本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及用于飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)微生物樣品檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)校正。
背景技術(shù)：
：基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorptionlionizationtimeofflightmassspectrometry,maldi-tof-ms)技術(shù)，是近年來(lái)飛速發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)技術(shù)之一，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)，為生命科學(xué)研究與臨床重大疾病預(yù)警和輔助診斷等提供快速、高通量的分析測(cè)試手段，同時(shí)也是一種很好的鑒定病原微生物的方法。maldi-tof-ms的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過(guò)程。tof的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比(m/z)與離子的飛行時(shí)間成正比，檢測(cè)離子。盡管maldi-tof-ms的準(zhǔn)確度高達(dá)0.1％～0.01％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的sds電泳與高效凝膠色譜技術(shù)。maldi-tofms技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、高通量、低成本等特點(diǎn)；maldi-tofms技術(shù)是臨床微生物的常規(guī)快速分析技術(shù)，也是耐藥微生物的分析技術(shù)之一；maldi-tofms技術(shù)為有病原菌資源庫(kù)的構(gòu)建提供了有效的鑒定技術(shù)支持。但由于系統(tǒng)誤差等因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確定量，因此在質(zhì)譜檢測(cè)樣品時(shí)，引入已知濃度和比例的內(nèi)標(biāo)，從而提高單個(gè)微生物樣品鑒定的準(zhǔn)確度和精密度。目前曲線擬合的方法在國(guó)內(nèi)外均有較為普遍的應(yīng)用，jiangyuewu等(anal.chem.1997,69,3767-3771)利用maldi-tof-ms的擬合曲線法對(duì)環(huán)孢菌素進(jìn)行了定量測(cè)試；mazarin等(anal.chem.2006,78,2758-2764)結(jié)合脈沖梯度旋轉(zhuǎn)核磁共振和maldi-tof-ms定量測(cè)定多聚物時(shí)，同樣采用了擬合曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)校正；2009年，呂爽等人利用擬合曲線，成功開(kāi)發(fā)了一種磷酸化肽的maldi-tof-ms定量方法。該技術(shù)是在完整的微生物中添加酸性基質(zhì)輔助細(xì)胞裂解，激光激發(fā)細(xì)胞裂解物(小蛋白或多肽)形成肽質(zhì)量指紋譜，與已構(gòu)建的屬、種水平的共性參考譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，從而實(shí)現(xiàn)微生物的鑒定。而各種特征肽或肽指紋的檢測(cè)結(jié)果通過(guò)一系列具有特定質(zhì)荷比(m/z)的峰值曲線進(jìn)行標(biāo)識(shí)。在利用maldi-tofms質(zhì)譜儀采集樣本的準(zhǔn)確性是蛋白指紋譜微生物識(shí)別體系的關(guān)鍵因素，如果在檢測(cè)過(guò)程中由于細(xì)胞裂解物的雜質(zhì)或系統(tǒng)誤差(繼續(xù)補(bǔ)充)的影響，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的峰值曲線出現(xiàn)一定程度的誤差(例如1-10個(gè)da分子量的峰值偏移)，因此一般需要通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行校正，以使得測(cè)定峰值曲線與實(shí)際峰值曲線吻合。袁湘林等(《分析化學(xué)研究報(bào)告》，2001年第29卷第1期)報(bào)道了在基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜用于人參皂甙rg3的定量分析中，選擇蘆丁作為內(nèi)標(biāo)物,在重現(xiàn)性和線性方面都優(yōu)于棉子糖。分辨率的提高以及以相對(duì)峰面積代表待測(cè)物濃度，可使平均相對(duì)誤差明顯降低,改善定量結(jié)果。然而，該方法并非用于質(zhì)譜檢測(cè)微生物中，與maldi-tofms檢測(cè)微生物采用的線性模式不同的是，人參皂甙rg3的定量分析所采用的是反射模式，且待測(cè)樣品的檢測(cè)范圍小于1000da，同時(shí)其檢測(cè)區(qū)間僅限于400-900(m/z)，無(wú)法滿足微生物的檢測(cè)區(qū)間，因此受到了限制。中國(guó)專利申請(qǐng)2014100902157、發(fā)明名稱“用于早期糖尿病診斷的多肽標(biāo)準(zhǔn)物”公開(kāi)了一種用于質(zhì)譜檢測(cè)早期糖尿病的內(nèi)標(biāo)多肽，該多肽來(lái)源于人血清白蛋白，具有19個(gè)氨基酸序列。需要經(jīng)過(guò)周期較長(zhǎng)的孵育時(shí)間，同時(shí)該內(nèi)標(biāo)肽段用以參與結(jié)果判斷，通過(guò)計(jì)算目標(biāo)肽段與內(nèi)標(biāo)肽段的比值來(lái)判斷罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)可能性，而非判斷樣品本身的檢測(cè)結(jié)果是否檢測(cè)準(zhǔn)確。然而，該方法同樣并非用于maldi-tofms檢測(cè)微生物中，其檢測(cè)范圍均小于1000da，與微生物檢測(cè)范圍2000da-20000da相差較多，無(wú)法滿足微生物的檢測(cè)區(qū)間，因此受到了限制。