本發(fā)明是關(guān)于一種利用蛋白質(zhì)熱熔解方法廣泛分析膜蛋白質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定分析儀。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)是組成人體細(xì)胞、組織的重要成分，其多種多樣的功能與各種蛋白質(zhì)特定的空間構(gòu)象密切相關(guān)，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象是其功能活性的基礎(chǔ)，然而蛋白質(zhì)在某些物理或化學(xué)因素作用下其特定的空間構(gòu)象會被改變，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性喪失，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性除由自身的空間構(gòu)象，如氨基酸組成、氫鍵、二硫鍵，疏水鍵決定之外，還取決于蛋白質(zhì)儲存或反應(yīng)緩沖液中的pH值、鹽濃度及各種輔助因子的條件，無論是在工業(yè)生產(chǎn)酶的使用還是在醫(yī)藥領(lǐng)域蛋白質(zhì)藥物的應(yīng)用上，人們都希望蛋白質(zhì)具有好的穩(wěn)定性使其使用效率提高，且便于儲存和運輸，因此，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性篩選歷來是蛋白質(zhì)研究的一項重要內(nèi)容。

科學(xué)家們使用多種方法研究蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，包括生物傳感器、量熱儀和圓二色譜等，但是這些方法具有價格昂貴或低通量性等缺點，而近年來應(yīng)用日益廣泛的蛋白質(zhì)熱熔解方法能以高通量的形式，借助某些染料快速廉價地篩選出穩(wěn)定的蛋白質(zhì)樣品，迅速縮小研究范圍，為后續(xù)更多實驗提供基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)熱熔解方法是將蛋白質(zhì)與相應(yīng)的染料混合，在連續(xù)的升溫過程中蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象會遭到破壞，染料與特定基團結(jié)合而產(chǎn)生熒光信號，實時采集此熒光信號，最終形成目的蛋白質(zhì)在某一條件下特異的溫度—熒光曲線，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、溶液的pH值、鹽濃度或緩沖液組分的變化反映為此熒光圖像以及由此計算出的Tm值(熔解溫度)的相對變化，熒光圖像和Tm值的差異可以反映出蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，Tm值越高，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性越好，因此，根據(jù)不同突變蛋白質(zhì)在相同條件下的熒光圖像和Tm值的相應(yīng)變化，可以分析突變對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響，根據(jù)相同蛋白質(zhì)樣品在不同條件下的熒光圖像和Tm值的相應(yīng)變化，可以分析溶液條件或配體對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響。

目前，蛋白質(zhì)熱熔解實驗都是借助實時熒光定量PCR儀可以連續(xù)升溫、實時熒光檢測的特點在實時熒光定量PCR儀上進行的，實時熒光定量PCR儀做蛋白質(zhì)熱熔解實驗具有通量高、反應(yīng)迅速的優(yōu)勢，但是最大的局限在于這類儀器的熒光檢測范圍不足以完全滿足蛋白質(zhì)熔解實驗的需要，例如，對于可溶性蛋白質(zhì)，主要是利用syproorange染料在綠光通道(激發(fā)光為470nm左右，熒光為510～530nm，不同型號儀器略有差異)分析，可實際上，sypro orange最合適的波長是激發(fā)光470nm和熒光570nm，綠光通道的發(fā)射光與最適波長有較大偏差；再例如，市面上無論是進口還是國產(chǎn)的熒光定量PCR產(chǎn)品的熒光檢測范圍多是510nm綠光以上波長，而膜蛋白質(zhì)染料CPM(激發(fā)光384nm，發(fā)射光470nm)的合適波長在藍(lán)光通道(激發(fā)光為365nm，熒光為460nm)，即膜蛋白質(zhì)實驗在普通熒光定量PCR儀上完全無法進行。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種熒光檢測范圍廣，能夠同時完成膜蛋白質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性分析的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定分析儀。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下方法方案：一種蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定分析儀，其特征在于，該分析儀包括樣品倉、旋轉(zhuǎn)電機、控制系統(tǒng)和光學(xué)檢測系統(tǒng)；所述樣品倉為封閉隔熱式腔體，所述樣品倉內(nèi)設(shè)置有一可旋轉(zhuǎn)樣品盤，所述可旋轉(zhuǎn)樣品盤頂部周向間隔設(shè)置若干用于放置蛋白質(zhì)樣品的樣品容器，所述旋轉(zhuǎn)電機輸出端穿過所述樣品倉固定連接所述可旋轉(zhuǎn)樣品盤，所述控制系統(tǒng)電連接所述旋轉(zhuǎn)電機和樣品倉；所述光學(xué)檢測系統(tǒng)包括雙波長激發(fā)光光源和光纖光譜儀，所述雙波長激發(fā)光光源將某一波長激發(fā)光進入所述樣品倉發(fā)射到所述蛋白質(zhì)樣品上方，經(jīng)激發(fā)光激發(fā)所述蛋白質(zhì)樣品產(chǎn)生的熒光發(fā)射到位于所述樣品倉外部的光纖光譜儀，所述光纖光譜儀將檢測到的熒光信號轉(zhuǎn)換為熒光強度數(shù)據(jù)并發(fā)送到所述控制系統(tǒng)，所述控制系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)處理完成所述蛋白質(zhì)樣品的熱穩(wěn)定性分析。

