本發(fā)明涉及高通量篩選領(lǐng)域，具體涉及一種基于生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)現(xiàn)活性成分以及活性組合物的方法。

背景技術(shù)：

據(jù)統(tǒng)計(jì)，從1981年到2010年的30年間，約有34％的新藥來源于天然產(chǎn)物。作為天然產(chǎn)物在臨床使用的一個(gè)重要來源，中藥在幾千年的歷史長河中對中國人民的醫(yī)療保健起著十分重要的作用。尤其在治療復(fù)雜的慢性疾病方面，中藥療效良好且副作用較低，這使得越來越多的人意識到從中藥中尋找潛在的生物活性物質(zhì)很可能會(huì)提高藥物發(fā)現(xiàn)的速率和效率。

建立一種高效快速的篩選方法找到中藥中的生物活性成分對于新藥的研發(fā)具有十分重要的意義。傳統(tǒng)發(fā)現(xiàn)中藥活性成分的方法是在中藥化學(xué)成分提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定基礎(chǔ)上，利用分子和細(xì)胞、離體器官和組織、整體動(dòng)物等藥理模型對得到的單體化合物進(jìn)行生物活性測試。該方法利用各種提取分離技術(shù)(如薄層色譜、低中壓柱色譜、逆流色譜、制備色譜法)分離制備中藥中的各種成分，經(jīng)藥理活性測試后確定其有效成分，操作繁瑣，周期長，最后分離得到的化合物可能沒有活性或不是所需要的，是一種命中率較低的篩選方法。將中藥天然產(chǎn)物庫和高通量篩選技術(shù)集成，應(yīng)用高通量篩選模型對中藥化合物庫進(jìn)行篩選的方法已成為目前創(chuàng)新藥物的重要技術(shù)手段之一。高通量篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合而形成的新的技術(shù)體系，它以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過程，以靈敏快速的檢測儀器釆集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)了較短時(shí)間內(nèi)對數(shù)以千、萬計(jì)的樣品進(jìn)行活性評價(jià)，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫支持整個(gè)技術(shù)體系的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。高通量篩選技術(shù)由于其快速、高效、分析樣本量大等特點(diǎn)，在尋找新的活性化合物方面有非常的優(yōu)勢。

此外，不同于西藥“單一藥物作用于單一靶點(diǎn)”的作用模式，中藥發(fā)揮療效是其中多個(gè)功能組分的整體表現(xiàn)，是多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的結(jié)果。

中藥具有多成分組成，多靶點(diǎn)治療的特色。隨著科學(xué)的進(jìn)步，人們對于中藥的認(rèn)識發(fā)生了一定的改變，越來越多的研究者意識到，中藥發(fā)揮藥效并不是單個(gè)成分作用的簡單疊加，多成分彼此之間存在某種作用關(guān)系，或加和或協(xié)同或拮抗，它們可作用于多個(gè)靶點(diǎn)相互影響，從整體上發(fā)揮藥效。因此，建立某種方法發(fā)現(xiàn)具有協(xié)同作用的藥物組合對于新藥的研發(fā)具有非常重要的意義。

本發(fā)明要解決的問題在于：建立一種基于在線生物化學(xué)反應(yīng)的集生物活性成分的發(fā)現(xiàn)、分離與鑒定于一體，同時(shí)也能用于探究多成分間相互作用的篩選方法。

技術(shù)方案

本發(fā)明涉及一種篩選活性成分的方法，其特征是，步驟如下：

(1)將準(zhǔn)備好的樣品自動(dòng)進(jìn)樣，在一定的洗脫條件下分離待測物，同時(shí)補(bǔ)償泵調(diào)節(jié)洗脫液中的有機(jī)相，使之維持在一個(gè)恒定的范圍內(nèi)；調(diào)節(jié)后的洗脫液流經(jīng)酶泵，在第一個(gè)反應(yīng)線圈中與酶溶液相互作用；然后混合液經(jīng)過底物泵，在第二個(gè)反應(yīng)線圈中酶催化底物，觀察產(chǎn)物吸收波長(470nm)下是否有倒峰生成，實(shí)現(xiàn)活性成分的分離及篩選；