作為最接近的現(xiàn)有技術(shù)，中國(guó)專利申請(qǐng)201510246677.8、發(fā)明名稱“微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品及其制備方法與應(yīng)用”公開(kāi)了一組利用質(zhì)荷比m/z分別為2094、2466、3149、4364等18條大腸桿菌特征蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物，以用于校正特征譜圖、穩(wěn)定校正效果。然而，該發(fā)明中涉及的標(biāo)準(zhǔn)物雖然可以有效檢測(cè)微生物，但其必須在質(zhì)譜檢測(cè)之前進(jìn)行平行檢測(cè)，以對(duì)質(zhì)譜儀進(jìn)行分子量校正且無(wú)法直接判斷單個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果的精確度，其仍然屬于外部標(biāo)準(zhǔn)物，在檢測(cè)過(guò)程中增加了步驟，不利于大量微生物樣本的高通量、快速、便捷的檢測(cè)。綜上所述，目前已報(bào)道的質(zhì)譜法檢測(cè)樣本均不能滿足鑒定微生物樣本時(shí)對(duì)單個(gè)樣本檢測(cè)的校正，其中maldi-tofms法只在用于定量測(cè)定中使用添加內(nèi)標(biāo)的方法，而對(duì)于maldi-tofms法鑒定微生物尚無(wú)報(bào)道。目前對(duì)于市場(chǎng)上使用maldi-tof-ms法檢測(cè)微生物的過(guò)程中，檢測(cè)范圍主要是2000-20000da(calderaro等)，盡管有報(bào)道(pignone等，shah等，kumar等，edwards-jones等)400-3000da的質(zhì)譜峰被用于鑒別分型等方面的研究，但該質(zhì)量范圍內(nèi)的特征峰不被用于市售maldi-tof-ms儀器的鑒定。而在2000-20000da檢測(cè)范圍中，微生物的主要特征峰小于12000da(winkler等)，因此在現(xiàn)有的激光質(zhì)譜檢測(cè)微生物的研究中，仍然使用外部標(biāo)準(zhǔn)物、甚至多種外部標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行校正，從而增加了檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)成本。因此，目前需要一種通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)微生物特征蛋白的新方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明原理在于：根據(jù)現(xiàn)有的maldi-tof-ms檢測(cè)微生物的質(zhì)荷比區(qū)間(3000-13000m/z)，首次提出使用小于3000m/z或大于12000m/z的單一內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物，該內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物具有已知的分子量和質(zhì)荷比，其在微生物檢測(cè)過(guò)程中并不干擾微生物特征蛋白的峰值譜圖。因此，在每個(gè)待檢微生物樣品中均添加了該內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物，使其與每個(gè)微生物樣品同時(shí)產(chǎn)生特定的質(zhì)譜圖，并通過(guò)該標(biāo)準(zhǔn)物的已知分子量及其對(duì)應(yīng)的特征峰，來(lái)校正每個(gè)微生物樣品的質(zhì)譜圖(例如，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物的待測(cè)分子量與實(shí)際分子量的差值，為待測(cè)微生物特征蛋白的分子量測(cè)量值進(jìn)行校正，如根據(jù)所述差值對(duì)實(shí)際測(cè)量值進(jìn)行校正)，從而提高單個(gè)微生物樣品鑒定的準(zhǔn)確度和精密度。由于本發(fā)明選擇的用于校正的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)選擇在1000-3000da或13000-20000da，其不但可以達(dá)到檢測(cè)效果，也在不影響微生物鑒定的基礎(chǔ)上，添加的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以校正單個(gè)樣品的整個(gè)譜圖，以彌補(bǔ)maldi-tofms在檢測(cè)中可能造成偏差的不足。因此，本發(fā)明第一個(gè)目的是提供一種通過(guò)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物來(lái)飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)微生物的方法，該方法包括：(1)對(duì)微生物樣品進(jìn)行前處理；(2)在前處理的微生物樣品中加入1000da<平均分子量<3000da或12000da<平均分子量<20000da的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物；(3)將含有內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物的微生物樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，使得微生物樣品和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物同時(shí)產(chǎn)生特定的質(zhì)譜圖，并通過(guò)該標(biāo)準(zhǔn)物的已知分子量及其對(duì)應(yīng)的特征峰，來(lái)校正每個(gè)微生物樣品的質(zhì)譜圖，從而得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果；其中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物可以是上述平均分子量?jī)?nèi)已知的多肽或/和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自1000da<平均分子量<2000da的已知的多肽或/和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或其組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自多肽p(33507-63-0)，分子量為1347.63da，其序列為seqidno:1：rpkpqqffglm-nh2；或，選自多肽p14r(syntheticpeptide)，分子量為1533.85da，其序列為seqidno:2：ppppppppppppppr。