本發(fā)明涉及一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，具體為一種基于拉曼光譜檢測(cè)血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的自動(dòng)化系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是癌癥發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要原因，其致死率高達(dá)90％。從患者血液中檢測(cè)CTCs，只需要抽取一定量的外周血，無(wú)需病理切片，不僅對(duì)患者幾乎沒(méi)有損傷，而且能準(zhǔn)確掌握患者病情，判斷其癌癥轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)早期癌癥預(yù)后有重要價(jià)值。然而，CTCs在血液中的含量很少，遠(yuǎn)低于正常的紅細(xì)胞和白細(xì)胞，傳統(tǒng)方法主要為免疫檢測(cè)法，包括免疫磁珠法、免疫熒光法等，但由于癌細(xì)胞進(jìn)入血液后形成CTCs時(shí)其表面抗原易丟失，部分CTCs甚至?xí)纬筛杉?xì)胞，因此免疫法極易漏檢，同時(shí)存在假陽(yáng)性結(jié)合問(wèn)題，導(dǎo)致傳統(tǒng)免疫法對(duì)CTCs的檢出率較低，且目前已探明的癌細(xì)胞免疫抗體種類有限，導(dǎo)致該方法可檢測(cè)的CTCs種類有限。另外，癌細(xì)胞免疫抗體價(jià)格昂貴，導(dǎo)致患者的檢測(cè)費(fèi)用居高不下。

為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于拉曼光譜的循環(huán)腫瘤細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用微通孔芯片實(shí)現(xiàn)對(duì)血液中CTCs的富集，然后利用拉曼散射光譜的特異性區(qū)分不同種類的細(xì)胞，排除微通孔芯片富集后殘留的紅細(xì)胞和白細(xì)胞，同時(shí)準(zhǔn)確區(qū)分出CTCs的種類、數(shù)量和CTCs所處的時(shí)期。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為避免上述背景技術(shù)中CTCs免疫富集和檢測(cè)存在的檢出率低、假陽(yáng)性和免疫試劑的高成本問(wèn)題，便于血液中CTCs種類、數(shù)量與良惡性的準(zhǔn)確、低成本檢測(cè)，本發(fā)明提供一種基于拉曼光譜的循環(huán)腫瘤細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)微通孔芯片實(shí)現(xiàn)CTCs的初步富集，然后通過(guò)特征拉曼光譜實(shí)現(xiàn)CTCs的準(zhǔn)確識(shí)別和區(qū)分。

本發(fā)明提供一種基于拉曼光譜的循環(huán)腫瘤細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由血樣處理模塊、循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)模塊、數(shù)據(jù)處理模塊和結(jié)果輸出模塊構(gòu)成；

血樣處理模塊集成了血液自動(dòng)進(jìn)樣針筒、生化池、微通孔過(guò)濾芯片、血細(xì)胞裂解液、清洗液和機(jī)械臂；

循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)模塊集成了光學(xué)顯微鏡、成像CCD、三維電動(dòng)樣品臺(tái)、激光器、光譜儀、濾光片和控制器；

數(shù)據(jù)處理模塊集成了細(xì)胞顯微圖像識(shí)別算法、拉曼光譜處理分析算法、細(xì)胞統(tǒng)計(jì)算法和數(shù)據(jù)庫(kù)；

結(jié)果輸出模塊集成了循環(huán)腫瘤細(xì)胞測(cè)試結(jié)果的直接顯示區(qū)和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示區(qū)。

所述血液自動(dòng)進(jìn)樣針筒加入患者血液量為5ml；所述生化池用于進(jìn)行血細(xì)胞裂解、過(guò)濾和沖洗，其中，血細(xì)胞裂解包括紅細(xì)胞全部裂解和白細(xì)胞部分裂解，裂解過(guò)濾后再利用清洗液進(jìn)行沖洗和再過(guò)濾。

所述機(jī)械臂用于清洗過(guò)濾完成后，取出含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的過(guò)濾芯片并轉(zhuǎn)移至循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)模塊的三維電動(dòng)樣品臺(tái)上。