優(yōu)選地，所述樣品倉的封閉隔熱式腔體采用半導(dǎo)體材料，所述控制系統(tǒng)對所述樣品倉內(nèi)的溫度控制范圍為10℃～100℃，溫控精度為0.1℃，升降溫速率為1℃～3℃每分鐘。

優(yōu)選地，所述控制系統(tǒng)采用計算機，所述計算機內(nèi)設(shè)置有電機控制單元、溫度控制單元和數(shù)據(jù)處理單元，所述電機控制單元用于控制所述旋轉(zhuǎn)電機進而控制所述可旋轉(zhuǎn)樣品盤的轉(zhuǎn)動；所述溫度控制單元用于控制所述樣品倉內(nèi)的溫度進而控制所述蛋白質(zhì)樣品的溫度；所述數(shù)據(jù)處理單元用于將接收到的熒光強度數(shù)據(jù)與所述蛋白質(zhì)樣品溫度數(shù)據(jù)進行處理得到所述蛋白質(zhì)樣品熒光強度與溫度的關(guān)系。

優(yōu)選地，所述雙波長激發(fā)光光源發(fā)出的某一波長激發(fā)光經(jīng)激發(fā)光光纖導(dǎo)入所述樣品倉內(nèi)。

優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)樣品經(jīng)激發(fā)光激發(fā)產(chǎn)生的熒光經(jīng)發(fā)射光光纖導(dǎo)出所述樣品倉被所述光纖光譜儀接收。

優(yōu)選地，所述雙波長激發(fā)光光源的波長采用365nm和470nm，兩個不同波長的激發(fā)光光源通過手動進行切換實現(xiàn)膜蛋白質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性分析。

優(yōu)選地，所述光纖光譜儀的檢測范圍為200nm～760nm連續(xù)可調(diào)。

優(yōu)選地，所述樣品容器采用樣品管。

本發(fā)明由于采取以上方法方案，其具有以下優(yōu)點：1、本發(fā)明的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定分析儀，與實時熒光定量PCR儀相比，采用可切換365nm和470nm波長的雙波長激發(fā)光光源，200～760nm任意波長檢測的光纖光譜儀，因此能夠?qū)崿F(xiàn)利用熱熔解方法廣泛分析膜蛋白質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。2、本發(fā)明通過控制系統(tǒng)控制樣品倉的溫度范圍為10～100℃，能完全滿足蛋白熔解實驗所需要的溫度環(huán)境。3、本發(fā)明采用高通量且可以通過改變可旋轉(zhuǎn)樣品盤的規(guī)格提高通量的設(shè)計，在一至兩小時內(nèi)可以獲得批量樣品結(jié)果。3、本發(fā)明的光學(xué)檢測系統(tǒng)采用后分光的光纖光譜儀，可以避免激發(fā)光光源對發(fā)射光信號造成的干擾。綜上，本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡單，可以廣泛用于檢測膜蛋白質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性中。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定分析儀的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖來對本發(fā)明進行詳細(xì)的描繪。然而應(yīng)當(dāng)理解，附圖的提供僅為了更好地理解本發(fā)明，它們不應(yīng)該理解成對本發(fā)明的限制。

如圖1所示，本發(fā)明的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定分析儀包括樣品倉(圖中未示出)、旋轉(zhuǎn)電機1、控制系統(tǒng)2和光學(xué)檢測系統(tǒng)，光學(xué)檢測系統(tǒng)包括激發(fā)光光源3、激發(fā)光光纖4、發(fā)射光光纖5和光纖光譜儀6，且激發(fā)光光源3為波長可切換的雙波長激發(fā)光光源3；

樣品倉為一具有精確控溫功能的封閉隔熱式腔體，樣品倉內(nèi)設(shè)置有一可旋轉(zhuǎn)樣品盤7，可旋轉(zhuǎn)樣品盤7頂部周向間隔設(shè)置若干用于放置蛋白質(zhì)樣品的樣品容器8，旋轉(zhuǎn)電機1的輸出端穿過樣品倉固定連接可旋轉(zhuǎn)樣品盤7底部中心，控制系統(tǒng)2分別電連接旋轉(zhuǎn)電機1和樣品倉，控制系統(tǒng)2通過旋轉(zhuǎn)電機1控制可旋轉(zhuǎn)樣品盤7轉(zhuǎn)動，且控制系統(tǒng)2通過控制樣品倉內(nèi)溫度進而控制蛋白質(zhì)樣品溫度；