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自2000da<平均分子量<3000da的已知的多肽或/和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或其組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自多肽acthfragment18-39(human),分子量為2465.19da，其序列為seqidno:3：rpvkvypngaedesaeafplef。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自12000da<平均分子量<180000da的已知的多肽或/和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或其組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自馬肌紅蛋白apomyoglobin(equine),分子量為16952da，其序列為seqidno:4：glsdgewqqvlnvwgkveadiaghgqevlirlftghpetlekfdkfkhlkteaemkasedlkkhgtvvltalggilkkkghheaelkplaqshatkhkipikylefisdaiihvlhskhpgdfgadaqgamtkalelfrndiaakykelgfqg。還在其他實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自上述平均分子量范圍內(nèi)任意組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自多肽物質(zhì)p(33507-63-0)與馬肌紅蛋白apomyoglobin(equine)的組合。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自p14r(syntheticpeptide)與馬肌紅蛋白apomyoglobin(equine)的組合；在其他的具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自acthfragment18-39(human)與馬肌紅蛋白apomyoglobin(equine)的組合；以及，在另外的具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自選自多肽物質(zhì)p(33507-63-0)和acthfragment18-39(human)的組合。本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種用于上述方法中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自1000da<平均分子量<2000da的已知的多肽或/和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或其組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自多肽p(33507-63-0)，分子量為1347.63da，其序列為seqidno:1：rpkpqqffglm-nh2；或，選自多肽p14r(syntheticpeptide)，分子量為1533.85da，其序列為seqidno:2：ppppppppppppppr。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自2000da<平均分子量<3000da的已知的多肽或/和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或其組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自多肽acthfragment18-39(human),分子量為2465.19da，其序列為seqidno:3：rpvkvypngaedesaeafplef。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自12000da<平均分子量<180000da的已知的多肽或/和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或其組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自馬肌紅蛋白apomyoglobin(equine),分子量為16952da，其序列為seqidno:4：glsdgewqqvlnvwgkveadiaghgqevlirlftghpetlekfdkfkhlkteaemkasedlkkhgtvvltalggilkkkghheaelkplaqshatkhkipikylefisdaiihvlhskhpgdfgadaqgamtkalelfrndiaakykelgfqg。還在其他實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自上述平均分子量范圍內(nèi)任意組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自多肽物質(zhì)p(33507-63-0)與馬肌紅蛋白apomyoglobin(equine)的組合。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自p14r(syntheticpeptide)與馬肌紅蛋白apomyoglobin(equine)的組合；在其他的具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自acthfragment18-39(human)與馬肌紅蛋白apomyoglobin(equine)的組合；以及，在另外的具體實(shí)施方案中，所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物選自選自多肽物質(zhì)p(33507-63-0)和acthfragment18-39(human)的組合。本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種用于飛行時(shí)間質(zhì)譜微生物樣品前處理的試劑組合物，其主要成分包括：組分i：乙腈和甲酸；組分ii：乙腈，三氟乙酸和α-氰基-4-羥基肉桂酸；組分iii：上述任一部分所述的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中組分i包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量為水。