待測物的分離以及洗脫液補(bǔ)償?shù)挠袡C(jī)溶劑可以是甲醇、或、乙腈；

待測物可以是單體化合物、由單體組成的組合物、天然產(chǎn)物提取物、或、中藥復(fù)方提取物；

參與反應(yīng)的酶是以過氧化氫為底物，以愈創(chuàng)木酚為顯色劑，含有血紅素的過氧化物酶家族中的一員，來源可以是動(dòng)物、植物、或、微生物；

(2)利用質(zhì)譜技術(shù)對活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；

(3)圍繞活性成分自由組合，利用在線裝置探究其作用關(guān)系。

本發(fā)明涉及的方法，其特征在于，分離泵和補(bǔ)償泵的流速一般一致，可以是0.2～0.5mL/min；優(yōu)選地，流速為0.25mL/min。

本發(fā)明涉及的方法，其特征在于，用于樣品分離和洗脫液補(bǔ)償?shù)乃嗳軇┛梢允羌兯?、或、酸水溶液，酸水溶液可以是pH為1-3的甲酸、或、乙酸。

本發(fā)明涉及的方法，其特征在于，第二個(gè)反應(yīng)線圈的長度可以是40～120cm；優(yōu)選地，反應(yīng)線圈2的長度為100cm；反應(yīng)線圈2的內(nèi)徑可以是0.5～0.8mm；優(yōu)選地，反應(yīng)線圈2的內(nèi)徑是0.8mm。

本發(fā)明涉及的方法，其特征在于，酶的濃度可以是0.5～2.5U/mL；優(yōu)選地，酶溶液的濃度為2U/mL。

本發(fā)明涉及的方法，其特征在于，底物過氧化氫和顯色劑愈創(chuàng)木酚的濃度可以是0.5～25mM；優(yōu)選地，底物過氧化氫和顯色劑愈創(chuàng)木酚的濃度均為25mM。

本發(fā)明涉及的方法，其特征在于，用0.2mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液溶解酶和底物、顯色劑。

本發(fā)明涉及的方法，其特征在于，待測化合物可以是表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、楊梅素、丹參素、紫草酸、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸D、或、迷迭香酸中的一種、或、幾種，也可以是含有這些成分的中藥提取物、或、中藥復(fù)方提取物。

本發(fā)明涉及的方法，其特征在于，組合物可以是上一條特征中提及的任意兩種、或、多種單體成分的組合。

本發(fā)明涉及的儀器：在運(yùn)用在線裝置實(shí)現(xiàn)活性成分篩選的過程中，待測物經(jīng)過液相分離后直接與泵入裝置中的酶以及底物發(fā)生反應(yīng)?？紤]到成分洗脫時(shí)流動(dòng)相中含有的有機(jī)溶劑會(huì)影響酶活性，在化合物參與生物活性測定之前需要有一個(gè)流動(dòng)相補(bǔ)償體系來調(diào)節(jié)洗脫液中有機(jī)溶劑的含量，以確保反應(yīng)順利進(jìn)行。因此，整套在線裝置由Agilent液相的7個(gè)模塊構(gòu)成，涉及的儀器包括1個(gè)自動(dòng)進(jìn)樣器(1100系列)，1個(gè)柱溫箱(1100系列)，1個(gè)多波長DAD檢測器(1100系列)以及4個(gè)高效液相泵(二元泵或四元泵)，這些泵分別用于實(shí)現(xiàn)待測物的分離、流動(dòng)相的補(bǔ)償，提供酶以及底物。

