收入血起效，因此西紅花總苷含量的高低對藥效的影響更大，《中國藥典》根據(jù)西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的總含量為標(biāo)準(zhǔn)，不能全面反映西紅花藥材質(zhì)量；西紅花在國際上主要用作色素和香料，作為食品添加劑的國際標(biāo)準(zhǔn)ISO3632-2(2010版)，用分光光度法于λmax 440nm測定西紅花水提取液的色價來進(jìn)行質(zhì)量控制與分級，規(guī)定西紅花苷色價大于190為一級品，該方法更不能精確定量西紅花苷含量。因此，《中國藥典》及國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 3632-2對藏紅花質(zhì)量評價的標(biāo)準(zhǔn)均需進(jìn)一步完善，需要建立適合生產(chǎn)加工和質(zhì)量控制的西紅花總苷含量測定方法。

一般認(rèn)為分光光度法特征性不強，但西紅花是一味很特殊的藥材，藥效成分均集中于柱頭，含量高且相對簡單，主要只有藏紅花苷、藏花醛和苦藏花素三類成分，在可見光區(qū)440nm處只有西紅花苷類有吸收，其他成分無干擾，用可見分光光度法(440nm)測定總西紅花苷含量的方法，方法簡便，易于推廣，但該方法只適合生產(chǎn)加工者使用，若有人為摻假等行為，則不適合使用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對《中國藥典》僅測定西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量，不能全面體現(xiàn)總西紅花苷的真實含量，《國際標(biāo)準(zhǔn)》測定的總西紅花苷色價不能量化總西紅花苷的含量的缺點。本發(fā)明將一測多評測定的兩種西紅花苷含量和面積歸一化法測定的總西紅花苷含量相結(jié)合，實現(xiàn)了一個對照品完成各西紅花苷類成分的含量測定，降低了檢測成本，并能全面評價西紅花的質(zhì)量，為西紅花藥材質(zhì)量評價方法的完善提供了更好的技術(shù)參考。

本發(fā)明采用高效液相法，通過優(yōu)選色譜條件，波長切換等技術(shù)測定藥材中的西紅花苷，可分離大部分西紅花苷類成分，但西紅花苷的苷元由七個共軛雙鍵組成，易氧化不穩(wěn)定，因此西紅花苷對照品價格昂貴，精確定量所有西紅花苷類成分含量，檢測成本非常昂貴，本發(fā)明使用采用面積歸一化法(ANM)對西紅花藥材中西紅花總苷進(jìn)行含量測定，解決了HPLC法含量測定時多個西紅花苷對照品不易獲得的問題。

本發(fā)明以西紅花苷-Ⅰ為內(nèi)參物，建立了西紅花苷-Ⅰ對西紅花苷-Ⅱ的相對校正因子，利用相對校正因子計算西紅花苷-Ⅱ的含量(一測多評)；并與藥典采用的外標(biāo)法測定的32批西紅花中西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含量進(jìn)行比較，以驗證一測多評法的可行性。結(jié)果西紅花苷-Ⅰ相對西紅花苷-Ⅱ的相對校正因子重復(fù)性好，西紅花中西紅花苷-Ⅱ的一測多評法的計算值與藥典外標(biāo)法測定結(jié)果基本一致，解決了藥典測定方法中西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌沸再|(zhì)不穩(wěn)定、價格昂貴的問題。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種面積歸一化法測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法，包括步驟：

a.確定色譜條件；

b.制備對照品溶液：

混合對照品溶液：精密稱取西紅花苷-Ⅰ對照品和西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌罚糜谧厣科恐?，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得混合對照品溶液，搖勻，備用；