組分ii包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羥基肉桂酸，余量為水。組分ⅲ包括：多肽物質(zhì)p(33507-63-0)(平均分子量為1347.3da)。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中組分i包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量為水。組分ii包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羥基肉桂酸，余量為水。組分ⅲ包括：p14r(syntheticpeptide)(平均分子量為1533.85da)。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中組分i包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量為水。組分ii包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羥基肉桂酸，余量為水。組分ⅲ包括：acthfragment18-39(human)(平均分子量為2465.19da)。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中組分i包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量為水。組分ii包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羥基肉桂酸，余量為水。組分ⅲ包括：馬肌紅蛋白apomyoglobin(equine)(平均分子量為16952da)。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中組分i包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量為水。組分ii包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羥基肉桂酸，余量為水。組分ⅲ包括：多肽物質(zhì)p(33507-63-0)(平均分子量為1347.3da)，馬肌紅蛋白apomyoglobin(equine)(平均分子量為16952da)。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中組分i包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量為水。組分ii包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羥基肉桂酸，余量為水。組分ⅲ包括：p14r(syntheticpeptide)(平均分子量為1533.85da)，馬肌紅蛋白apomyoglobin(equine)(平均分子量為16952da)。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中組分i包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量為水。組分ii包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羥基肉桂酸，余量為水。組分ⅲ包括：acthfragment18-39(human)(平均分子量為2465.19da)，馬肌紅蛋白apomyoglobin(equine)(平均分子量為16952da)。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中組分i包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量為水。組分ii包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羥基肉桂酸，余量為水。組分ⅲ包括：多肽物質(zhì)p(33507-63-0)(平均分子量為1347.3da)，acthfragment18-39(human)(平均分子量為2465.19da)。本發(fā)明第四個(gè)目的是提供通過(guò)上述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物或試劑組合物所制備的用于質(zhì)譜鑒定未知微生物的檢測(cè)產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，該產(chǎn)品為飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)微生物的試劑盒，包括：(1)微生物樣品前處理的試劑組合物；(2)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物組合物；在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒還包括：(3)其他質(zhì)譜試劑，包括陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品。在另一實(shí)施方案中，該試劑盒還包括點(diǎn)樣及質(zhì)譜檢測(cè)用靶片，以及用于比較和校正標(biāo)準(zhǔn)物和待測(cè)物分子量的軟件。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供通過(guò)通過(guò)上述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物或試劑組合物或檢測(cè)產(chǎn)品用于飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定微生物樣品的內(nèi)標(biāo)校正方法，步驟包括：(1)用滅菌牙簽(或者1μl接種環(huán))挑取部分合適的單菌落于裝有10μl組分i的離心管中，進(jìn)行細(xì)胞破碎，蛋白及多肽釋放，裂解5分鐘。(2)取上述溶液1μl加到靶板的孔位上，室溫干燥。(3)取內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物1μl覆蓋到同一孔位上，自然干燥；(4)打開(kāi)組分ii的微管，移取1μl組分ii加到同一孔位上，自然干燥。(5)靶板放入飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)，其中通過(guò)比較內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物的待測(cè)分子量與實(shí)際分子量的差值，為待測(cè)微生物特征蛋白的分子量進(jìn)行校正。