發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)，具體涉及檢測(cè)gpcr之間相互作用及其交界面的方法。

背景技術(shù)：

g蛋白偶聯(lián)受體(gprotein-coupledreceptor，gpcr)具有七次跨膜結(jié)構(gòu)，其成員有800多個(gè)，其相關(guān)藥物占市場(chǎng)上藥物的40％-50％，因此是重要的藥物靶點(diǎn)之一。最初認(rèn)為gpcr是以單體形式存在并以單體的形式發(fā)揮作用。但在過去的二十年里越來越多的研究表明，gpcr能夠在完整細(xì)胞中形成二聚體甚至高階寡聚體。近期研究發(fā)現(xiàn)，視紫紅質(zhì)受體與β-arrestin結(jié)合的化學(xué)計(jì)量比由1∶1變?yōu)?∶1，這無(wú)疑證實(shí)了受體二聚體的存在。gpcr之間存在相互作用，其不同亞型及不同類型之間可以形成同源(相同受體)或異源(不同受體)二聚體，它們具有不同于單體的特異功能特征。gpcr的二聚化是調(diào)節(jié)受體功能的一種重要方式，受體-受體的相互作用可能形成較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)形式，并改變下游信號(hào)的g蛋白偶聯(lián)從而產(chǎn)生二聚體特異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并增加gpcr表型的多樣性[10]。近年來的研究表明，gpcr同源或異源二聚體具有生理相關(guān)性。gpcr不論緊密相關(guān)，還是關(guān)系較遠(yuǎn)的都能夠相互結(jié)合并且調(diào)節(jié)它們的活性，如μ阿片和cb1大麻素受體之間的相互作用影響神經(jīng)突觸形成(neuritogenesis)。大麻素/腺苷a2a受體二聚體影響大麻素在紋狀體中介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)效應(yīng)。另外，gpcr同源或異源二聚體具有疾病特異性，參與多種病理過程，使它們成為有吸引力的藥物靶點(diǎn)。at1r-b1r異源二聚化對(duì)于先兆子癇綜合癥(preeclampsia)的發(fā)生起關(guān)鍵作用，提高了血管緊張素ii的敏感性，增強(qiáng)了at1r的活性。為了進(jìn)一步證實(shí)at1-b2受體異源二聚化在高血壓中所起的作用，對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的腎小球系膜上檢測(cè)發(fā)現(xiàn)at1r-b1r異源二聚體含量增高。此外，apj-at1r異源二聚體能夠抑制血管緊張素介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化。apelin作用apj-at1r異二聚體，從而拮抗血管緊張素ii的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究表明，gpcr二聚體還與疼痛、哮喘、帕金森等有關(guān)。因此，對(duì)gpcr之間相互作用的研究將有助于探尋相關(guān)疾病治療的新突破點(diǎn)及新藥開發(fā)。

近年來，隨著x-射線晶體學(xué)發(fā)展，使得gpcr的高分辨率結(jié)構(gòu)解析工作取得很大的進(jìn)展，為解析更多的gpcr精確結(jié)構(gòu)和功能及相關(guān)藥物研發(fā)奠定重要基礎(chǔ)。研究證實(shí)gpcr的a類受體二聚體的交界面主要是跨膜區(qū)，gpcr結(jié)構(gòu)核心顯示出7個(gè)跨膜區(qū)(transmembrane，tm)。gpcr二聚體中，受體之間的相互作用涉及到二者跨膜區(qū)(交界面)構(gòu)象的變化，了解二聚體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)是識(shí)別它們的交界面(interface)。目前，關(guān)于二聚體的交界面主要分為兩大類，i型，二聚體的交界面主要為tm1，tm2和h8(helix8)；ii型，二聚體交界面主要為tm5以及部分tm4或tm6。。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供用于檢測(cè)gpcr之間相互作用及其交界面的方法，包括利用跨膜肽和maldi-tof質(zhì)譜法檢測(cè)gpcr的二聚化及其交界面。