西紅花苷-Ⅰ對照品溶液：精密稱取西紅花苷-Ⅰ對照品置棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得西紅花苷-Ⅰ對照品溶液；

c.制備供試品溶液：參照中國藥典2015年版西紅花項下，精密稱取西紅花樣品粉末，置于棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超聲處理20min，放置室溫，加乙醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，得供試品溶液；

d.根據(jù)2015年版中國藥典的外標(biāo)法定量西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量；

e.一測多評法QMSA測定西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量；f.紫外分光光度法測定總西紅花苷的含量；

g.面積歸一化法測定總西紅花苷的含量。

優(yōu)選地，所述步驟a中，色譜條件為Ultimate XB C18色譜柱，色譜柱為250mm×4.6mm,5μm；柱溫：30℃；流動相：水-甲醇，梯度洗脫，0-60min，甲醇：20％-100％；DAD檢測器波長范圍200-600nm，檢測波長440nm，流速：1.0mL·min^-1；進(jìn)樣量：10μL。

優(yōu)選地，所述步驟c中，所述冰浴超聲為250W、40KHz處理20min。

優(yōu)選地，所述步驟c中，微孔濾膜的孔徑為0.22μm。

優(yōu)選地，所述步驟d，進(jìn)一步為，取步驟b中西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的混合對照品溶液1、2、4、8、10、20μL，按步驟a中色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，分別以西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ質(zhì)量濃度(X,μg)對其相應(yīng)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，精密量取步驟c中的供試品溶液10μL，注入液相色譜儀測定，相應(yīng)峰面積代入回歸方程計算苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含量。

優(yōu)選地，所述步驟e，進(jìn)一步為，取步驟b中混合對照品溶液，分別進(jìn)樣1、2、4、8、10、15、20μL，記錄峰面積，應(yīng)用多點校正法，以西紅花苷-Ⅰ為內(nèi)參物，計算西紅花苷-Ⅰ對西紅花苷-Ⅱ的相對校正因子f_k/s，f_k/s計算公式：f_k/s＝(C_s×A_k)/(C_k×A_s)，待測成分(西紅花苷-Ⅱ)質(zhì)量濃度計算公式：C_k′＝(Cs×A_k′)/(f_k/s×As)，

其中Cs為內(nèi)參物(西紅花苷-Ⅰ)質(zhì)量濃度，As為內(nèi)參物色譜峰峰面積，C_k為西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌焚|(zhì)量濃度，A_k為西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌飞V峰峰面積，C_k′為西紅花樣品中西紅花苷-Ⅱ質(zhì)量濃度，Ak′為西紅花樣品中西紅花苷-Ⅱ色譜峰峰面積。

優(yōu)選地，所述步驟f，進(jìn)一步為，精密吸取西紅花苷-Ⅰ對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL置于10mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，以稀乙醇作空白對照，采用紫外-可見分光光度法，于440nm波長處測定吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；精密吸取步驟c中的供試品溶液5mL，置50mL棕色量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，用可見分光光度法于440nm波長處測定吸光度，以西紅花苷-Ⅰ為對照標(biāo)準(zhǔn)品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總西紅花苷含量。

優(yōu)選地，所述步驟g，進(jìn)一步為，稱取西紅花樣品粉末約10mg，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超聲(250W，40KHz)處理20min，放置室溫，加乙醇定容至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，精密吸取續(xù)濾液及步驟b中對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀測定，測定時間為不少于60分鐘，同時進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜條件為：離子源：大氣壓電噴霧離子源(ESI)；檢測模式：正負(fù)離子；全掃描質(zhì)核比(m/z)：50-1200；干燥氣溫度：350℃，干燥氣流量：12.0L·min^-1，霧化氣壓力：35.0psi；毛細(xì)管電壓：4.5kV；碰撞電壓1.0V；進(jìn)入質(zhì)譜的流動相流速分流至0.4mL·min^-1。以西紅花苷-Ⅰ為對照，按C_總苷＝(C_苷-Ⅰ×A_總苷)/A_苷-Ⅰ計算總西紅花苷的含量，

其中A_苷-Ⅰ為樣品中西紅花苷-Ⅰ色譜峰峰面積；A_總苷為西紅花樣品440nm下12個西紅花苷類色譜峰峰面積之和；C_苷-Ⅰ為外標(biāo)法測定的西紅花樣品中西紅花苷-Ⅰ的質(zhì)量濃度；C_總苷為西紅花樣品中總西紅花苷質(zhì)量濃度。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的一測多評法與面積歸一化法相結(jié)合的測定西紅花藥材中西紅花苷類成分的方法，達(dá)到了如下效果：