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物檢測(cè)是確定微生物的屬、種、亞種或亞型。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述微生物檢測(cè)是非診斷目的地檢測(cè)致病菌、污染菌、耐藥菌等，或具有診斷目的的致病菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述任一方案中的微生物是環(huán)境污染中的微生物、食品檢疫中的微生物、進(jìn)出口商品中的微生物、藥物研究中耐藥性微生物等。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述任一方案中的微生物是原核微生物、真核微生物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述原核微生物包括細(xì)菌。所述真核微生物為真菌包括酵母菌、霉菌等。原理和定義飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定微生物的原理是：不同的微生物，其含有的蛋白質(zhì)有差異，微生物樣品經(jīng)處理后，利用飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)，不同的微生物具有其不同的特征指紋圖譜，經(jīng)過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)分析軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知微生物的特征譜圖進(jìn)行比對(duì)，便可區(qū)分不同種微生物，即給出微生物的鑒定結(jié)果。由于微生物的特征指紋譜圖是飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定微生物唯一判斷依據(jù)，因而譜圖的準(zhǔn)確是微生物鑒定正確的前提。在每個(gè)單個(gè)待測(cè)樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過(guò)分析軟件對(duì)單個(gè)樣品校正后，再進(jìn)行微生物鑒定，從而提高單個(gè)樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確率。應(yīng)當(dāng)指出的是，雖然本發(fā)明可以用于檢測(cè)微生物，但本發(fā)明僅僅是對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行校正，以使檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果保持一致。由于通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)微生物，需要預(yù)先制備待測(cè)微生物的特征蛋白圖譜，僅僅依靠本發(fā)明的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物并不能完成所述檢測(cè)，因此本發(fā)明所涉及的檢測(cè)方法并不屬于疾病的診斷或檢測(cè)。技術(shù)效果(1)本發(fā)明通過(guò)研究在微生物樣本中添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的添加可對(duì)單個(gè)微生物樣本進(jìn)行校正，并與飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑聯(lián)合使用，可提高微生物鑒定的準(zhǔn)確率，同時(shí)彌補(bǔ)了目前市場(chǎng)上只有外部標(biāo)準(zhǔn)品做校正的不足；(2)本發(fā)明所添加的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分子量范圍在微生物鑒定范圍以外，并且在檢測(cè)范圍以內(nèi)，均可達(dá)到檢測(cè)及校正的要求；(3)本發(fā)明中利用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校正單個(gè)微生物樣品檢測(cè)的方法，可適用于包括真菌，細(xì)菌等各類用于maldi-tofms檢測(cè)的微生物樣品中。附圖說(shuō)明圖1-1：克氏檸檬酸桿菌citrobacterkoseri圖1-2：大腸桿菌escherichiacoli圖1-3：糞腸球菌enterococcusfaecalis圖1-4：肺炎克雷伯氏菌klebsiellapneumoniae圖1-5：嗜麥芽窄食單胞菌stenotrophomonasmaltophilia圖1-6：銅綠假單胞菌pseudomonasaeruginosa圖1-7：沙門氏菌salmonellasp.圖1-8：產(chǎn)酸克雷伯菌klebsiellaoxytoca圖1-9：人葡萄球菌staphylococcushominis圖1-10：鮑氏不動(dòng)桿菌acinetobacterbaumannii圖1-11：陰溝腸桿菌enterobactercloacae圖1-12：粘質(zhì)沙雷氏菌serratiamarcescens圖2-1：利用三氟乙酸/乙腈有機(jī)溶劑溶解多肽質(zhì)譜圖圖2-2：利用超純水溶解多肽質(zhì)譜圖圖2-3：利用超純水溶解內(nèi)標(biāo)組合物圖2-4：利用三氟乙酸/乙腈溶解內(nèi)標(biāo)組合物圖3-1：添加內(nèi)標(biāo)利用抹板法處理微生物樣本大腸桿菌(atcc8739)圖3-2：添加內(nèi)標(biāo)利用一步萃取法處理微生物樣本大腸桿菌(atcc8739)圖3-3：添加內(nèi)標(biāo)利用三步離心法處理微生物樣本大腸桿菌(atcc8739)圖3-4：混合添加內(nèi)標(biāo)組合物(內(nèi)標(biāo)物拉開(kāi)圖)圖3-5：混合添加內(nèi)標(biāo)組合物圖圖4-1：添加內(nèi)標(biāo)利用抹板法處理微生物樣本大腸桿菌(atcc8739)出現(xiàn)偏差的峰圖圖4-2：添加內(nèi)標(biāo)利用抹板法處理微生物樣本大腸桿菌(atcc8739)出現(xiàn)偏差重新對(duì)儀器校正后的峰圖圖5：m/z1351處有明顯特征峰圖圖6-1：溶血性葡萄球菌圖6-2：金黃色葡萄球菌圖6-3：人葡萄球菌圖6-4：銅綠假單胞菌圖6-5：普通變形桿菌圖6-6：產(chǎn)酸克雷伯菌圖6-7：鮑曼不動(dòng)桿菌圖6-8：無(wú)乳鏈球菌圖6-9：屎腸球菌圖7：表皮葡萄球菌圖8：嗜水氣單胞菌圖9：利用馬肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)超純水溶解鑒定大腸桿菌的蛋白指紋圖譜具體實(shí)施方式為了進(jìn)一步了解本發(fā)明的技術(shù)特征，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的闡述。