本發(fā)明的一個(gè)方面提供用于檢測(cè)gpcr之間相互作用及交界面的方法，包括以下步驟：

(1)合成包含第一gpcr的一個(gè)或多個(gè)跨膜肽的融合蛋白，其中每個(gè)融合蛋白包含第一gpcr的一個(gè)跨膜肽和連接在所述跨膜肽的氨基酸或羧基端的膜結(jié)合肽，所述膜結(jié)合肽能與細(xì)胞膜上存在的分子連接從而促進(jìn)跨膜肽在細(xì)胞膜上整合，且每個(gè)融合蛋白中膜結(jié)合肽與跨膜肽連接的順序使得所述融合蛋白中包含的第一gpcr跨膜肽在細(xì)胞中能以與天然狀態(tài)相同的方式與膜結(jié)合；

(2)在細(xì)胞中表達(dá)全長(zhǎng)第二gpcr，并用步驟(1)中合成的每個(gè)融合蛋白分別孵育細(xì)胞，然后提取細(xì)胞中蛋白，并用全長(zhǎng)第二gpcr的抗體對(duì)所提取的蛋白分別進(jìn)行免疫沉淀；

(3)取免疫沉淀的蛋白混合物分別進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof)分析，根據(jù)分子量的大小判斷每個(gè)跨膜肽和全長(zhǎng)第一gpcr之間是否發(fā)生相互作用以及相互作用的交界面。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在步驟(3)中，如果基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof)分析檢測(cè)結(jié)果中存在分子量等于特定跨膜肽和全長(zhǎng)第一gpcr二者分子量之和的峰，則認(rèn)為免疫沉淀的蛋白混合物中具有該特定跨膜肽和全長(zhǎng)第一gpcr的二聚體，由此可以判斷第一gpcr和第二gpcr相互作用的交界面在該特定跨膜肽上。

在一些實(shí)施方案中，所述第一gpcr與所述第二gpcr可以是相同的gpcr或不同的gpcr。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合蛋白由第一gpcr的一個(gè)跨膜肽和連接在所述跨膜肽的氨基酸或羧基端的膜結(jié)合肽組成。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜結(jié)合肽是hivtat肽，其序列是ygrkkrrqrrr(seqidno：11)。

在一些實(shí)施方案中，步驟(1)中合成第一gpcr的部分跨膜肽。在另一些實(shí)施方案中，步驟(1)中合成第一gpcr的全部七個(gè)跨膜肽。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一gpcr和/或第二gpcr是apelin受體(putativereceptorproteinrelatedtoat1，血管緊張素受體ati相關(guān)受體蛋白，apj)。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一gpcr的一個(gè)或多個(gè)跨膜肽選自apj的跨膜肽apjtmd1、apjtmd2、apjtmd3、apjtmd4、apjtmd5、apjtmd6和apjtmd7。其中apjtmd1的序列是paiymlvfllgttgnglvlwtvf(seqidno：1)，apjtmd2的序列是fiaslavadltfvvtlplwatyt(seqidno：2)，apjtmd3的序列是ifvnmyasvfcltglsfdrylai(seqidno：3)，apjtmd4的序列是vsgavatavlwvlaallampvmv(seqidno：4)，apjtmd5的序列是vssttvgfvvpftimltcyffia(seqidno：5)，apjtmd6的序列是rllsiivvlvvtfalcwmpyhlv(seqidno：6)，和/或apjtmd7的序列是lmnifpyctcisyvnsclnpfly(seqidno：7)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，在包含apjtmd1、apjtmd3、apjtmd5或apjtmd7的融合蛋白中，膜結(jié)合肽連接在apjtmd1、apjtmd3、apjtmd5或apjtmd7的羧基末端；和/或，在包含apjtmd2、apjtmd4或apjtmd6的融合蛋白中，膜結(jié)合肽連接在apjtmd2、apjtmd4或apjtmd6的氨基末端。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一gpcr是食欲素1型受體(oxr1)，第二gpcr是5-羥色胺受體1a(5ht1ar)。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一gpcr的一個(gè)或多個(gè)跨膜肽選自oxr1的跨膜肽oxr1tmd1、oxr1tmd5、oxr1tmd7。其中oxr1tmd1的序列是wvliaayvavflialvgntlv(seqidno：8)，oxr1tmd5的序列是scfffvtylaplglmgmayfqif(seqidno：9)，和/或oxr1tmd7的序列是yacftfshwlvyansaanpiiynf(seqidno：10)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜結(jié)合肽連接在oxr1tmd1、oxr1tmd5或oxr1tmd7的羧基末端。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(2)中每個(gè)融合肽與細(xì)胞在37℃孵育60min。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(2)中的免疫沉淀是將所提取的蛋白離心后取上清，然后加入抗apj抗體和proteina/g-beads，4℃孵育過夜，然后離心除去上清并洗滌。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(3)中在進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof)分析之前，先將免疫沉淀的蛋白混合物進(jìn)行抗原洗脫后，離心取上清，將該上清作為maldi-tof分析的上樣樣品。其中優(yōu)選用0.1m甘氨酸-hcl進(jìn)行抗原洗脫。

