本發(fā)明涉及酚類化合物的定性研究領(lǐng)域，尤其涉及一種茶葉籽酚類化合物的定性方法。

背景技術(shù)：

茶樹(Camellia Sinensis O.Ktze)為山茶科山茶屬植物，起源于我國云貴高原。茶樹葉子、果實等植物材料富含茶多酚。酚類化合物是植物中一種重要的次生代謝產(chǎn)物，其分子結(jié)構(gòu)中含有若干個酚性羥基基團，一般分為酚酸類、黃酮類、單寧類、黃烷醇類和苷類等。兒茶素類是山茶屬植物的特征酚物質(zhì)，屬于黃烷醇類化合物，一般存在于該屬植物的花、莖、葉和果實中。研究表明，植物酚類化合物是一種天然抗氧化劑，能清除人體內(nèi)的NO和ROS自由基，抑制氧化酶活性和激活抗氧化酶體系。另有報道表明，酚類化合物能有效抑制細菌和真菌的生長，同時可以抑制癌細胞增殖，降低致癌誘變劑的活性。

目前，國內(nèi)外對茶葉籽酚類化合物組成的研究報道不多，主要集中于對酚類物質(zhì)提取工藝的優(yōu)化和總酚含量測定，其中應(yīng)用最為廣泛的分析技術(shù)為紫外分光光度法，而對酚類化合物組成的定性則采用UHPLC技術(shù)。顯然，目前的分析方法需依賴已知的標準品，具有一定的局限性；同時，液相色譜技術(shù)靈敏度不高，難以用于微量物質(zhì)的鑒定。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決茶葉籽酚類定性問題，本發(fā)明的目的在于提供一種無需標準品、分析靈敏度高、選擇性好的茶葉籽酚類定性方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種茶葉籽酚類化合物的定性方法，其特征在于，采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-Q-TOF-MS)鑒定。

一種茶葉籽酚類化合物的定性方法，其特征在于，采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定。

所述鑒定包括以下步驟：

樣品前處理：稱取茶葉籽粉置于錐形瓶中，加入提取液搖勻、震蕩提取、離心，收集上層澄清液，沉淀物重復(fù)提取，合并上清液旋蒸濃縮至干后得到提取物，提取物用有機溶液溶解得到溶解液，溶解液經(jīng)有機膜過濾，密封冷藏得到待分析液；

離子色譜圖的獲得：設(shè)置相應(yīng)的液相色譜條件和質(zhì)譜條件，通過超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法對前處理中獲得的待分析液進行檢測，得到總離子流色譜圖及提取特征離子色譜圖；

茶葉籽提取物化學(xué)成分的初步鑒定：分析檢測所獲得的總離子流色譜圖及提取特征離子色譜圖，計算該特征離子對應(yīng)的未知化合物的元素組成和精確分子量，依據(jù)元素組成和精確分子量對未知化合物進行初步鑒定；

誘導(dǎo)裂解：選擇離子豐度>10⁶cps的分子離子峰對未知化合物進行碰撞誘導(dǎo)裂解，通過裂解所得的二級質(zhì)譜得到未知化合物相應(yīng)的碎片離子；

茶葉籽提取物化學(xué)成分判斷：根據(jù)未知化合物的裂解情況和裂解所得的碎片離子推斷提取物中酚類化合物種類。

所述樣品前處理步驟中的提取液為乙醇水溶液，優(yōu)選，提取液選取醇類溶液提取效果好，但是甲醇等醇溶液具有一定毒性，選取環(huán)境友好的50％乙醇水溶液(v/v)作為提取液，乙醇溶液濃度低于50％時，萃取效果較差；濃度高于50％時，有機溶劑含量太高。

所述樣品前處理步驟中的溶解液為甲醇水溶液，優(yōu)選，50％甲醇水溶液(v/v)溶解效果及分離效果最佳，甲醇溶液濃度低于50％時，溶解效果差；濃度高于50％時，分離效果差。

所述樣品前處理步驟中的震蕩提取為60℃振蕩提取1h，溫度低于60℃，提取效果差，溫度高于60℃，有機化合物容易發(fā)生氧化反應(yīng)；振蕩時間高于1h，提取效果變化不明顯，且有機化合物容易發(fā)生氧化反應(yīng)；低于1h，提取效果差。

所述樣品前處理步驟中的離心為轉(zhuǎn)速4000rpm離心10min，旋蒸濃縮為在35℃下旋蒸濃縮至干；離心時間少于10min，離心效果差，高于10min，離心效果變化不明顯；濃縮溫度低于35℃，濃縮不徹底，溫度高于35℃，有機物容易發(fā)生反應(yīng)。