實(shí)施例只對(duì)本發(fā)明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上作出任何非實(shí)質(zhì)性的修改，都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例一利用飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本前處理試劑盒鑒定微生物菌株培養(yǎng)及前處理：將多株北京某醫(yī)院檢驗(yàn)科保存的臨床分離菌株37℃培養(yǎng)24小時(shí)，獲得對(duì)應(yīng)的單菌落，使用滅菌牙簽(或者1μl接種環(huán))挑取部分合適的單菌落涂抹于靶板對(duì)應(yīng)點(diǎn)位，吸取1μl組分i覆蓋于該點(diǎn)位上，自然干燥，吸取1μl組分ii覆蓋到同一孔位上，自然干燥后，上機(jī)檢測(cè)并鑒定分析，鑒定結(jié)果如表1和圖1-1至圖1-12。表1實(shí)施例一中5株菌的鑒定結(jié)果菌種編號(hào)菌種中文名稱菌種拉丁名稱1-1克氏檸檬酸桿菌citrobacterkoseri1-2大腸桿菌escherichiacoli1-3糞腸球菌enterococcusfaecalis1-4肺炎克雷伯氏菌klebsiellapneumoniae1-5嗜麥芽窄食單胞菌stenotrophomonasmaltophilia1-6銅綠假單胞菌pseudomonasaeruginosa1-7沙門氏菌salmonellasp.1-8產(chǎn)酸克雷伯菌klebsiellaoxytoca1-9人葡萄球菌staphylococcushominis1-10鮑氏不動(dòng)桿菌acinetobacterbaumannii1-11陰溝腸桿菌enterobactercloacae1-12粘質(zhì)沙雷氏菌serratiamarcescens由上述鑒定結(jié)果可知，微生物質(zhì)譜圖(見(jiàn)圖1-1至圖1-12)中主要特征峰分布于2000-13000da之間，因此，本發(fā)明中添加的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物分子量小于2000da或/且大于13000da時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生于微生物特征峰相似的質(zhì)譜峰，從而理論上保證了微生物鑒定的可行性及準(zhǔn)確性。實(shí)施例二飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定微生物的內(nèi)標(biāo)組合物制備(1)利用三氟乙酸/乙腈溶解標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)利用三氟乙酸/乙腈有機(jī)溶劑(0.1％三氟乙酸和10％乙腈)將多肽標(biāo)準(zhǔn)品干粉(即多肽p(33507-63-0)，分子量1347da)溶解成100fmol/ul濃度的溶液，仔細(xì)混勻后吸取1μl覆蓋到靶板點(diǎn)位上，自然干燥，后吸取1μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅱ(或其他用于微生物鑒定中的基質(zhì)液)覆蓋到同一點(diǎn)位上，自然干燥后，飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)儀器校正后，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果如圖2-1，其在m/z1348.76處有明顯的特征峰，說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用三氟乙酸/乙腈溶解，并具有良好的檢測(cè)效果。(2)利用超純水溶解標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)利用超純水將多肽標(biāo)準(zhǔn)品干粉(即多肽p(33507-63-0)，分子量1347da)溶解成500fmol/ul濃度的溶液，仔細(xì)混勻后吸取1μl覆蓋到靶板點(diǎn)位上，自然干燥后，吸取1μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅱ(或其他用于微生物鑒定中的基質(zhì)液)覆蓋到同一點(diǎn)位上，自然干燥后，飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2-2，其在m/z1348.88處有明顯的特征峰，說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用超純水溶解，并具有良好的檢測(cè)效果。(3)利用超純水溶解內(nèi)標(biāo)組合物用超純水配制終濃度為500fmol/μl的多肽物質(zhì)(即多肽p(33507-63-0)，分子量1347da)和終濃度為50fmol/μl的p14r(分子量1533)的混合溶液。仔細(xì)混勻后吸取1μl覆蓋到靶板點(diǎn)位上，自然干燥，后吸取1μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅱ(或其他用于微生物鑒定中的基質(zhì)液)覆蓋到同一點(diǎn)位上，自然干燥后，飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)儀器校正后，該內(nèi)標(biāo)組合物的檢測(cè)結(jié)果如圖2-3，其在m/z1348.64和m/z1534.65處有明顯的特征峰，說(shuō)明該內(nèi)標(biāo)組合物可用超純水溶解，并具有良好的檢測(cè)效果。(4)利用三氟乙酸/乙腈溶解內(nèi)標(biāo)組合物利用三氟乙酸/乙腈有機(jī)溶劑(0.1％三氟乙酸和10％乙腈)配制終濃度為500fmol/μl的多肽物質(zhì)(分子量1347da)和終濃度為50fmol/μl的p14r(分子量1533)的混合溶液。仔細(xì)混勻后吸取1μl覆蓋到靶板點(diǎn)位上，自然干燥，后吸取1μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅱ(或其他用于微生物鑒定中的基質(zhì)液)覆蓋到同一點(diǎn)位上，自然干燥后，飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)儀器校正后，該內(nèi)標(biāo)組合物的檢測(cè)結(jié)果如圖2-4，其在m/z1348.48和m/z1534.48處有明顯的特征峰，說(shuō)明該內(nèi)標(biāo)組合物可用三氟乙酸/乙腈有機(jī)溶劑溶解，并具有良好的檢測(cè)效果。