所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)模塊中器件的工作過(guò)程為：控制器首先控制三維電動(dòng)樣品臺(tái)的上下移動(dòng)，通過(guò)CCD和光學(xué)顯微成像清晰度反饋，進(jìn)行自動(dòng)伺服對(duì)焦控制，獲得清晰的顯微成像結(jié)果后，記錄循環(huán)腫瘤細(xì)胞的顯微圖像，根據(jù)顯微圖像對(duì)每一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行空間定位；然后控制三維電動(dòng)樣品臺(tái)水平移動(dòng)，根據(jù)定位結(jié)果將循環(huán)腫瘤細(xì)胞移至激光器焦點(diǎn)處，打開(kāi)激光器，細(xì)胞的拉曼光譜通過(guò)濾光片后進(jìn)入光譜儀，控制器記錄光譜儀測(cè)量數(shù)據(jù)，并將記錄的顯微圖像和拉曼光譜存入緩存區(qū)，控制器完成細(xì)胞測(cè)量后將測(cè)量數(shù)據(jù)發(fā)送到數(shù)據(jù)處理模塊。

所述細(xì)胞顯微圖像識(shí)別算法用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行空間定位，通過(guò)獲取細(xì)胞邊界和中心灰度變化進(jìn)行細(xì)胞顯微圖像識(shí)別，從而準(zhǔn)確獲取每個(gè)細(xì)胞的形狀和空間坐標(biāo)。

所述拉曼光譜處理分析算法包括拉曼光譜的預(yù)處理、特征提取和對(duì)比分析，其中，預(yù)處理包括背景去除、降噪和光譜擬合，特征提取包括拉曼特征峰頻率、強(qiáng)度、半寬以及面積，對(duì)比分析是將所提取的特征與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)所測(cè)試細(xì)胞類別的歸類識(shí)別。

所述細(xì)胞統(tǒng)計(jì)算法是在細(xì)胞顯微圖像識(shí)別算法和拉曼光譜處理分析算法處理后的結(jié)果基礎(chǔ)之上，進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，以獲得循環(huán)腫瘤細(xì)胞的類別分布和各類別的數(shù)量，然后分析出患者癌癥轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)大小。

所述結(jié)果輸出模塊中的直接顯示區(qū)用于顯示循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)模塊中的測(cè)量結(jié)果，所述統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示區(qū)用于顯示細(xì)胞統(tǒng)計(jì)算法計(jì)算得到的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

本發(fā)明提供了一種基于拉曼光譜的循環(huán)腫瘤細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的有益效果在于：

(1)與基于免疫磁珠的CTCs富集方法相比，本發(fā)明中的微通孔富集法對(duì)絕大部分CTCs均可富集，而免疫磁珠只能富集擁有特定抗原的CTCs；

(2)與基于免疫熒光的CTCs檢測(cè)方法相比，本發(fā)明采用特征拉曼光譜進(jìn)行CTCs的檢測(cè)，可檢出的CTCs種類更多，且不存在免疫熒光的假陽(yáng)性問(wèn)題，大大降低了漏檢率和誤檢率；

(3)與免疫法相比，拉曼光譜檢測(cè)是物理過(guò)程，無(wú)需消耗生化試劑，避免了昂貴的免疫試劑消耗，檢測(cè)成本低；

(4)本發(fā)明提供的自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)可自動(dòng)完成樣本處理、檢測(cè)與分析，集成度高，無(wú)需大量人工操作，便于臨床應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明提供的基于拉曼光譜的CTCs自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)框圖，框圖間的連線表示組成系統(tǒng)的各模塊間的關(guān)系。

圖2是利用本發(fā)明系統(tǒng)檢測(cè)獲得的肺癌CTCs細(xì)胞光學(xué)顯微鏡成像結(jié)果。

圖3是利用本發(fā)明系統(tǒng)檢測(cè)獲得的圖2對(duì)應(yīng)細(xì)胞的拉曼光譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種基于拉曼光譜的循環(huán)腫瘤細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由血樣處理模塊、循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)模塊、數(shù)據(jù)處理模塊和結(jié)果輸出模塊構(gòu)成；血樣處理模塊集成了血液自動(dòng)進(jìn)樣針筒、生化池、微通孔過(guò)濾芯片、血細(xì)胞裂解液、清洗液和機(jī)械臂；循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)模塊集成了光學(xué)顯微鏡、成像CCD、三維電動(dòng)樣品臺(tái)、激光器、光譜儀、濾光片和控制器；數(shù)據(jù)處理模塊集成了細(xì)胞顯微圖像識(shí)別算法、拉曼光譜處理分析算法、細(xì)胞統(tǒng)計(jì)算法和數(shù)據(jù)庫(kù)；結(jié)果輸出模塊集成了循環(huán)腫瘤細(xì)胞測(cè)試結(jié)果的直接顯示區(qū)和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示區(qū)。該系統(tǒng)的工作過(guò)程如下：