本申請采用“一測多評”法，以西紅花苷-Ⅰ為內(nèi)參物，同時檢測《中國藥典》規(guī)定的兩種西紅花苷的含量，與中國藥典方法進(jìn)行比較，以減少價格昂貴的西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌返氖褂?。并根?jù)各西紅花苷結(jié)構(gòu)相似(均為西紅花酸與不同數(shù)目葡萄糖結(jié)合的不同順反異構(gòu)體)，最大紫外吸收相同，同時以西紅花苷-Ⅰ為對照，采用面積歸一化法計算總西紅花苷的含量，并與課題組前期已建立的440nm下分光光度法檢測總西紅花苷的含量進(jìn)行比較分析，建立能與西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ同步檢測總西紅花苷含量的方法。相較于《中國藥典》方法，將一測多評測定的兩種西紅花苷含量和面積歸一化法測定的總西紅花苷含量相結(jié)合，實現(xiàn)了一個對照品完成西紅花苷的含量測定，降低了檢測成本，并能全面評價西紅花的質(zhì)量，為西紅花藥材質(zhì)量評價方法的完善提供了更好的技術(shù)參考。

藏紅花中含有16種不同的藏紅花苷，其中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量占70％以上，口服給藥后，各西紅花苷均以去糖基的苷元西紅花酸吸收入血發(fā)揮藥效，但《中國藥典》2015版僅測定西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量，不能體現(xiàn)總西紅花苷的含量，而西紅花在國際上無藥用標(biāo)準(zhǔn)，只有作為食品添加劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)ISO 3632-2，用分光光度法測定西紅花水溶液440nm的色價對其進(jìn)行質(zhì)量控制與分級，規(guī)定西紅花苷色價大于190為Ⅰ級品，150-190為Ⅱ級品，100-150為Ⅲ級品，但測定色價不能給出總西紅花苷的含量。本發(fā)明以西紅花苷-Ⅰ為內(nèi)參物，建立西紅花苷-Ⅰ對西紅花苷-Ⅱ的相對校正因子，利用相對校正因子計算西紅花苷-Ⅱ的含量，實現(xiàn)一測多評(QMSA)；并同時以西紅花苷-Ⅰ為對照，峰面積歸一化(ANM)法檢測西紅花中總西紅花苷的含量。結(jié)果西紅花苷-Ⅱ的QMSA法的計算值與藥典的外標(biāo)法測定結(jié)果基本一致。ANM計算的總西紅花苷含量與UV法測定的總西紅花苷含量無顯著性差異。實現(xiàn)了一個對照品完成西紅花苷的含量測定，降低了檢測成本，并能全面評價西紅花的質(zhì)量。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1為混合對照品(A)440nm波長下HPLC圖；其中：1-西紅花苷-Ⅰ；2-西紅花苷-Ⅱ；

圖2為樣品440nm波長下HPLC圖；其中：1-西紅花苷-Ⅰ；2-西紅花苷-Ⅱ；3-西紅花苷-Ⅲ；4-西紅花苷-Ⅳ；

圖3為樣品波長切換HPLC圖；

圖4為樣品質(zhì)譜總離子流圖。

具體實施方式

如在說明書及權(quán)利要求當(dāng)中使用了某些詞匯來指稱特定組件。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可理解，硬件制造商可能會用不同名詞來稱呼同一個組件。本說明書及權(quán)利要求并不以名稱的差異來作為區(qū)分組件的方式，而是以組件在功能上的差異來作為區(qū)分的準(zhǔn)則。如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的“包含”為一開放式用語，故應(yīng)解釋成“包含但不限定于”?！按笾隆笔侵冈诳山邮盏恼`差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問題，基本達(dá)到所述技術(shù)效果。說明書后續(xù)描述為實施本發(fā)明的較佳實施方式，然所述描述乃以說明本發(fā)明的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不作為對本發(fā)明的限定。