附圖說明

圖1：實(shí)施例1中EGCG在不同濃度下對過氧化物酶的抑制作用。

圖2：實(shí)施例2中運(yùn)用在線裝置篩選待測混合物中抑制過氧化物酶的活性成分。

圖3：實(shí)施例2中過氧化物酶樣品和空白樣品分別與待測混合物孵育、超濾后的高效液相色譜圖。

圖4：實(shí)施例3中運(yùn)用在線裝置篩選丹參水提取物中抑制過氧化物酶的有效物質(zhì)。

圖5：實(shí)施例4中運(yùn)用在線裝置探究EGCG與EGC之間對過氧化物酶的相互作用。

圖6：實(shí)施例6中探究待測物分離體系內(nèi)有機(jī)溶劑對過氧化物酶活性的影響。

圖7：實(shí)施例6中考察分離流速對產(chǎn)物峰響應(yīng)程度的影響。

圖8：實(shí)施例7中基于在線生物化學(xué)反應(yīng)篩選活性成分的裝置圖。

進(jìn)一步的具體解釋

圖2其中，峰1是EGC，峰2是芍藥苷，峰3是ECG，峰4是柚皮苷，峰5是橙皮苷，峰6是楊梅素。

圖3其中，虛線示空白樣品與待測混合物孵育、超濾后的高效液相色譜圖，實(shí)線示過氧化物酶與待測混合物孵育、超濾后的高效液相色譜圖。其中，峰1是EGC，峰3是ECG，峰4是柚皮苷，峰5是橙皮苷，峰6是楊梅素。

圖5其中，符號“*”代表顯著性差異值P<0.05；符號“#”代表顯著性差異值P<0.01。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行描述，更好地理解本發(fā)明，本發(fā)明不受具體實(shí)施方式的限制。

實(shí)施例1

測定表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對過氧化物酶的作用

試劑與耗材：乙腈、甲酸(HPLC級，德國Merck公司)；Agilent ZorBax SB-C18分析柱，規(guī)格為250×4.6mm，5μm(美國Agilent公司)；過氧化物酶(華中海威基因科技有限公司)、愈創(chuàng)木酚(阿拉丁試劑(上海)有限公司)、DMSO(美國Sigma公司)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、30％的過氧化氫溶液(江蘇南京化學(xué)試劑有限公司)

0.2mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)的配制：

A液：精密稱取磷酸二氫鈉(NaH₂PO4·2H2O)31.2g，加入1000mL超純水超聲溶解。

B液：精密稱取磷酸氫二鈉(Na₂HPO4·12H2O)14.34g，加入200mL超純水超聲溶解。

取877mL A液與123mL B液充分混勻即可獲得0.2mol/L pH 6.0的PBS緩沖液，置于4℃冰箱中保存。

過氧化物酶溶液的制備：

過氧化物酶凍干粉3000U(來源于辣根，type-VI)，用1mL PBS緩沖液溶解，濃度為3000U/mL，分裝后置于-20℃冰箱保存。每次使用前用PBS緩沖液稀釋至2U/mL。

底物及顯色劑溶液的配制：

取200mL PBS緩沖液于250mL的燒杯中，加入560μL愈創(chuàng)木酚，于磁力攪拌器上加熱攪拌。待愈創(chuàng)木酚完全溶解后，置于4℃冰箱冷卻過夜。隔天向其中加入500μL 30％的過氧化氫溶液，充分混合?；旌弦褐羞^氧化氫及愈創(chuàng)木酚的濃度均為25mM?；旌弦褐糜?℃冰箱中保存。

EGCG溶液的配制：

精密稱取一定量的EGCG，用DMSO溶液溶解，配成100mM的母液，置于-20℃冰箱保存。

運(yùn)用在線裝置檢測EGCG對過氧化物酶的作用：

取一定量的100mM的EGCG溶液，用PBS溶解至初濃度為2mM,并依次對半稀釋5次。在不接色譜柱，直接用二通閥連接儀器的情況下將6個(gè)濃度梯度變化的待測液依次進(jìn)樣。其中，進(jìn)樣量50μL，分離泵以0.25mL/min的流速，0.1％甲酸水-乙腈10:90的梯度等度洗脫3min，補(bǔ)償泵以相同的流速，純水-純乙腈40:60的梯度持續(xù)調(diào)節(jié)裝置內(nèi)有機(jī)相的比例。酶和底物則以0.1mL/min的流速持續(xù)泵入裝置。柱溫25℃，檢測波長240和270nm。若待測物對過氧化物酶有抑制作用，它與酶混合時(shí)會(huì)降低酶的活性，減少產(chǎn)物的生成，在化合物對應(yīng)的色譜峰位置產(chǎn)物吸收波長470nm下形成倒峰。

檢測結(jié)果：

EGCG作用于過氧化物酶后在470nm下有倒峰生成，且倒峰程度與EGCG的濃度正相關(guān)，表明EGCG對過氧化物酶有抑制作用(見附圖1)。計(jì)算6個(gè)濃度下EGCG對過氧化物酶的抑制率，利用軟件模擬其作用曲線，測得EGCG的IC₅₀為13.69μM。