附圖說明

圖1是lc-ms分析合成的tmd1肽的序列(water1010)。

圖2是lc-ms分析合成的tmd2肽的序列(shimadzu)。

圖3是lc-ms分析合成的tmd3肽的序列(water1010)。

圖4是lc-ms分析合成的tmd4肽的序列(shimadzu)。

圖5是lc-ms分析合成的tmd5肽的序列(water1010)。

圖6是lc-ms分析合成的tmd6肽的序列(water1010)。

圖7是lc-ms分析合成的tmd7肽的序列(water1010)。

圖8是利用質(zhì)譜法檢測(cè)apj跨膜肽tmd1與apj相互作用的結(jié)果。

圖9是利用質(zhì)譜法檢測(cè)apj跨膜肽tmd2對(duì)apj相互作用的結(jié)果。

圖10是利用質(zhì)譜法檢測(cè)apj跨膜肽tmd3對(duì)apj相互作用的結(jié)果。

圖11是利用質(zhì)譜法檢測(cè)apj跨膜肽tmd4對(duì)apj相互作用的結(jié)果。

圖12是利用質(zhì)譜法檢測(cè)apj跨膜肽tmd5對(duì)apj相互作用的結(jié)果。

圖13是利用質(zhì)譜法檢測(cè)apj跨膜肽tmd6對(duì)apj相互作用的結(jié)果。

圖14是利用質(zhì)譜法檢測(cè)apj跨膜肽tmd7對(duì)apj相互作用的結(jié)果。

圖15是用質(zhì)譜法檢測(cè)ox1r跨膜肽tm1與5-羥色胺受體1a(5ht1a)相互作用的結(jié)果。

圖16是用質(zhì)譜法檢測(cè)ox1r跨膜肽tm5與5-羥色胺受體1a(5ht1a)相互作用的結(jié)果。

圖17是用質(zhì)譜法檢測(cè)ox1r跨膜肽tm7與5-羥色胺受體1a(5ht1a)相互作用的結(jié)果。

具體實(shí)施方案

本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“gpcr”是指g蛋白偶聯(lián)受體(g-proteincoupledreceptor，gpcr)，是跨膜受體蛋白家族，它是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的重要蛋白質(zhì)。通常gpcr可被分為5類，但所有的gpcr都具有共同的結(jié)構(gòu)特征，它們都具有七個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度為20-30個(gè)氨基酸，并且所述7個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域通過多種長(zhǎng)度的氨基酸序列連接。受體具有細(xì)胞外n末端，而c末端則位于細(xì)胞質(zhì)中。