實施例1：

a.確定色譜條件

Ultimate XB C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；柱溫：30℃；流動相：水(A)-甲醇(B)，梯度洗脫，0-60min，B：20％-100％；DAD波長范圍200-600nm，檢測波長440nm，流速：1.0mL·min^-1；進(jìn)樣量：10μL。在該色譜條件下，各色譜峰有較好的基線分離；

b.制備對照品溶液

精密稱取西紅花苷-Ⅰ對照品5.96mg，西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌?.96mg，置100mL棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度。得濃度為59.6μg·mL^-1和29.6μg·mL^-1的混合對照品溶液，搖勻，備用。

西紅花苷-Ⅰ對照品溶液：精密稱取西紅花苷-Ⅰ對照品置棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得西紅花苷-Ⅰ對照品溶液；

c.制備供試品溶液

參照中國藥典2015年版西紅花項下，稱取西紅花樣品粉末約10mg，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超聲(250W，40KHz)處理20min，放置室溫，加乙醇定容至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

d.2015年版《中國藥典》外標(biāo)法(external standard method，ESM)定量西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量

取步驟b中西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ混合對照品溶液1、2、4、8、10、20μL，按A項色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積。分別以西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ質(zhì)量濃度(X,μg)對其相應(yīng)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，分別得苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的回歸方程Y＝941.16X-4.0829(r＝0.9999)和Y＝1108.9X-0.8237(r＝0.9999)。結(jié)果表明西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ分別在0.0596-1.192μg和0.0296-0.592μg與其各自峰面積積呈良好線性關(guān)系。精密吸取步驟c中供試品溶液10μL，注入液相色譜儀測定，相應(yīng)峰面積代入回歸方程計算苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含量。

e.一測多評法(QMSA)測定西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量

應(yīng)用多點校正法，以西紅花苷-Ⅰ為內(nèi)參物，計算西紅花苷-Ⅰ對西紅花苷-Ⅱ的相對校正因子fk/s，以一個標(biāo)準(zhǔn)品西紅花苷-Ⅰ，測定兩個西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量。取步驟b中下混合對照品溶液，分別進(jìn)樣1、2、4、8、10、15、20μL，記錄峰面積，應(yīng)用多點校正法，以西紅花苷-Ⅰ為內(nèi)參物，計算西紅花苷-Ⅰ對西紅花苷-Ⅱ的相對校正因子f_k/s，f_k/s計算公式：f_k/s＝(C_s×A_k)/(C_k×A_s)。待測成分(西紅花苷-Ⅱ)質(zhì)量濃度計算公式：C_k′＝(Cs×A_k′)/(f_k/s×As)。兩式中Cs為內(nèi)參物(西紅花苷-Ⅰ)質(zhì)量濃度，As為內(nèi)參物色譜峰峰面積，C_k為西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌焚|(zhì)量濃度，A_k為西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌飞V峰峰面積，C_k′為西紅花樣品中西紅花苷-Ⅱ質(zhì)量濃度，A_k′為西紅花樣品中西紅花苷-Ⅱ色譜峰峰面積。

f.UV法測定總西紅花苷的含量

精密吸取步驟c中下的供試品溶液5mL，置50mL棕色量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，用可見分光光度法于440nm波長處測定西紅花藥材吸光度，以西紅花苷-Ⅰ為對照標(biāo)準(zhǔn)品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算總西紅花苷含量。

g.面積歸一化法測定總西紅花苷的含量

稱取西紅花樣品粉末約10mg，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超聲(250W，40KHz)處理20min，放置室溫，加乙醇定容至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，精密吸取續(xù)濾液及步驟b中對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀測定，由于西紅花中的西紅花苷、苦藏花素和藏花醛三類主要化合物在440nm、250nm和330nm下有特征性吸收，但吸收強度相差很大，所以采用了波長切換技術(shù)。按上述實驗條件，取對照品和西紅花樣品溶液進(jìn)樣分析，得對照品和西紅花樣品高效液相色譜圖和質(zhì)譜總離子流色譜圖。在440nm下共分離鑒定出12個不同的西紅花苷類成分，另有4中西紅花苷類成分低于HPLC法的檢測限。以西紅花苷-Ⅰ為對照，按C_總苷＝(C_苷-Ⅰ×A_總苷)/A_苷-Ⅰ計算總西紅花苷的含量。式中A_苷-Ⅰ為樣品中西紅花苷-Ⅰ色譜峰峰面積；A_總苷為西紅花樣品440nm下所有色譜峰峰面積之和；C_苷-Ⅰ為外標(biāo)法測定的西紅花樣品中西紅花苷-Ⅰ的質(zhì)量濃度；C_總苷為西紅花樣品中總西紅花苷質(zhì)量濃度。