酶標(biāo)儀方法驗(yàn)證：

測定方法：

取100μL待測物與15μL的過氧化物酶(1U/mL)于96孔板中混合均勻，在室溫下共同孵育10min，再向其中加入85μL的反應(yīng)混合液(0.5mM)，利用酶標(biāo)儀(POLARstar Omega，德國BMG Labtech)測定470nm下吸光度的變化?？瞻讓φ战M以PBS緩沖液代替待測物。

測定EGCG的抑制作用：

取一定量的100mM EGCG母液，用PBS緩沖液稀釋至初濃度為100μM,再對半稀釋5次，得到6個(gè)濃度梯度變化的EGCG溶液。用上述測定方法依次測定不同濃度下EGCG對過氧化物酶的作用?？瞻讓φ战M以PBS緩沖液代替EGCG。

測定結(jié)果：

EGCG對過氧化物酶的抑制呈現(xiàn)濃度依賴性。根據(jù)不同濃度下的抑制率，用酶標(biāo)儀測得EGCG的IC₅₀值為19.18μM，與在線裝置測定結(jié)果相近，初步證明了該在線裝置用于檢測過氧化物酶活性的有效性。

實(shí)施例2

比較在線裝置和超濾對待測混合物的篩選

待測混合物組成：

表沒食子兒茶素(EGC)，表兒茶素沒食子酸酯(ECG)，芍藥苷，楊梅素，橙皮苷，柚皮苷

待測混合液的配制：

每個(gè)物質(zhì)精密稱取一定量，用DMSO溶液溶解成100mM的母液。每個(gè)物質(zhì)各取一定的量混合，再用PBS溶液稀釋，使得待測混合液中每個(gè)物質(zhì)的初濃度為5mM，用于在線篩選。此外，用相同的方法配制另一份待測混合液，使其中每個(gè)物質(zhì)的初濃度為100μM，用于超濾篩選。

運(yùn)用在線裝置篩選待測混合液中抑制過氧化物酶的活性成分：

液相條件：

色譜柱：Agilent ZorBax SB-C18柱(4.6×250mm，5μm)。

柱溫：25℃；

流動(dòng)相：A相為0.1％甲酸水，B相為乙腈；

分離泵流速：0.25mL/min；

分離梯度：

0min，13％B；

12min，13％B；

20min，21％B；

50min，23％B；

65min，28％B；

77min，45％B；

90min，45％B。

補(bǔ)償體系：A相為純水，B相為乙腈；

補(bǔ)償泵流速：0.25mL/min；

補(bǔ)償梯度：

0min，37％B；

12min，37％B；

20min，29％B；

50min，27％B；

65min，22％B；

77min，5％B；

90min，5％B。

酶泵：0.1mL/min

底物泵：0.1mL/min：

進(jìn)樣量：50μL；檢測波長：240nm及470nm。

運(yùn)用Agilent 1260液相系統(tǒng)偶聯(lián)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-TOF/MS)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定：

液相條件：進(jìn)樣量5μL，檢測波長240nm，其余洗脫條件與在線篩選的分離條件一致。

質(zhì)譜條件：ESI離子源：負(fù)離子模式；質(zhì)量范圍：200～800；毛細(xì)管電壓(Capillary voltage)：3500V；干燥氣(N₂)流速：10.0L/min；干燥氣溫度(Drying gas temperature)：330℃；霧化氣壓力(Nebulizer)：35psig；裂解電壓(Fragmentor)：120～420V。

篩選結(jié)果：6個(gè)化合物中有3個(gè)成分對過氧化物酶有抑制作用，分別對應(yīng)色譜峰1，3和6，其余3個(gè)化合物沒有作用(見附圖2)。通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及標(biāo)準(zhǔn)品比對，這3個(gè)活性物質(zhì)分別是表沒食子兒茶素(EGC，色譜峰1)，表兒茶素沒食子酸酯(ECG，色譜峰3)及楊梅素(色譜峰6)。