本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“交界面”是指蛋白質(zhì)或多肽間發(fā)生相互作用的位點(diǎn)或該位點(diǎn)所在的區(qū)域。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“膜結(jié)合肽”是指能與細(xì)胞膜上存在的分子連接的肽，例如hivtat(ygrkkrrqrrr)(seqidno：11)或極性標(biāo)簽sksksk(seqidno：12)，它能夠與4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(存在于膜的內(nèi)表面)連接。當(dāng)所述膜結(jié)合肽與跨膜肽相連時(shí)，可以促進(jìn)跨膜肽在細(xì)胞膜上整合。

合成肽的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如可以通過固相合成、溶液合成或重組技術(shù)來制備本發(fā)明的融合蛋白。固相合成技術(shù)通常是先將要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵同一個(gè)不溶性高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組分，脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)，接長(zhǎng)肽鏈，并重復(fù)進(jìn)行縮合、洗滌、去保護(hù)、中和和洗滌、下一輪縮合的操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長(zhǎng)度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要合成的多肽。其中α-氨基可以用boc(叔丁氧羰基)或fmoc(9-芴甲氧羰基)保護(hù)。重組技術(shù)通常是用包含編碼肽的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中表達(dá)并純化所需的肽。

在細(xì)胞中表達(dá)全長(zhǎng)gpcr的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如可以構(gòu)建含有全長(zhǎng)gpcr的表達(dá)質(zhì)粒，將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，從而在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)gpcr。所述質(zhì)?？梢允且詐cdna3.1為基礎(chǔ)構(gòu)建的，也可以使用病毒質(zhì)粒。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法包括但不限于電穿孔、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。

本文所述的“免疫沉淀”是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白。其中抗體與樣品中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白a/g(proteina/g)或二抗偶聯(lián)的agarose或sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子-蛋白a/g或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物，用洗脫液將沉淀中的抗原洗脫后，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白，可用于下一步分析。

基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof)分析的基本原理是將樣品分散在基質(zhì)分子中并形成晶體。當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場(chǎng)作用下加速飛過真空的飛行管，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，即通過離子的質(zhì)量電荷之比(m/z)與離子的飛行時(shí)間成正比來分析離子，并測(cè)得樣品分子的分子量?；|(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof)分析可以獲得精確的分子量測(cè)定結(jié)果?；|(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀可以商購(gòu)獲得。

以下實(shí)施例僅僅是用于舉例說明，并非是以任何方式限制本發(fā)明。

含全長(zhǎng)apelin受體(putativereceptorproteinrelatedtoat1，apj)的質(zhì)粒pcdna3.1-apj、pcdna3.1-5ht1ar和pcdna3.1-oxr1為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，它們均是以pcdna3.1為基礎(chǔ)構(gòu)建的。質(zhì)粒pcdna3.1-apj帶有全長(zhǎng)apj編碼基因和必要元件，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)全長(zhǎng)apj。質(zhì)粒pcdna3.1-5ht1ar帶有全長(zhǎng)5-羥色胺1a受體(5ht1ar)的編碼基因和必要元件，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞以表達(dá)全長(zhǎng)5ht1ar。質(zhì)粒pcdna3.1-oxr1帶有全長(zhǎng)食欲素i型受體(oxr1)的編碼基因和必要元件，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞以表達(dá)全長(zhǎng)oxr1。這些質(zhì)粒也可以通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)質(zhì)粒構(gòu)建方法構(gòu)建。多聚賴氨酸(poly-l-lysine)購(gòu)自sigma公司。兔抗apj抗體購(gòu)自abcam公司。

實(shí)施例1apelin受體(apj)同源二聚體和交界面的篩選

1.1固相合成apj的7個(gè)跨膜肽的融合蛋白

合成apj的7個(gè)跨膜肽tmd1、tmd2、tmd3、tmd4、tmd5、tmd6和tmd7和hivtat肽的融合蛋白，序列如表1所示。hivtat(ygrkkrrqrrr)能夠與4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(存在于膜的內(nèi)表面)連接，從而促進(jìn)tmd肽在細(xì)胞膜上的整合。在合成的tmd肽融合蛋白中，hivtat連接于奇數(shù)tmd的c端，偶數(shù)tmd的n端。

