本發(fā)明涉及一種檢測方法，具體是一種伊維菌素檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

20世紀(jì)90年代以后，絕大多數(shù)測定食品中伊維菌素類藥物殘留的理化檢測法主要依靠液相色譜技術(shù)進(jìn)行分離，其次是色／質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，氣相色譜法、高效薄層色譜法等檢測法，因其各自特有的性能，在抗生素殘留檢測方面稍有應(yīng)用。色譜法檢測牛乳中的藥物殘留要經(jīng)過樣品處理（包括樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟）、殘留藥物的分離和殘留藥物的檢測。理化檢測法利用抗生素分子中的基團(tuán)所具有的特殊反應(yīng)或性質(zhì)來測定其含量，能進(jìn)行定性、定量分析和藥物鑒定，可作為乳中抗生素檢測的確證方法。該法檢測敏感性較高，但儀器及檢測費(fèi)用高、檢測程序復(fù)雜、較耗時間等，這些不利因素使該法僅限于實驗室乳樣測定。免疫學(xué)分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法，目前藥物殘留免疫分析技術(shù)主要分三大類：相對獨立的分析方法、免疫分析技術(shù)與常規(guī)理化分析技術(shù)聯(lián)用的方法、免疫受體法。1973年荷蘭vanweeman、schμrrs及瑞典Engvall、Perlmann分別提出酶聯(lián)免疫吸附法，30多年來國內(nèi)外學(xué)者對免疫學(xué)方法檢測食品中抗生素進(jìn)行了大量研究。但由于抗生素是半抗原，抗原構(gòu)建技術(shù)難度大、免疫特異性強(qiáng)、檢測成本高，目前IDEXX實驗室公司、Cha瑚Sciences等公司在免分析法方面的研究較為成熟，國內(nèi)該技術(shù)仍處于研究發(fā)展中。當(dāng)前主要是用酶聯(lián)免疫吸附試驗、放射性免疫發(fā)光法、熒光免疫法、化學(xué)發(fā)光法等，對比現(xiàn)有的幾種標(biāo)記免疫技術(shù)靈敏度的可知酶免與發(fā)光相比較，其酶免靈敏度較低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種伊維菌素檢測方法及試劑盒，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種伊維菌素檢測試劑盒，所述的試劑盒包含有：(1)包被伊維菌素抗原的酶聯(lián)板或包被伊維菌素特異性抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標(biāo)記伊維菌素特異性抗體或酶標(biāo)記伊維菌素抗原；(3)伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(4)底物顯色液；(5)終止液；(6)濃縮洗滌液和(7)濃縮復(fù)溶液；所述包被伊維菌素抗原的酶聯(lián)板或包被伊維菌素特異性抗體的酶聯(lián)板的制備步驟為：(1)用包被緩沖液將伊維菌素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物或抗體以0.02-0.08μg/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗體稀釋液；(2)向酶聯(lián)板的每孔中加入100μl已經(jīng)稀釋好的抗原稀釋液或抗抗體稀釋液，37℃溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次15-30s，拍干；(3)向酶聯(lián)板的每孔中加入150-200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。

一種伊維菌素檢測方法如下：使用伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為：0.1ng/mL（0標(biāo)準(zhǔn)）、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL，向酶聯(lián)板中加入50μL/孔的伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液或樣品溶液，然后加入伊維菌素抗體工作液50μL/孔，室溫（25℃)恒溫孵育2.5h；2）洗滌：傾出孔中液體，向酶聯(lián)板中加入200μL/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復(fù)三次；3）加酶標(biāo)二抗：每孔加入酶標(biāo)二抗工作液100μL，室溫恒溫孵育1.5h;4）洗滌：傾出孔中液體，向酶聯(lián)板中加入280μL/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復(fù)三次；5）加發(fā)光液：每孔加入發(fā)光液l00μL；6）檢測：用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強(qiáng)度；7）結(jié)果判定：以所測得的伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液對應(yīng)的孔的發(fā)光值，除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的發(fā)光值再乘以100，得到抑制率B/B0%，以抑制率為縱坐標(biāo)，各伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品溶液所對應(yīng)的孔的發(fā)光值和所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到樣品溶液的濃度。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：緩沖液為pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸鹽緩沖液；所述的洗滌液為含有8%-15%吐溫-20℃的去離子水或超純水；所述的封閉液為含有8%-15%的脫脂奶和1%惰性蛋白的溶液；所述的載體蛋白為兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纖維蛋白或血藍(lán)蛋白。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明方法能克服傳統(tǒng)的檢測方法存在的檢測周期長、步驟繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力等缺點，使檢測時間大大縮短，操作步驟和勞動強(qiáng)度也大為縮減，達(dá)到省時省力、快速靈敏的要求。