實施例2：國內(nèi)外32批西紅花藥材中西紅花苷類成分的測定

1.儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Agilent 6330離子阱質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)(美國Agilent公司)；Lambda 45紫外-可見分光光度儀(美國PerkinElmer公司)。

試劑與供試品

標(biāo)準(zhǔn)品：西紅花苷-Ⅰ(批號：111588-201202)，西紅花苷-Ⅱ(批號：111589-201304)均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇和甲酸均為色譜純(美國Tedia公司)，其余化學(xué)試劑均為分析純。

32批西紅花藥材由浙江省建德市三都西紅花專業(yè)合作社和不同種植基地提供，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳錫林教授鑒定為番紅花(Crocus Sativus L.)的干燥柱頭。

3.對照品溶液的制備

精密稱取西紅花苷-Ⅰ對照品6.20mg，置25mL棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度。從中精密移取4.0mL置10mL量瓶中，稀乙醇稀釋至刻度，搖勻。得濃度為99.2μg·mL-1的對照品溶液。

4.供試品溶液制備

參照2010年版《中國藥典》西紅花項下，稱取西紅花樣品粉末約10mg，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超聲處理20min，放置室溫，加乙醇定容至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，精密吸取5mL，置50mL棕色量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度。

5.HPLC色譜條件

Ultimate XB C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；柱溫：30℃；流動相：水(A)-甲醇(B)，梯度洗脫，0-60min，B：20％-100％；DAD波長范圍200～600nm，檢測波長440nm，流速：1.0mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL。在該色譜條件下，各色譜峰有較好的基線分離。

6.測定波長的選擇

對照品溶液及供試品溶液分別于200-700nm進(jìn)行波長掃描，發(fā)現(xiàn)兩者均在440nm處有最大吸收，故確定檢測波長為440nm。與西紅花苷類成分的最大吸收波長相一致。

7.UV法標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL置于10mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，以稀乙醇作空白對照，照紫外-可見分光光度法，于440nm波長處測定吸光度，得回歸方程為y＝0.1130x+0.0012(r＝0.9999)。結(jié)果表明，西紅花苷-Ⅰ在0.992-9.92μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

8.UV法測定樣品中總西紅花苷含量

取32批西紅花藥材，分別按步驟4下制備供試品溶液，以稀乙醇作空白對照，照紫外-可見分光光度法，于440nm波長處測定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算總西紅花苷含量，測定結(jié)果見表1。

9.《中國藥典》方法測定西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量

取32批西紅花藥材，分別按步驟4下制備供試品溶液，按《中國藥典》色譜條件進(jìn)樣。32批西紅花樣品中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ總含量的測定結(jié)果見表1。

10.一測多評法(QMSA)測定西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量

取步驟3下對照品溶液，分別進(jìn)樣1、2、4、8、10、15、20μL，記錄峰面積，應(yīng)用多點校正法，以西紅花苷-Ⅰ為內(nèi)參物，計算西紅花苷-Ⅰ對西紅花苷-Ⅱ的相對校正因子fk/s，fk/s計算公式：fk/s＝(Cs×Ak)/(Ck×As)。待測成分(西紅花苷-Ⅱ)質(zhì)量濃度計算公式：Ck′＝(Cs×Ak′)/(fk/s×As)。兩式中Cs為內(nèi)參物(西紅花苷-Ⅰ)質(zhì)量濃度，As為內(nèi)參物色譜峰峰面積，Ck為西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌焚|(zhì)量濃度，Ak為西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌飞V峰峰面積，Ck′為西紅花樣品中西紅花苷-Ⅱ質(zhì)量濃度，Ak′為西紅花樣品中西紅花苷-Ⅱ色譜峰峰面積。