運(yùn)用在線裝置進(jìn)一步測定EGC、ECG以及楊梅素抑制過氧化物酶的IC₅₀值，分別為32.72，34.72及25.66μM。

超濾偶聯(lián)液質(zhì)技術(shù)篩選待測混合物中的過氧化物酶抑制劑：

實(shí)驗(yàn)組：2μL的待測混合液(初濃度100μM)與30μL過氧化物酶(濃度3000U/mL)混合，再加入PBS緩沖液使得溶液總體積為100μL。酶溶液與待測混合物在37℃恒溫箱中孵育30min，然后轉(zhuǎn)移至截留分子量為10KDa的YM-10型超濾管中。在13000r/min的轉(zhuǎn)速下離心20min，移除反應(yīng)體系內(nèi)不與酶作用的成分。再加入200μL的PBS緩沖液，13000r/min下離心20min清洗靶標(biāo)-配體復(fù)合物，重復(fù)操作3次。最后加入200μL甲醇-水混合液(體積比為1:1)，超聲15min使酶失活，13000r/min下離心20min釋放結(jié)合的配體。運(yùn)用液質(zhì)技術(shù)檢測收集的洗脫液。

對照組：用等體積的PBS緩沖液替代過氧化物酶，其余操作同實(shí)驗(yàn)組。

空白組：用等體積的PBS緩沖液替代過氧化物酶，在不超濾的情況下直接用液質(zhì)技術(shù)進(jìn)行檢測。

運(yùn)用Agilent 1290液相系統(tǒng)偶聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜測定解離下的洗脫液：

液相條件：與HPLC-TOF/MS質(zhì)譜鑒定的液相條件一致。

質(zhì)譜條件：ESI離子源：負(fù)離子模式；篩選模式：SIM模式；毛細(xì)管電壓(Capillary voltage)：3500V；干燥氣(N₂)流速：3.0L/min；干燥氣溫度(Drying gas temperature)：300℃；霧化氣壓力(Nebulizer)：15psig；裂解電壓(Fragmentor)：135V。各成分的離子質(zhì)荷比分別是：柚皮苷，579.4；橙皮苷，609.4；楊梅素，317.1；表沒食子兒茶素(EGC)，305.1；芍藥苷，449.4；表兒茶素沒食子酸酯(ECG)，441.3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：對比實(shí)驗(yàn)組和對照組的質(zhì)譜圖，除了芍藥苷(色譜峰2)，其他5個(gè)物質(zhì)均能夠被檢測到，表明這5個(gè)成分均能結(jié)合與氧化物酶(見附圖3)，與在線裝置篩選結(jié)果不一致。

酶標(biāo)儀方法驗(yàn)證：

從化合物單體的100mM母液中取一定的量，用PBS緩沖液稀釋至初濃度為1000μM,再對半稀釋8次，得到9個(gè)濃度梯度變化的待測液。依次測定這6個(gè)化合物在不同濃度下對過氧化物酶的作用。測定方法同實(shí)施例1。

測定結(jié)果：6個(gè)成分中只有EGC、ECG以及楊梅素對過氧化物酶表現(xiàn)出抑制作用，芍藥苷，橙皮苷及柚皮苷對過氧化物酶沒有影響。這一結(jié)果與在線裝置的篩選結(jié)果相吻合。用酶標(biāo)儀測得EGC、ECG以及楊梅素抑制過氧化物酶的IC₅₀值分別為45.23，29.10和28.11μM，與在線裝置測得的數(shù)據(jù)接近。

對比這兩種方法篩選結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基于生化反應(yīng)的在線篩選在提高篩選的準(zhǔn)確率，減少假陽性結(jié)果方面較超濾更有優(yōu)勢，也進(jìn)一步表現(xiàn)出在線裝置篩選結(jié)果的可靠性。

實(shí)施例3

運(yùn)用在線裝置篩選丹參水提物中抑制過氧化物酶的活性成分

丹參水溶性提取物的制備：

稱取丹參藥材粉末25g，加200mL超純水，加熱回流1h。過濾，濾液用40％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9左右，然后再加熱回流1h。過濾，濾液用凍干機(jī)凍干，密封后于-20℃冰箱中保存。

在線篩選：

精密稱取一定量的水溶性提取物凍干粉末，用純水溶解至1mg/mL,離心后取上清進(jìn)樣100μL。

色譜分析條件：

分離梯度：

0min，22％B；

25min，22％B；

40min，23％B；

55min，24％B；

67min，27％B；

77min，33％B。

補(bǔ)償梯度：

0min，28％B；

25min，28％B；

40min，27％B；

55min，26％B；

67min，23％B；

77min，17％B。

其余液相條件與實(shí)施例2中在線篩選液相條件一致。

運(yùn)用Agilent 1290液相系統(tǒng)偶聯(lián)四級桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定：

