本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體涉及一種大觀霉素藥物的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特別適于牛奶中大觀霉素藥物殘留的檢測。技術(shù)背景大觀霉素為鏈霉菌所產(chǎn)生的一種氨基環(huán)醇類抗生素，是一新型特效專治淋病的抗生素。大觀霉素能阻止細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的合成并能阻礙已合成蛋白質(zhì)的釋放，被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。由于大觀霉素具有強(qiáng)大的抑菌殺菌作用和能促進(jìn)動物生長等作用，一些廠家在飼料中非法添加，同時養(yǎng)殖用戶又不遵守休藥期，導(dǎo)致牛奶中大觀霉素的殘留超標(biāo)的現(xiàn)象越來越多，對人民的健康造成了極其嚴(yán)重的影響。鑒于此種狀況,各國政府和國際組織都開始對獸藥殘留實(shí)施愈來愈嚴(yán)格的監(jiān)控措施。大觀霉素傳統(tǒng)的檢測方法有微生物檢定法，薄層色譜法，高效液相色譜法，氣相色譜法，超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)等，這些方法用于牛奶中的大觀霉素檢測，前處理繁瑣序復(fù)雜，測定周期長，甚至需要昂貴的儀器，成本較高，不能滿足牛奶樣品中大觀霉素的實(shí)時快速檢測。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種大觀霉素藥物的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其包括酶標(biāo)板、酶標(biāo)記抗抗體、大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色液、終止液、洗滌液、大觀霉素抗體，所述酶標(biāo)板上包被有大觀霉素半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物。所述大觀霉素半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物由大觀霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到。所述大觀霉素半抗原由大觀霉素與羧甲基羥胺反應(yīng)得到。所述大觀霉素抗體為大觀霉素單克隆抗體或大觀霉素多克隆抗體。所述大觀霉素抗體由大觀霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白或血藍(lán)蛋白，所述大觀霉素半抗原為大觀霉素-羧甲基羥胺。所述大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為0μg/L，0.05μg/L，0.15μg/L，0.45μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L。所述酶標(biāo)記抗抗體的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶，所述顯色底物液為顯色底物A液和顯色底物B液，所述顯色底物A液為過氧化脲，顯色底物B液為四甲基聯(lián)苯胺，終止液為2mol/L鹽酸。所述洗滌液為含有1.0-1.5％吐溫20和0.5‰Proclin300防腐劑的Tris緩沖液，所述百分比、千分比均為體積比。本發(fā)明的另一個目的還提供了一種應(yīng)用上述大觀霉素藥物的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測牛奶樣品中大觀霉素殘留的方法，其主要包括：首先處理待測牛奶樣品；然后用上述大觀霉素藥物的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進(jìn)行檢測；最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明大觀霉素藥物的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測樣品中大觀霉素藥物的殘留量；對牛奶樣品的前處理要求不高，樣品前處理過程比較簡單，能同時快速檢測大批量牛奶樣品。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，本身結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、攜帶便利、檢測方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品定性、定量的檢測。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒可以在大觀霉素殘留檢測中發(fā)揮重要作用。附圖說明圖1：大觀霉素半抗原合成技術(shù)路線；圖2：大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品抑制曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1大觀霉素藥物的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒大觀霉素藥物的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其包括：1)96孔或48孔酶標(biāo)板，其上包被大觀霉素半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物；2)酶標(biāo)記抗抗體，為用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；3)大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L，0.05μg/L，0.15μg/L，0.45μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L；4)底物顯色液由底物顯色A液和底物顯色B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺；5)終止液為2mol/L鹽酸；6)洗滌液為含有1.0％～1.5％吐溫20(百分比為體積比)和0.5‰Proclin300的Tris緩沖液(千分比為體積比)；7)大觀霉素抗體，為大觀霉素單克隆抗體。實(shí)施例2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒主要成分的制備1、免疫原和包被原合成免疫原合成包括兩步，第一步將大觀霉素與羧甲基羥胺反應(yīng)合成大觀霉素半抗原，第二步將大觀霉素半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到免疫原。