如上圖所述，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物多肽p(33507-63-0)的理論分子量(1347.63da)和p14r的理論分子量(1533.85da)，與實(shí)際檢測(cè)的分子量均存在細(xì)微差值，并且同一內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物(如多肽p)的每次檢測(cè)值也存在一定差值，這說(shuō)明在激光質(zhì)譜檢測(cè)微生物特征蛋白的分子量過(guò)程中不可避免存在系統(tǒng)誤差。因此，在實(shí)際檢測(cè)微生物過(guò)程中，通過(guò)加入上述單一或聯(lián)合內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物來(lái)校正系統(tǒng)誤差，從而能夠更加準(zhǔn)確地檢測(cè)和區(qū)分不同微生物及其相近分子量的特征蛋白。實(shí)施例三飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定微生物的內(nèi)標(biāo)組合物添加方法優(yōu)化(1)直接添加內(nèi)標(biāo)組合物利用抹板法處理微生物樣本大腸桿菌(atcc8739)，并把內(nèi)標(biāo)組合物直接添加到樣本點(diǎn)位上，具體操作方法為：無(wú)菌牙簽挑取大腸桿菌單菌落，均勻涂抹在靶板點(diǎn)位上，自然干燥后，在同一點(diǎn)位上覆蓋1μl內(nèi)標(biāo)組合物(或在樣品點(diǎn)上覆蓋1μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅰ，自然干燥后覆蓋1μl內(nèi)標(biāo)組合物)，自然干燥，吸取1μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅱ(或其他用于微生物鑒定中的基質(zhì)液)覆蓋到同一點(diǎn)位上，自然干燥后進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)。經(jīng)儀器校正后，該樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖3-1，其在m/z1348處有明顯的特征峰，說(shuō)明利用抹板法處理微生物樣品時(shí)，內(nèi)標(biāo)組合物可直接添加進(jìn)樣品點(diǎn)中檢測(cè)。利用一步萃取法處理微生物樣本大腸桿菌(atcc8739)，并把內(nèi)標(biāo)組合物直接添加到樣本點(diǎn)位上，具體操作方法為：在200μl離心管中加入30μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分i，用1μl無(wú)菌接種環(huán)或槍頭挑取單菌落于上管中，震蕩混勻5min，加1μl樣品到靶板上，自然干燥，在同一點(diǎn)位上覆蓋1μl內(nèi)標(biāo)組合物，自然干燥，吸取1μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅱ(或其他用于微生物鑒定中的基質(zhì)液)覆蓋到同一點(diǎn)位上，自然干燥后進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)。經(jīng)儀器校正后，該樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖3-2，其在m/z1348處有明顯的特征峰，說(shuō)明利用一步萃取法處理微生物樣品時(shí)，內(nèi)標(biāo)組合物可直接添加進(jìn)樣品點(diǎn)中檢測(cè)。利用三步離心法處理微生物樣本大腸桿菌(atcc8739)，并把內(nèi)標(biāo)組合物直接添加到樣本點(diǎn)位上，具體操作方法為：在1.5ml或2ml離心管中加入300μl純水，接種環(huán)取大腸桿菌單菌落于上管中，震蕩均勻，加入900μl乙醇，震蕩，12000rpm離心2分鐘，棄去上清，離心2分鐘，自然干燥，加50μl70％甲酸，充分震蕩，加50μl乙腈，充分震蕩，12000rpm離心2分鐘，加1μl樣品到靶板上，自然干燥，在同一點(diǎn)位上覆蓋1μl內(nèi)標(biāo)組合物，自然干燥，吸取1μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅱ(或其他用于微生物鑒定中的基質(zhì)液)覆蓋到同一點(diǎn)位上，自然干燥后進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)。經(jīng)儀器校正后，該樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖3-3，其在m/z1348處有明顯的特征峰，說(shuō)明利用三步離心法處理微生物樣品時(shí)，內(nèi)標(biāo)組合物可直接添加進(jìn)樣品點(diǎn)中檢測(cè)。(2)混合添加內(nèi)標(biāo)組合物利用抹板法處理微生物樣本大腸桿菌(atcc8739)，并把內(nèi)標(biāo)組合物與基質(zhì)液按1:1比例混合添加到樣本點(diǎn)位上，具體操作方法為：無(wú)菌牙簽挑取大腸桿菌單菌落，均勻涂抹在靶板點(diǎn)位上，自然干燥后，在同一點(diǎn)位上覆蓋1μl內(nèi)標(biāo)組合物與市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅱ(或其他用于微生物鑒定中的基質(zhì)液)的混合物，自然干燥后進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)。經(jīng)儀器校正后，該樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖3-4和3-5，其在m/z1348和m/z1534處有明顯的特征峰，說(shuō)明利用抹板法處理微生物樣品時(shí)，內(nèi)標(biāo)組合物可與基質(zhì)液混合添加進(jìn)樣品點(diǎn)中檢測(cè)。