取32批西紅花藥材，分別按步驟4下制備供試品溶液，按步驟5下色譜條件進(jìn)樣。32批西紅花樣品中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ總含量的測定結(jié)果見表1。

11.面積歸一化法測定總西紅花苷的含量

取32批西紅花藥材，分別按步驟4下制備供試品溶液，按步驟5下色譜條件進(jìn)樣。以西紅花苷-Ⅰ為對照，按C總苷＝(C苷-Ⅰ×A總苷)/A苷-Ⅰ計算總西紅花苷的含量。式中A苷-Ⅰ為樣品中西紅花苷-Ⅰ色譜峰峰面積；A總苷為西紅花樣品440nm下所有色譜峰峰面積之和；C苷-Ⅰ為外標(biāo)法測定的西紅花樣品中西紅花苷-Ⅰ的質(zhì)量濃度；C總苷為西紅花樣品中總西紅花苷質(zhì)量濃度。32批西紅花樣品中西紅花總苷含量的測定結(jié)果見表1。

表1 ESM與QAMS測定的西紅花中兩種西紅花苷類成分含量及ANM與UV測定總西紅花苷含量結(jié)果(％，n＝3)

西紅花苷入血后以苷元西紅花酸起效，因此以西紅花藥材總苷含量評價其質(zhì)量更準(zhǔn)確。中國藥典(2015版)采用HPLC法測定西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含量，未測其它苷類成分面積歸一化法含量，是基于對照品不易獲得和測定時間不能太長的考慮；本發(fā)明采用面積歸一化法測定的總西紅花苷含量僅需使用西紅花苷-Ⅰ一種對照品，測定時間在60min內(nèi)有11個西紅花苷類成分得到分離，32批國內(nèi)外西紅花樣品測定結(jié)果，面積歸一化法與已發(fā)表的UV法測定的總西紅花苷含量無顯著性差異，說明面積歸一化法可用于總西紅花苷含量的測定。本申請中國內(nèi)樣品為收購產(chǎn)地新鮮西紅花花絲后同一廠家干燥加工生產(chǎn)，國外樣品也為著名的大公司出品，經(jīng)HPLC分析均不含摻假品，因此使用UV法測定更簡便，但對于可能摻假產(chǎn)品則必須使用HPLC采用面積歸一化法測定西紅花總苷。

中國藥典(2015版)為現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)，要求西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的總量大于10％為合格品，但西紅花苷-Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品較貴，而兩者的苷元均是西紅花酸，為脫輔基類胡蘿卜類化合物，產(chǎn)生紫外吸收的官能團(tuán)相同，均在440nm有最大吸收，為一測多評法的建立提供了最有利內(nèi)源基礎(chǔ)。本申請中不同儀器、不同色譜柱測得的西紅花苷-Ⅱ的相對校正因子、相對保留時間的RSD均小于5％，符合一測多評法要求。采用中國藥典外標(biāo)法測定的西紅花苷-Ⅱ含量與通過一測多評法計算得到的含量基本一致，以西紅花苷-Ⅰ為內(nèi)參物，苷-Ⅱ的相對校正因子為1.18，有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，因此使用一測多評法測定西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的總量可用于判別西紅花藥材是否合格，降低檢測成本。

面積歸一化法計算總西紅花苷與一測多評計算西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含量兩種方法結(jié)合，實現(xiàn)了一個對照品完成各西紅花苷的含量測定，方法簡便，結(jié)果可靠，樣品中各西紅花苷組分間比例量的差異，可以在一定程度上反映西紅花生長發(fā)育，采收加工，儲存等過程中西紅花苷類成分的轉(zhuǎn)化特點，為西紅花生產(chǎn)加工及流通過程中提高西紅花質(zhì)量提供了更好的技術(shù)參考。

上述說明示出并描述了本發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本申請中所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本申請中所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn)行改動。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。