1)大觀霉素半抗原的合成，路線圖見圖1稱取100mg大觀霉素和140mg羧甲基羥胺溶于3mL吡啶中，室溫攪拌24小時，吹干，加水10mL，用0.2mol/LNaOH調(diào)至pH9左右，用CH2Cl2提取3次,每次20mL，棄CH2Cl2，水層用HCl調(diào)至pH3,再用CH2Cl2提取3次，每次20mL，用無水硫酸鈉脫水，過濾，將濾液在45℃下吹干，60℃烘干3小時，得白色晶體，即為大觀霉素半抗原。2)免疫原合成稱取50mg大觀霉素半抗原，加2mL二氧六環(huán)，30μL三正丁胺，30μL氯甲酸異丁酯，在10℃攪拌1h，將反應(yīng)液倒入牛血清白蛋白(160mg牛血清白蛋白溶于5mLH2O和5mL二氧六環(huán))，用NaOH調(diào)至pH8.5，再在10℃下攪拌6h。以流動的蒸餾水在4℃下透析24h，透析液經(jīng)冷凍干燥，得到免疫原。3)包被原合成用大觀霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到，方法同免疫原合成。2、單克隆抗體的制備1)動物免疫挑選8周齡的Balb/c小鼠，用含有氟氏完全佐劑的免疫原及大觀霉素半抗原-牛血清白蛋白偶聯(lián)物進(jìn)行皮下注射，免疫劑量為150μg/只，每2周加強(qiáng)免疫一次，第4次加強(qiáng)免疫后一周，得到效價為1:1000的抗體血清。2)骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞的制備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞采用常規(guī)的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細(xì)胞處于對數(shù)生長期，制成SP2/0骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞懸液；取經(jīng)免疫的小鼠脾臟，破碎，過400目的不銹鋼紗布過濾制成脾細(xì)胞懸液，計數(shù)后備用。3)細(xì)胞融合和單克隆化將1×108SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和5×108脾細(xì)胞在PEG作用下進(jìn)行融合，對于分泌抗體培養(yǎng)孔，采用間接競爭ELISA測定以篩選陽性孔。采用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行單克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。該抗體特異性是針對大觀霉素的，靈敏度能達(dá)到0.05μg/L。4)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將大觀霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成(1-2)×106個/mL的細(xì)胞懸液，每個凍存管1mL，采用逐漸降溫法保存在液氮中。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，然后移至冰上5min，再轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加入10mL溫?zé)岬耐耆囵B(yǎng)液中，移入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5)單克隆抗體的大量生產(chǎn)與純化取健康的Balb/c雌鼠，腹腔注入降植烷0.5mL/只，7天后腹腔注射大觀霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株3×105個/只，隔天觀察，10-20天后采集腹水。先用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水初步純化，后采用裝有Protein-A柱子的AKTApurifier100純化儀進(jìn)行純化，純化后抗體-20℃保存。3、羊抗鼠抗抗體制備：是以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。4、酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體的制備將羊抗鼠抗抗體與辣根過氧化物物酶(HRP)采用馬來酰亞胺基類活潑酯法進(jìn)行偶聯(lián)。1)采用4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)活化辣根過氧化物物酶，取100μL約10mg/mL的HRP溶液，按SMCC：ALP摩爾投料比(3～5):1加入SMCC，25℃反應(yīng)30min后，用G25脫鹽柱純化得到溶液Ⅰ。2)采用Traut’s試劑(2-亞氨基硫烷鹽酸鹽)活化羊抗鼠抗抗體抗抗體，與帶有氨基的物質(zhì)通過開環(huán)反應(yīng)引入末端巰基。取100μL約10mg/mL的羊抗鼠抗抗體溶液，按2-亞氨基硫烷鹽酸鹽：羊抗鼠抗抗體為(5～10):1加入2-亞氨基硫烷鹽酸鹽，25℃反應(yīng)30min后，用G25脫鹽柱純化得到溶液Ⅱ。3)將上述溶液Ⅰ和Ⅱ混合，將25℃反應(yīng)1h，加10μL1mol/L的2-巰基乙醇，25℃反應(yīng)30min后，用Superdex200在AKTApurifier100上進(jìn)行分離，洗脫緩沖液為磷酸鹽緩沖液，流速為1mL/min收集洗脫液。傳統(tǒng)的過碘酸鈉氧化法偶聯(lián)，辣根過氧化物酶在氧化的作用下會產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn)，降低了酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體，本發(fā)明方法為抗體與酶的定向偶聯(lián)，未降低辣根過氧化物酶的活性且多聚體較少，偶聯(lián)物的批間差較小，實(shí)時穩(wěn)定性較好，延長了產(chǎn)品的貨架期，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。該方法不僅可用于抗抗體與辣根過氧化物酶，還可用于其他一般性抗體的偶聯(lián)，制備酶標(biāo)抗體，用于直接ELISA。5、酶標(biāo)板的制備用0.05mol/L，pH8.0磷酸鹽包被液或0.05mol/LpH9.6碳酸鹽包被液將大觀霉素半抗原-卵清蛋白稀釋成0.05～0.15μg/ml，每孔加入100μL，37℃溫育2h或4℃過夜，用洗滌液洗滌2次，拍干，然后再每孔中加入200μL的3％脫脂奶粉進(jìn)行封閉，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。