液相條件：進(jìn)樣量5μL，檢測波長240nm，其余洗脫條件與丹參水提物在線篩選的分離條件一致。

質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1000，毛細(xì)管電壓3500V，霧化氣壓力35psig，干燥氣流速10L/min，干燥氣溫度325℃，Skimmer 65V，二級碰撞能量為20、40、60、80eV。

篩選結(jié)果：

丹參水提物在該洗脫條件下分離出10個(gè)成分峰，除了色譜峰3(咖啡酸)在對應(yīng)的生物活性色譜圖中未出現(xiàn)倒峰，其余9個(gè)成分皆引起倒峰(見附圖4)。通過對比標(biāo)準(zhǔn)品，色譜峰1，2，4，7，8，9分別為丹參素，原兒茶醛，丹酚酸D，迷迭香酸，紫草酸以及丹酚酸B。色譜峰5，6，10因?yàn)槿鄙贅?biāo)準(zhǔn)品，只能對比文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，暫定為丹酚酸I，丹酚酸E以及丹酚酸L。各成分具體的離子碎片詳見表1。

利用在線裝置測得丹參素，原兒茶醛，丹酚酸D，迷迭香酸，紫草酸以及丹酚酸B抑制過氧化物酶的IC₅₀值分別為104.4，49.66，48.97，50.45，53.39和36.85μM。

酶標(biāo)儀方法驗(yàn)證：

精密稱取一定量的丹參素，原兒茶醛，咖啡酸、丹酚酸D，迷迭香酸，紫草酸以及丹酚酸B，DMSO溶解成100mM母液，吸取一定量后再用PBS緩沖液稀釋至初濃度為1000μM,對半稀釋8次，每個(gè)化合物得到9個(gè)濃度梯度變化的溶液，依次測定這7個(gè)化合物在不同濃度下對過氧化物酶的作用。測定方法同實(shí)施例1。

測定結(jié)果：

丹參素，原兒茶醛，丹酚酸D，迷迭香酸，紫草酸以及丹酚酸B均能夠抑制過氧化物酶，且IC₅₀值分別為111.03，59.17，68.69，47.74，36.97和37.90μM?？Х人釋^氧化物酶幾乎沒有作用，整體的結(jié)果與在線篩選結(jié)果一致，體現(xiàn)了該方法應(yīng)用于中藥活性成分篩選的有效性。

表1丹參水溶性提取物中各成分的結(jié)構(gòu)鑒定

實(shí)施例4

檢測多成分之間的相互作用

本實(shí)施例將圍繞過氧化物酶，用建立的在線裝置測定表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和表沒食子兒茶素(EGC)之間的相互作用。

檢測方法：EGCG和EGC按1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1和20∶1的物質(zhì)的量混合。在不接色譜柱，用二通閥連接儀器的情況下將這7組混合物依次進(jìn)樣，對形成的倒峰面積進(jìn)行積分并記錄。對于不同組合中的EGCG和EGC也分別單獨(dú)進(jìn)樣，記錄引起的倒峰面積。液相條件同實(shí)施例1。利用GraphPad prism軟件，對兩個(gè)單體引起的倒峰面積之和與它們的混合物引起的倒峰面積進(jìn)行T檢驗(yàn)。

檢測結(jié)果：

在不同比例下，混合物引起的倒峰面積都要顯著大于兩個(gè)單體作用產(chǎn)生的倒峰面積之和，即這兩個(gè)成分混合后對過氧化物酶的抑制效果要明顯強(qiáng)于兩個(gè)單體的作用之和，說明EGCG和EGC在抑制過氧化物酶時(shí)存在一種協(xié)同關(guān)系(見附圖5)。

酶標(biāo)儀方法驗(yàn)證：

以結(jié)合指數(shù)(Combination Index，CI)作為指標(biāo)(CI＝1，加和關(guān)系；CI＞1，拮抗關(guān)系；CI＜1，協(xié)同關(guān)系)，運(yùn)用酶標(biāo)儀方法進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)上述7種不同混合比例配制母液，再加入PBS對半稀釋8次，每個(gè)混合比例下得到一系列濃度梯度變化的待測液。利用實(shí)施例1中的測定方法，測定不同混合比例下EGCG和EGC混合物的IC₅₀值。再利用相關(guān)軟件計(jì)算CI值。