進一步的，所述樣品前處理為：準確稱取茶葉籽粉于錐形瓶中，加入20-30倍茶葉籽粉重量體積比(g/ml)的50％乙醇水溶液v/v搖勻，于60℃下振蕩提取1h后，在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，收集上層澄清液，繼續(xù)向剩余沉淀物中加入8-10倍茶葉籽粉重量體積比(g/ml)的50％乙醇水溶液v/v清洗，離心收集上清液，重復(fù)提取1-3次，合并上清液于35℃下旋蒸濃縮至干后，用50％甲醇水溶液v/v定容至0.25倍茶葉籽粉重量體積比(g/ml)得到溶解液，溶解液經(jīng)0.2μm有機濾膜過濾得到待分析液，密封冷藏待分析。

所述色譜圖的獲得步驟中的液相色譜條件為：

色譜柱為Agilent Eclipse Plus-C18，100mm×2.1mm，1.8μm；

流動相：A為0.1％甲酸水溶液v/v，B為0.1％甲酸乙腈溶液v/v；

梯度洗脫：0-5min：5％-10％B，5-7min：10％-20％B，7-9min：20％B，9-10min：20％-50％B，10-12min：50％B，12-13min：50％-5％B，13-15min：5％B；以上百分含量均為體積比；

流速0.4mL/min；柱溫30℃；進樣量2.0μL；平衡時間3min。

進一步的，所述離子色譜圖的獲得步驟中的質(zhì)譜條件為：

一級質(zhì)譜，采用鞘流電噴霧雙噴源，在負離子掃描方式下進行數(shù)據(jù)采集，參比離子m/z為112.9855和980.0163，干燥氣為高純N₂，毛細管電壓4000V，霧化氣壓力30psig，碎裂電壓140V，干燥氣溫度190℃，干燥氣流速9L/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速10L/min，離子掃描范圍m/z 100～1100；

二級質(zhì)譜，采用鞘流電噴霧雙噴源，在負離子掃描方式下進行數(shù)據(jù)采集，參比離子m/z為112.9855和980.0163，干燥氣為高純N₂，毛細管電壓4000V，霧化氣壓力30psig，碎裂電壓140V，干燥氣溫度190℃，干燥氣流速9L/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速10L/min，離子掃描范圍m/z 100～1100；碰撞能量設(shè)定為10～40eV。

所述茶葉籽提取物化學(xué)成分的初步鑒定為，首先提取總離子流色譜圖中主要色譜峰對應(yīng)的特征質(zhì)譜離子，通過Qualitative Analysis離線分析軟件提取該特征質(zhì)譜離子對應(yīng)的色譜圖，通過Q-TOF定性軟件計算該特征質(zhì)譜離子對應(yīng)的化合物的元素組成和精確分子量，通過查閱參考文獻匯總山茶屬植物酚類化合物的基礎(chǔ)信息，將未知化合物的元素組成與山茶屬植物酚類化合物的基礎(chǔ)信息進行比對，依據(jù)元素組成和精確分子量對未知化合物進行初步鑒定。

所述參考文獻為：

1.牛研,王書芳.LC-Q-TOF-MS和LC-IT-MSn分析當歸芍藥散中化學(xué)成分[J].中草藥，2014，45(8)：1056～1062

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5.Zou L L,Li X X,Shi Q S,et al.An effective integrated method for comprehensive identification of eighty-five compounds in Zhi-Zi-Da-Huang decoction by HPLC-DAD-ESI-MS(TOF)and HPLC-DAD-ESI-MS/MS(QqQ)without the help of reference standards[J].Analytical Methods,2014,6(12):4312～4327

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7.張小平,蔣可志，呂惠卿，等.HPLC-Q-TOF MS鑒定條葉榕根莖乙酸乙酯提取物中的主要化學(xué)成分[J].質(zhì)譜學(xué)報，2015，36(4)：310～320

包括但不限于上述參考文獻。

本發(fā)明有益效果：本發(fā)明通過乙醇水溶液對茶葉籽粉進行提取，采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對茶葉籽酚類化合物定性研究，本發(fā)明技術(shù)能夠在無標準品的情況下對粗提液中微量物質(zhì)進行初步組成和結(jié)構(gòu)分析，本發(fā)明與現(xiàn)有酚類化合物定性方法相比具有分析靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點，可以提高分析的特異性和準確度。

1、本發(fā)明色譜柱采用Agilent Eclipse Plus-C18，100mm×2.1mm，1.8μm，能較全面地反應(yīng)茶葉籽提取物的化學(xué)成分，分離效果最佳；