實(shí)施例四飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定微生物的內(nèi)標(biāo)組合物校正效果評(píng)價(jià)利用內(nèi)標(biāo)組合物校正飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)微生物的質(zhì)譜圖，將大腸桿菌(atcc8739)接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，無(wú)菌牙簽挑取大腸桿菌單菌落，均勻涂抹在靶板點(diǎn)位上，自然干燥后，在同一點(diǎn)位上覆蓋1μl內(nèi)標(biāo)組合物(或在樣品點(diǎn)上覆蓋1μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅰ，自然干燥后覆蓋1μl內(nèi)標(biāo)組合物)，自然干燥，吸取1μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅱ(或其他用于微生物鑒定中的基質(zhì)液)覆蓋到同一點(diǎn)位上，自然干燥后進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)，該樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖4-1，其在m/z1348處無(wú)明顯特征峰，說(shuō)明該質(zhì)譜圖中質(zhì)譜峰出現(xiàn)偏差，該樣品的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果不可信，需重新進(jìn)行儀器校正并采集數(shù)據(jù)。上述大腸桿菌樣品經(jīng)內(nèi)標(biāo)組合物特征峰m/z1348值判斷，質(zhì)譜圖出現(xiàn)偏差，重新對(duì)儀器校正后，采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，檢測(cè)結(jié)果如圖4-2，該質(zhì)譜圖中m/z1348處有明顯特征峰，說(shuō)明該質(zhì)譜圖的質(zhì)譜峰未出現(xiàn)偏差，該樣品的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果可信。實(shí)施例五飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定微生物的內(nèi)標(biāo)組合物校正效果評(píng)價(jià)利用內(nèi)標(biāo)組合物校正飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)微生物的質(zhì)譜圖，將大腸桿菌(atcc8739)接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，無(wú)菌牙簽挑取大腸桿菌單菌落，均勻涂抹在靶板點(diǎn)位上，自然干燥后，在同一點(diǎn)位上覆蓋1μl內(nèi)標(biāo)組合物(或在樣品點(diǎn)上覆蓋1μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅰ，自然干燥后覆蓋1μl內(nèi)標(biāo)組合物)，自然干燥，吸取1μl市售飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑中組分ⅱ(或其他用于微生物鑒定中的基質(zhì)液)覆蓋到同一點(diǎn)位上，自然干燥后進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)，該樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖5，其在m/z1351處有明顯的特征峰，而在m/z1348處沒(méi)有明顯特征峰，說(shuō)明該質(zhì)譜圖中質(zhì)譜峰出現(xiàn)偏差，將該數(shù)據(jù)利用含有校正功能的鑒定軟件進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為escherichiacoli，且其對(duì)應(yīng)的可信度分值為94，說(shuō)明該內(nèi)標(biāo)具有良好的校正效果。實(shí)施例六利用飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑與本發(fā)明中的內(nèi)標(biāo)組合物檢測(cè)微生物樣本根據(jù)實(shí)施例五所述方法檢測(cè)對(duì)臨床常見(jiàn)致病菌(表2)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖6-1至6-9，經(jīng)軟件分析處理后鑒定結(jié)果為表3。表2臨床常見(jiàn)致病菌名單表3臨床常見(jiàn)致病菌鑒定結(jié)果菌種編號(hào)菌種拉丁名菌種中文名鑒定結(jié)果6-1staphylococcushaemolyticus溶血葡萄球菌936-2staphylococcusaureus金黃色葡萄球菌966-3staphylococcushominis人葡萄球菌966-4pseudomonasaeruginosa銅綠假單胞菌1276-5proteusvulgaris普通變形桿菌1306-6klebsiellaoxytoca產(chǎn)酸克雷伯菌936-7acinetobacterbaumannii鮑曼不動(dòng)桿菌1196-8streptococcusagalactiae無(wú)乳鏈球菌1206-9enterococcusfaecium屎腸球菌124實(shí)施例七利用飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑與本發(fā)明中的內(nèi)標(biāo)組合物檢測(cè)皮膚感染患者的致病菌將某醫(yī)院的手術(shù)部位感染患者傷口處化膿性分泌物標(biāo)本進(jìn)行接種培養(yǎng)，得到疑似致病菌的單菌落后，利用實(shí)施例五所述方法進(jìn)行微生物樣本處理并利用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)，得到的檢測(cè)結(jié)果如圖7，鑒定結(jié)果為表皮葡萄球菌該結(jié)果與全自動(dòng)生化鑒定儀鑒定結(jié)果一致。實(shí)施例八利用飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)微生物樣本處理試劑與本發(fā)明中的內(nèi)標(biāo)組合物檢測(cè)食品中的致病菌質(zhì)譜鑒定結(jié)果如圖8所示。實(shí)施例九利用馬肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)鑒定大腸桿菌方法：超純水溶解，質(zhì)譜鑒定結(jié)果如圖9所示。當(dāng)前第1頁(yè)12