具體實施方式

下面對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

本發(fā)明實施例中，一種伊維菌素檢測試劑盒，所述的試劑盒包含有：(1)包被伊維菌素抗原的酶聯(lián)板或包被伊維菌素特異性抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標(biāo)記伊維菌素特異性抗體或酶標(biāo)記伊維菌素抗原；(3)伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(4)底物顯色液；(5)終止液；(6)濃縮洗滌液和(7)濃縮復(fù)溶液；所述包被伊維菌素抗原的酶聯(lián)板或包被伊維菌素特異性抗體的酶聯(lián)板的制備步驟為：(1)用包被緩沖液將伊維菌素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物或抗體以0.02-0.08μg/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗體稀釋液；(2)向酶聯(lián)板的每孔中加入100μl已經(jīng)稀釋好的抗原稀釋液或抗抗體稀釋液，37℃溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次15-30s，拍干；(3)向酶聯(lián)板的每孔中加入150-200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。本發(fā)明伊維菌素檢測方法如下：使用伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為：0.1ng/mL（0標(biāo)準(zhǔn)）、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL，向酶聯(lián)板中加入50μL/孔的伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液或樣品溶液，然后加入伊維菌素抗體工作液50μL/孔，室溫（25℃)恒溫孵育2.5h；2）洗滌：傾出孔中液體，向酶聯(lián)板中加入200μL/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復(fù)三次；3）加酶標(biāo)二抗：每孔加入酶標(biāo)二抗工作液100μL，室溫恒溫孵育1.5h;4）洗滌：傾出孔中液體，向酶聯(lián)板中加入280μL/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復(fù)三次；5）加發(fā)光液：每孔加入發(fā)光液l00μL；6）檢測：用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強(qiáng)度；7）結(jié)果判定：以所測得的伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液對應(yīng)的孔的發(fā)光值，除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的發(fā)光值再乘以100，得到抑制率B/B0%，以抑制率為縱坐標(biāo)，各伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品溶液所對應(yīng)的孔的發(fā)光值和所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到樣品溶液的濃度。緩沖液為pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸鹽緩沖液；所述的洗滌液為含有8%-15%吐溫-20℃的去離子水或超純水；所述的封閉液為含有8%-15%的脫脂奶和1%惰性蛋白的溶液；所述的載體蛋白為兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纖維蛋白或血藍(lán)蛋白。

實施例1：

本發(fā)明伊維菌素檢測試劑盒，所述的試劑盒包含有：(1)包被伊維菌素抗原的酶聯(lián)板或包被伊維菌素特異性抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標(biāo)記伊維菌素特異性抗體或酶標(biāo)記伊維菌素抗原；(3)伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(4)底物顯色液；(5)終止液；(6)濃縮洗滌液和(7)濃縮復(fù)溶液；所述包被伊維菌素抗原的酶聯(lián)板或包被伊維菌素特異性抗體的酶聯(lián)板的制備步驟為：(1)用包被緩沖液將伊維菌素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物或抗體以0.02μg/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗體稀釋液；(2)向酶聯(lián)板的每孔中加入100μl已經(jīng)稀釋好的抗原稀釋液或抗抗體稀釋液，37℃溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次15s，拍干；(3)向酶聯(lián)板的每孔中加入200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。本發(fā)明伊維菌素檢測方法如下：使用伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為：0.1ng/mL（0標(biāo)準(zhǔn)）、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL，向酶聯(lián)板中加入50μL/孔的伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液或樣品溶液，然后加入伊維菌素抗體工作液50μL/孔，室溫（25℃)恒溫孵育2.5h；2）洗滌：傾出孔中液體，向酶聯(lián)板中加入200μL/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復(fù)三次；3）加酶標(biāo)二抗：每孔加入酶標(biāo)二抗工作液100μL，室溫恒溫孵育1.5h;4）洗滌：傾出孔中液體，向酶聯(lián)板中加入280μL/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復(fù)三次；5）加發(fā)光液：每孔加入發(fā)光液l00μL；6）檢測：用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強(qiáng)度；7）結(jié)果判定：以所測得的伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液對應(yīng)的孔的發(fā)光值，除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的發(fā)光值再乘以100，得到抑制率B/B0%，以抑制率為縱坐標(biāo)，各伊維菌素系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品溶液所對應(yīng)的孔的發(fā)光值和所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到樣品溶液的濃度。緩沖液為pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸鹽緩沖液；所述的洗滌液為含有8%-15%吐溫-20℃的去離子水或超純水；所述的封閉液為含有8%-15%的脫脂奶和1%惰性蛋白的溶液；所述的載體蛋白為兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纖維蛋白或血藍(lán)蛋白。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。