雙波長激發(fā)光光源3將某一波長激發(fā)光通過激發(fā)光光纖4經(jīng)樣品倉發(fā)射到蛋白質(zhì)樣品的上方，樣品倉升溫過程中蛋白質(zhì)樣品去折疊而與染料結(jié)合，經(jīng)激發(fā)光激發(fā)蛋白質(zhì)樣品產(chǎn)生的熒光發(fā)射到位于樣品倉外部的光纖光譜儀6，光纖光譜儀6將檢測到的熒光信號轉(zhuǎn)換為熒光強度數(shù)據(jù)并發(fā)送到控制系統(tǒng)2，控制系統(tǒng)2進行數(shù)據(jù)處理完成蛋白質(zhì)樣品的熱穩(wěn)定性分析。

在一個優(yōu)選的實施例中，樣品倉的封閉隔熱式腔體可以采用半導(dǎo)體材料，且控制系統(tǒng)2對樣品倉內(nèi)的溫度控制范圍為10℃～100℃，溫控精度為0.1℃，升降溫速率為1℃～3℃每分鐘。

在一個優(yōu)選的實施例中，樣品倉底部設(shè)置有一用于穿設(shè)旋轉(zhuǎn)電機1的第一通孔，第一通孔上方固定設(shè)置一用于固定連接可旋轉(zhuǎn)樣品盤7的軸承座，樣品倉外壁設(shè)置用于穿設(shè)激發(fā)光光纖4和發(fā)射光光纖5的通孔。

在一個優(yōu)選的實施例中，樣品容器8可以采用樣品管。

在一個優(yōu)選的實施例中，控制系統(tǒng)2可以采用計算機，計算機內(nèi)設(shè)置有電機控制單元21、溫度控制單元22和數(shù)據(jù)處理單元23，電機控制單元21用于通過旋轉(zhuǎn)電機1控制可旋轉(zhuǎn)樣品盤7轉(zhuǎn)動；溫度控制單元22用于控制樣品倉內(nèi)的溫度進而控制蛋白質(zhì)樣品溫度；數(shù)據(jù)處理單元23用于將接收到的熒光強度數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)樣品溫度數(shù)據(jù)進行處理得到蛋白質(zhì)樣品熒光強度與溫度的關(guān)系。

在一個優(yōu)選的實施例中，雙波長激發(fā)光光源3的波長可以采用365nm和470nm，兩個不同波長的激發(fā)光光源3可以手動進行切換實現(xiàn)膜蛋白質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性分析。

在一個優(yōu)選的實施例中，光纖光譜儀6的檢測范圍為200nm～760nm連續(xù)可調(diào)。

下面通過具體實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定分析儀對蛋白質(zhì)樣品的檢測過程：

實驗中可通過sypro orange染料(激發(fā)光為470nm、熒光為570nm)分析可溶性蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，通過CPM染料(激發(fā)光為為384nm、熒光為470nm)分析膜蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，本實施例以可溶性蛋白質(zhì)進行詳細(xì)說明：

1)將加入sypro orange染料的可溶性蛋白質(zhì)樣品的若干待測樣品管分別放入可旋轉(zhuǎn)樣品盤7上，并將雙波長激發(fā)光光源3切換為470nm波長，打開激發(fā)光光源3使激發(fā)光通過激發(fā)光光纖4發(fā)射至樣品管8上方；

2)調(diào)節(jié)光纖光譜儀6使光纖光譜儀6只檢測波長為570nm的熒光信號，通過溫度控制單元22控制樣品倉內(nèi)的溫度及升溫速率，通過電機控制單元21控制可旋轉(zhuǎn)樣品盤7轉(zhuǎn)速，使樣品管8逐一處于激發(fā)光光纖4的出光端，激發(fā)光光源3通過激發(fā)光光纖4發(fā)射到可溶性蛋白質(zhì)樣品中，sypro orange染料經(jīng)激發(fā)光激發(fā)產(chǎn)生波長為570nm的熒光經(jīng)發(fā)射光光纖5發(fā)射到光纖光譜儀6；

3)光纖光譜儀6將接受到的570nm的熒光信號轉(zhuǎn)換為熒光強度數(shù)據(jù)并發(fā)送到控制系統(tǒng)2中，數(shù)據(jù)處理單元23將得到的可溶性蛋白質(zhì)樣品熒光強度數(shù)據(jù)和溫度數(shù)據(jù)進行擬合得到可溶性蛋白質(zhì)樣品升溫過程中每一可溶性蛋白質(zhì)樣品所對應(yīng)的溫度—熒光強度曲線；

3)根據(jù)可溶性蛋白質(zhì)樣品的溫度—熒光強度曲線中熒光信號迅速變強時對應(yīng)的溫度得到該條件下相應(yīng)可溶性蛋白質(zhì)樣品的Tm值，進而可以分析可溶性蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

上述各實施例僅用于說明本發(fā)明，其中各部件的結(jié)構(gòu)、連接方式和制作工藝等都是可以有所變化的，凡是在本發(fā)明方法方案的基礎(chǔ)上進行的等同變換和改進，均不應(yīng)排除在本發(fā)明的保護范圍之外。