檢測結(jié)果：

不同比例下混合物的CI值都小于1，表明這兩個(gè)成分在抑制過氧化物酶上存在協(xié)同作用，與在線裝置的檢測結(jié)論一致，體現(xiàn)了該方法用于發(fā)現(xiàn)藥物協(xié)同組合的可行性。

實(shí)施例5

檢測丹參水提取物中多成分之間的相互作用

檢測過程：

將紫草酸與丹酚酸B分別與丹參素組合，測定它們之間的相互作用關(guān)系。每對組合的測定方法同實(shí)施例4一致。

檢測結(jié)果：

當(dāng)紫草酸和丹酚酸B分別與丹參素組合時(shí)，在不同混合比例下，混合物引起的倒峰面積與該組合中兩單獨(dú)成分引起的倒峰面積之和沒有顯著性差異，表明丹參素-紫草酸、丹參素-丹酚酸B這2對藥物組合對過氧化氫酶的抑制存在一種加和的效應(yīng)。

酶標(biāo)儀方法驗(yàn)證：

檢測操作如實(shí)施例4中所述酶標(biāo)儀驗(yàn)證的方法。

檢測結(jié)果：

如表2所示，藥物組合丹參素-紫草酸、丹參素-丹酚酸B在不同混合比例下，CI值都在1±0.1的范圍內(nèi)，表征了一種加和效應(yīng)。該結(jié)果與在線裝置的檢測結(jié)果一致，體現(xiàn)了該方法具有初步分析多成分之間相互作用關(guān)系的潛力。

表2酶標(biāo)儀測定3對組合在不同比例下的CI值

實(shí)施例6

對洗脫條件進(jìn)行考察及優(yōu)化

在酶催化反應(yīng)中，酶具有較高的活性，且與底物有足夠的反應(yīng)時(shí)間是反應(yīng)順利進(jìn)行的兩個(gè)必要因素。在該篩選方法中，待測物分離后直接進(jìn)行生物活性檢測。由于待測物分離體系中的流動(dòng)相含有有機(jī)溶劑，會(huì)對酶活性產(chǎn)生一定的抑制作用，影響催化反應(yīng)。此外，為了使酶與底物有足夠的反應(yīng)時(shí)間，整個(gè)體系中的流速都應(yīng)該盡可能的小，但是流速過低不利于化合物的良好分離。因此，選擇合適的有機(jī)溶劑以及分離流速有助于準(zhǔn)確地找到活性成分。

有機(jī)溶劑的優(yōu)化

當(dāng)有機(jī)溶劑含量為0時(shí)，酶視為具有正常活性，470nm基線上升到最高點(diǎn)。當(dāng)洗脫液中有機(jī)溶劑含量很高時(shí)能夠使酶發(fā)生不可逆的失活，酶視為被完全抑制，470nm基線下降到最低點(diǎn)。最高點(diǎn)和最低點(diǎn)間存在一個(gè)吸光度響應(yīng)變化，這個(gè)變化值即可表征酶在正常活性下催化底物完全生成的產(chǎn)物量?；诖耍瑢Ψ蛛x體系中的不同有機(jī)相進(jìn)行考察。

考察對象：液相分離中最常使用的有機(jī)溶劑——甲醇和乙腈

操作過程：

在不接色譜柱，不連補(bǔ)償泵，用二通閥連接儀器的情況下，設(shè)定某一初始梯度，平衡液相，走空針。

分離梯度為：

0min，初始梯度

5min，初始梯度；

6min，100％B；

18min，100％B。

記錄470nm下吸光度響應(yīng)變化值△A。

其余液相設(shè)置同實(shí)施例1。

有機(jī)相的初始比例分別設(shè)為0，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％以及100％，每個(gè)比例重復(fù)操作三遍。