(1)將從癌癥患者身上采集的靜脈血放入檢測(cè)系統(tǒng)入口，系統(tǒng)的血樣處理模塊自動(dòng)抽取5ml血液，加入進(jìn)樣口，然后系統(tǒng)加入血細(xì)胞裂解液，自動(dòng)震蕩混勻，保持8分鐘，此時(shí)血液中絕大部分紅細(xì)胞和白細(xì)胞被裂解?？刂屏呀夂蟮囊后w進(jìn)入過(guò)濾區(qū)，通過(guò)微通孔芯片進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾完成后系統(tǒng)加入緩沖液沖洗、再過(guò)濾，使裂解殘?jiān)粡氐走^(guò)濾，此時(shí)幾乎全部的CTCs和未被裂解的少量白細(xì)胞和紅細(xì)胞被截留在微通孔芯片表面。

(2)系統(tǒng)控制微通孔芯片與血液處理模塊分離，將其自動(dòng)轉(zhuǎn)移到CTCs檢測(cè)模塊中三維電動(dòng)樣品臺(tái)上固定。

(3)通過(guò)控制樣品臺(tái)移動(dòng)，CTCs檢測(cè)模塊通過(guò)圖像識(shí)別對(duì)芯片表面的細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)對(duì)焦，然后進(jìn)行光學(xué)顯微成像，通過(guò)細(xì)胞圖像識(shí)別自動(dòng)獲取每一個(gè)細(xì)胞的形狀、空間位置。

(4)系統(tǒng)對(duì)成像的細(xì)胞依次自動(dòng)進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，系統(tǒng)根據(jù)光學(xué)成像結(jié)果依次將各個(gè)細(xì)胞的中心定位到拉曼檢測(cè)激光的焦點(diǎn)處，拉曼檢測(cè)的激光波長(zhǎng)為

785nm，一次測(cè)量的積分時(shí)間為10s。

(5)每獲得一個(gè)細(xì)胞的拉曼光譜后，系統(tǒng)自動(dòng)將數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)傳輸?shù)椒治瞿K中，分析模塊首先對(duì)接收到的拉曼光譜進(jìn)行背景去除、降噪以及擬合預(yù)處理，然后將處理后的數(shù)據(jù)與系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。數(shù)據(jù)庫(kù)包含所有紅細(xì)胞、白細(xì)胞(種類固定)的拉曼光譜和部分CTCs細(xì)胞的拉曼光譜，若分析結(jié)果顯示所測(cè)細(xì)胞屬于正常的血細(xì)胞，則該細(xì)胞不再標(biāo)記，結(jié)果不統(tǒng)計(jì)，若分析結(jié)果顯示所測(cè)細(xì)胞屬于數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的CTCs細(xì)胞，則對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，并進(jìn)行類別和數(shù)量統(tǒng)計(jì)，若分析結(jié)果顯示所測(cè)細(xì)胞不屬于數(shù)據(jù)庫(kù)中的任何細(xì)胞，則對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記和單獨(dú)歸類，并統(tǒng)計(jì)數(shù)量。

(6)完成所有細(xì)胞測(cè)試與分析后，將所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果通過(guò)顯示模塊顯示到屏幕上，包括CTCs和未知細(xì)胞的光學(xué)顯微圖像(如附圖2所示，其中21為微通孔，22為CTCs肺癌細(xì)胞)和對(duì)應(yīng)的拉曼光譜圖像(如附圖3所示)，以及統(tǒng)計(jì)分析的CTCs惡性肺癌細(xì)胞368個(gè)，未知細(xì)胞133個(gè)，患者處于癌癥轉(zhuǎn)移擴(kuò)散高危期。

本發(fā)明未詳細(xì)闡述的部分屬于本領(lǐng)域的公知技術(shù)，盡管上述內(nèi)容對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述和說(shuō)明，以便于本技術(shù)領(lǐng)的技術(shù)人員理解本發(fā)明，但應(yīng)該清楚，本發(fā)明不限于具體實(shí)施方式的范圍，對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)講，只要各種變化在所附的權(quán)利要求限定和確定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，這些變化是顯而易見(jiàn)的，一切利用本發(fā)明構(gòu)思的發(fā)明創(chuàng)造均在保護(hù)之列。