實(shí)施例3牛奶樣品中大觀霉素的檢測1、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測原理：向酶標(biāo)板微孔內(nèi)加入樣品溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記抗抗體，大觀霉素抗體工作液，樣品中殘留的大觀霉素藥物與酶標(biāo)板上包被的大觀霉素半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物競爭大觀霉素抗體，酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用，用底物顯色液顯色，樣品吸光值與大觀霉素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣品中大觀霉素的殘留量。根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中大觀霉素殘留量的濃度范圍。2、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測步驟：1)取出需要數(shù)量的包被有大觀霉素半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板，每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行。2)加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50μL到對應(yīng)的微孔中，然后加入酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體50μL/孔，再加入大觀霉素單克隆抗體工作液50μL/孔，振蕩混勻，蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)20min。3)揭開蓋板膜，甩干孔內(nèi)液體，加入洗滌液250μL/孔，洗滌4-5次，倒掉洗滌液，用吸水紙拍干。洗滌液為含有1.0％～1.5％吐溫20(百分比為體積比)和0.5‰Proclin300的Tris緩沖液(千分比為體積比)。4)加入底物顯色A液過氧化脲50μL/孔，再加入底物顯色B液四甲基聯(lián)苯胺50μL/孔，混勻，蓋板后置于25℃避光環(huán)境中反應(yīng)10min。5)加入終止液2mol/L鹽酸50μL/孔，混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處，測定OD值。3、檢測結(jié)果分析用所獲得的每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出大觀霉素的殘留量。實(shí)驗(yàn)例1標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線由6個濃度組成(0μg/L，0.05μg/L，0.15μg/L，0.45μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L)，對6個標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)各測定次數(shù)5次，以確定工作濃度范圍和IC50。以標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)取對數(shù)，抑制率(B/B0)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，IC50為0.2955μg/L，見圖2，回歸方程為：Y＝B/B0＝-0.3621log(X)+0.3083；推出濃度值X的方程為：濃度值X＝10^(-(B/B0-0.3083)÷0.3621)。實(shí)驗(yàn)例2樣品精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)1、樣品精密度試驗(yàn):精密度以變異系數(shù)表示。以0.45μg/L濃度的大觀霉素對牛奶樣品進(jìn)行添加測定,分別取三個不同批次的試劑盒，每個濃度重復(fù)3次，分別計算變異系數(shù)，結(jié)果見表1。表1牛奶樣品變異系數(shù)測定結(jié)果表明，牛奶中樣品的變異系數(shù)為3.77-7.03％。2.樣品準(zhǔn)確度試驗(yàn)準(zhǔn)確度以回收率表示。取濃度為0.1μg/L的大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別對5個牛奶樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個濃度做3個平行，分別計算回收率，計算結(jié)果見表2。表2添加回收率測定結(jié)果顯示牛奶樣品添加回收率在86.0％-112％之間，表明本發(fā)明酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定牛奶的準(zhǔn)確率較高。實(shí)驗(yàn)例3交叉反應(yīng)率試驗(yàn)選擇與大觀霉素有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的4種藥物測定交叉反應(yīng)率，通過各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50％抑制濃度(即IC50)。用下式計算本發(fā)明試劑盒對其它藥物的交叉反應(yīng)率。類似物交叉反應(yīng)率越小，那么此試劑盒對大觀霉素的檢測的特異性就越好。交叉反應(yīng)率(％)＝(大觀霉素IC50/大觀霉素類似物IC50)×100％，結(jié)果見表3。表3交叉反應(yīng)率測定藥物名稱交叉反應(yīng)率(％)大觀霉素100％新霉素＜0.1％紅霉素＜0.5％鏈霉素＜0.1％卡那霉素＜1％實(shí)驗(yàn)例4試劑盒保存性試驗(yàn)試劑盒保存條件為2～8℃，經(jīng)過12個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度、大觀霉素添加實(shí)際測定值均在正常范圍之內(nèi)。實(shí)施例4大觀霉素藥物的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒與實(shí)施例1的區(qū)別在于抗體工作液位大觀霉素多克隆抗體工作液，酶標(biāo)記抗抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗抗體。當(dāng)前第1頁1 2 3