根據(jù)公式：酶活性(％)＝(△A/△A₀)*100％(其中，△A₀是指有機(jī)相初始比例為0時(shí)測得的吸光度響應(yīng)變化值，△A指有機(jī)相初始比例為任一設(shè)定值時(shí)測得的吸光度響應(yīng)變化值)，計(jì)算不同有機(jī)溶劑在不同濃度下對酶活性的影響，并繪制有機(jī)溶劑濃度-酶活性關(guān)系圖(如附圖6)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：比較甲醇和乙腈兩種有機(jī)溶劑對過氧化物酶的影響，發(fā)現(xiàn)隨著流動(dòng)相中甲醇比例的增加，過氧化物酶活性降低地更快，即酶活性受到的損傷更大。當(dāng)甲醇含量在10％左右時(shí)，過氧化物酶僅維持40％左右的活性。所以，待測物的分離選用乙腈作為有機(jī)相。

由于酶活性過低時(shí)催化作用也不明顯，因此酶活力應(yīng)不低于50％，此時(shí)它對應(yīng)的乙腈在洗脫溶液中比例上限約為25％。由于待測物分離后會(huì)存在一個(gè)補(bǔ)償體系，且補(bǔ)償泵的流速和分離泵一致，因此分離時(shí)乙腈在流動(dòng)相中所占的最高比例可達(dá)50％，從而也能夠分離出更多的化合物。

分離流速的優(yōu)化

操作過程：

在不接色譜柱，不連補(bǔ)償泵，用二通閥連接儀器的情況下，設(shè)定某一初始流速，平衡液相，走空針。

分離梯度為：

0min，0％B；

5min，0％B；

6min，100％B；

18min，100％B。

記錄470nm下吸光度的變化△A。其余液相設(shè)置同實(shí)施例1。

初始流速分別設(shè)置為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9以及1.0mL/min，記錄不同流速下測得的吸光度變化值，每個(gè)比例重復(fù)三遍，繪制流速-吸光度響應(yīng)關(guān)系圖(如附圖7)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)流速-吸光度響應(yīng)關(guān)系圖，吸光度變化值△A隨著流速的增加而減少。由于實(shí)際操作中還會(huì)加入補(bǔ)償體系，補(bǔ)償流速和分離流速一致，因此分離流速應(yīng)該要比較小。但流速過低時(shí)不易于待測物的分離，因此最終選擇0.25mL/min為分離流速和補(bǔ)償流速。

實(shí)施例7

在線裝置的搭建

基于在線生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)現(xiàn)活性成分的原理，該篩選過程可視為3步：首先是待測物中化合物的分離；緊接著這些化合物在第一個(gè)反應(yīng)線圈中依次與酶作用；最后含有化合物以及酶的混合液與底物接觸，在第二個(gè)反應(yīng)線圈中進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)，利用多波長檢測器檢測反應(yīng)產(chǎn)物的變化，從而找到活性成分。為了盡可能的避免高濃度的有機(jī)溶劑對酶活性的影響，需要在催化反應(yīng)發(fā)生前加入一個(gè)補(bǔ)償體系。

作為一種使化合物分離與生物活性檢測一體化的篩選方法，相比常規(guī)分離液相，在線裝置對儀器設(shè)備的要求更高，設(shè)備搭建也更加復(fù)雜。總體上，整套在線裝置需要的儀器設(shè)備包括1個(gè)自動(dòng)進(jìn)樣器，1個(gè)柱溫箱，1個(gè)多波長DAD檢測器以及4個(gè)高效液相泵(二元泵或四元泵)。

具體搭建方式如下(見附圖8)：首先，一個(gè)高效液相泵與自動(dòng)進(jìn)樣器連接，再與柱溫箱連接，這3個(gè)模塊的串聯(lián)用于待測物的分離；緊接著通過一個(gè)三通閥串聯(lián)一個(gè)補(bǔ)償泵，用于洗脫液中有機(jī)相的調(diào)節(jié)；然后，洗脫液與補(bǔ)償液的混合液用一個(gè)三通閥與酶泵相連，與酶溶液匯合后流經(jīng)反應(yīng)線圈1，化合物在線圈1中與酶發(fā)生作用；接下來，混合了化合物的酶溶液再次利用一個(gè)三通閥與底物泵相連，所有液體在反應(yīng)線圈2中混合，充分進(jìn)行生化反應(yīng)。混合液經(jīng)由反應(yīng)線圈2最終流入DAD檢測器中，通過觀察反應(yīng)產(chǎn)物吸收波長(470nm)處有無倒峰的生成從而判斷化合物是否具有活性。