表1apj的7個(gè)跨膜肽融合蛋白的氨基酸序列

具體合成步驟如下：

(1)選取fmoc-arg(pbf)-wangresin樹脂。

(2)六氫吡啶去除樹脂上的fmoc然后用dmf洗6遍。

(3)用tbtu+diea為縮合劑加入第二個(gè)氨基酸fmoc-aa-oh反應(yīng)。

(4)反應(yīng)完全后，重復(fù)2，3步驟接下剩下氨基酸直至最后一個(gè)氨基酸ile。

(5)然后用六氫吡啶去除樹脂上的fmoc，用dmf，dcm交替洗3遍，最后用甲醇收縮樹脂抽干。

(6)用tfa裂解液切除側(cè)鏈保護(hù)基和樹脂2h后過濾，收集濾液加乙醚沉淀。

(7)加乙醚析出固體，抽干送質(zhì)譜和純化。

隨后lc-ms(shimadzu2020和water1010)分析合成后多肽的序列，結(jié)果顯示合成序列正確(圖1-圖7)。

1.2通過基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof/tofms)識(shí)別apj二聚體交界面

一、樣品前處理

用pcdna3.1-apj轉(zhuǎn)染cho細(xì)胞，48h以后，將轉(zhuǎn)染的cho細(xì)胞分為七組樣品：tmd1、2、3、4、5、6和7，分別用步驟1.1中合成的相應(yīng)的七個(gè)tmd肽融合蛋白(4μm)在37℃孵育60min，隨后進(jìn)行常規(guī)的總蛋白提取。tmd1、2、3、4、5、6和7樣品提取的蛋白樣品均用兔抗apj抗體進(jìn)行免疫沉淀。具體步驟如下：

a.將tmd1、2、3、4、5、6和7樣品提取的蛋白樣品進(jìn)行12000g離心，各取上清，為待免疫沉淀蛋白樣品；

b.分別將5μl兔抗apj抗體和50μlproteina/g-beads(santacruz)加入到每一個(gè)待免疫沉淀蛋白樣品中，4℃孵育過夜；

c.將每個(gè)免疫沉淀蛋白樣品進(jìn)行3000g離心去除上清，tbs溶液清洗3次；

d.用0.1mglycine-hcl洗脫抗原后，3000g離心，各取上清為待分析蛋白樣品。所得7組待分析蛋白樣品分別經(jīng)monotipc18(shimadzu)脫鹽后上樣進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof)。

二、分析條件

a.分析儀器：基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(aximamaldi-lnr-tof)

b.檢測(cè)模式：positive模式

c.質(zhì)譜掃描范圍：4k-10kda

d.基質(zhì)：10mg/ml芥子酸(sa)(50％乙腈，50％h2o，0.1％三氟乙酸)

樣品檢測(cè)結(jié)果用shimadzulaserbiolabmaldicalibrationkit進(jìn)行校正。

三、質(zhì)譜分析apj二聚體的交界面：tmd1、2、3和4

apj的分子量大小為42.66kda，七個(gè)跨膜肽的分子量如表1所示，通過maldi-tof質(zhì)譜法檢測(cè)，根據(jù)其分子量的大小判斷是否發(fā)生相互作用以及發(fā)生相互作用的區(qū)域。

結(jié)果顯示，tmd1樣品中檢測(cè)到tmd1、tmd1二聚體、apj、[apj+tmd1]、apj二聚體和[apj+tmd1]二聚體，如圖8所示，tmd2樣品中檢測(cè)到tmd2、tmd2二聚體、apj、[apj+tmd2]、apj二聚體和[apj+tmd2]二聚體，如圖9所示；tmd3樣品中檢測(cè)到tmd3、tmd3二聚體、apj、[apj+tmd3]、apj二聚體和[apj+tmd3]二聚體，如圖10所示；tmd4樣品中檢測(cè)到tmd4、tmd4二聚體、apj、[apj+tmd4]、apj二聚體和[apj+tmd4]二聚體，如圖11所示；tmd5樣品中檢測(cè)到tmd5、apj和apj二聚體，如圖12所示；tmd6樣品中檢測(cè)到tmd6、apj和apj二聚體，如圖13所示；tmd7樣品中檢測(cè)到tmd7、apj和apj二聚體被檢測(cè)到，如圖14所示，結(jié)果表明apj二聚體的交界面主要發(fā)生在tmd1、2、3和4，而不是tmd5、6和7。

實(shí)施例25-羥色胺受體1a(5ht1ar)和食欲素1型受體(oxr1)異源二聚體和交界面的篩選

2.1固相合成oxr1的3個(gè)跨膜肽的融合蛋白

合成oxr1的3個(gè)跨膜肽tmd1、tmd5和tmd7和hivtat肽的融合蛋白，序列如表2所示。hivtat連接于每個(gè)tmd肽的c端。

表2oxr1的3個(gè)跨膜肽融合蛋白的氨基酸序列

具體合成步驟與實(shí)施例1相同。

2.2通過基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof/tofms)識(shí)別5ht1ar和oxr1異源二聚體交界面

一、樣品前處理

用pcdna3.1-5ht1ar轉(zhuǎn)染cho細(xì)胞，48h以后，將轉(zhuǎn)染的cho細(xì)胞分為七組樣品：tmd1、5和7，分別用步驟2.1中合成的相應(yīng)的3個(gè)tmd肽融合蛋白(4μm)在37℃孵育60min，隨后進(jìn)行常規(guī)的總蛋白提取。tmd1、5和7樣品提取的蛋白樣品均用兔抗ht1ar抗體進(jìn)行免疫沉淀。具體步驟如下：

a.將tmd1、5和7樣品提取的蛋白樣品進(jìn)行12000g離心，各取上清，為待免疫沉淀蛋白樣品；

b.分別將5μl兔抗5ht1ar抗體和50μlproteina/g-beads(santacruz)加入到每一個(gè)待免疫沉淀蛋白樣品中，4℃孵育過夜；

c.將每個(gè)免疫沉淀蛋白樣品進(jìn)行3000g離心去除上清，tbs溶液清洗3次；

d.用0.1mglycine-hcl洗脫抗原后，3000g離心，各取上清為待分析蛋白樣品。所得7組待分析蛋白樣品分別經(jīng)monotipc18(shimadzu)脫鹽后上樣進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof)。

二、分析條件

a.分析儀器：基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(aximamaldi-lnr-tof)

b.檢測(cè)模式：positive模式

c.質(zhì)譜掃描范圍：4k-10kda

d.基質(zhì)：10mg/ml芥子酸(sa)(50％乙腈，50％h2o，0.1％三氟乙酸)

樣品檢測(cè)結(jié)果用shimadzulaserbiolabmaldicalibrationkit進(jìn)行校正。

三、質(zhì)譜分析5ht1ar和oxr1異源二聚體的交界面：tmd5和7。

結(jié)果顯示跨膜區(qū)5和7為異源二聚體形成的關(guān)鍵交界面。詳情見圖15-17。

5ht1ar蛋白理論分子量為46.176kda，oxr1的tm1多肽融合蛋白理論分子量為3788da，oxr1的tm5多肽融合蛋白理論分子量為4209da，oxr1的tm7多肽融合蛋白理論分子量為4355da(參見表2)。從圖15可觀察到tm1、5ht1a^1/2、5ht1a和5ht1a二聚體，從圖16和17中可觀察到tm5/tm7、tm5/tm7二聚體、tm5/tm7四聚體、tm5/tm7八聚體、5ht1a^1/2、5ht1a、5ht1a二聚體、[5ht1a+tm5/tm7]^1/2和[5ht1a+tm5/tm7]。根據(jù)結(jié)果初步可以認(rèn)為tm5和tm7區(qū)域，而非tm1區(qū)域，可能對(duì)ox1r蛋白和5ht1ar蛋白的結(jié)合起到關(guān)鍵作用。