2、本發(fā)明流動相采用乙腈-0.1％甲酸水溶液能有效抑制拖尾，峰形佳，響值高；

3、本發(fā)明質(zhì)譜鑒別在負離子模式下全掃描檢測，大多數(shù)酚類化合物在負離子模式下響應(yīng)較好，峰容量更大。

4、本發(fā)明首次鑒定了茶葉籽中酚類化合物的組成，為全面快速分析茶葉籽成分及其深度研發(fā)應(yīng)用提供參考。

5、本發(fā)明通過分析各化合物的母離子以及碎片離子的精確質(zhì)量，結(jié)合軟件與文獻數(shù)據(jù)等推斷化合物的結(jié)構(gòu)。

附圖說明

圖1為茶葉籽提取液的UHPLC-QTOF/MS分離檢測得到的總離子流色譜圖；

圖2為茶葉籽提取液的UHPLC-QTOF/MS分離檢測得到的重疊提取特征離子色譜圖；

圖3A、圖3B、圖3C、圖3D為UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)鑒定茶葉籽乙醇提取物中酚酸化合物的結(jié)構(gòu)圖；

圖3E、圖3F為UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)鑒定茶葉籽乙醇提取物中兒茶素類化合物的結(jié)構(gòu)圖；

圖3G、圖3H為UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)鑒定茶葉籽乙醇提取物中黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)圖；

圖4為化合物2的提取色譜圖；

圖5為化合物2的二級質(zhì)譜圖；

圖6為化合物2推斷的裂解方式圖；

圖7為化合物4的提取色譜圖；

圖8為化合物4的二級質(zhì)譜圖；

圖9為化合物4推斷的裂解方式圖；

圖10為24種酚類化合物標品UHPLC-Q-TOF-MS精確質(zhì)量提取離子色譜圖；

圖11為表沒食子兒茶素及標準品匹配質(zhì)譜圖；

圖12為原兒茶酸及標準品匹配質(zhì)譜圖。

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1：一種茶葉籽酚類化合物的定性方法

材料與試劑：

茶葉籽，采自福建省泉州市安溪茶園。

乙腈、甲醇、甲酸(均為色譜純)：美國Sigma-Aldrich公司；正己烷(色譜純)：西隴化工股份有限公司；實驗用水為自制超純水；苯甲酸、4-羥基苯甲酸、原兒茶酸、一水合沒食子酸、鄰苯二甲酸、4-羥基苯乙酸、香草酸、肉桂酸、對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、綠原酸、表兒茶素、芹菜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素、楊梅素、柚皮素(均為分析級標準品)：阿拉丁試劑公司；兒茶素、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(均為分析級標準品)：美國Sigma公司；0.2μm有機濾膜：英國Whatman公司。儀器與設(shè)備：

Agilent 1290系列超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，配備在線脫氣系統(tǒng)、四元泵、自動進樣裝置、柱溫箱；Agilent 6540UHD高分辨飛行時間質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)，配有鞘流雙電噴霧離子源(dual JetStream ESI)，MassHunter Data Acquisition實時采集工作站和Qualitative Analysis離線分析軟件；BS2202S分析天平，德國Sartorious公司；QL-861漩渦混合器，海門其林貝爾儀器制造公司；離心機：湖南湘儀；R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(配備B491水浴鍋，V700真空泵)，瑞士BUCHI公司；DLSB系列冷凝水循環(huán)，鄭州長城科工貿(mào)公司。

樣品前處理：

準確稱取茶葉籽粉1.00g于100mL錐形瓶中，加入25mL50％乙醇水溶液(v/v)搖勻，于60℃下振蕩提取1h后，在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，收集上層澄清液。繼續(xù)向剩余沉淀物中加入10mL提取液清洗，離心收集上清液。重復(fù)提取三次，合并上清液于35℃下旋蒸濃縮至干后，用50％甲醇水溶液(v/v)定容至0.25mL，溶解液經(jīng)0.2μm有機濾膜過濾，密封冷藏待分析。

設(shè)置技術(shù)參數(shù)：

色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus-C18，100mm×2.1mm，1.8μm；流動相：A為0.1％甲酸水溶液，B為0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脫：0-5min：5v/v％-10v/v％B，5-7min：10v/v％-20v/v％B，7-9min：20v/v％B，9-10min：20v/v％-50v/v％B，10-12min：50v/v％B，12-13min：50v/v％-5v/v％B，13-15min：5v/v％B。流速0.4mL/min；柱溫30℃；進樣量2.0μL；平衡時間3min。

質(zhì)譜條件

采用鞘流電噴霧雙噴源，在負離子掃描方式下進行數(shù)據(jù)采集，參比離子m/z為112.9855和980.0163。具體質(zhì)譜參數(shù)：干燥氣為高純N₂，毛細管電壓4000V，霧化氣壓力30psig，碎裂電壓140V，干燥氣溫度190℃，干燥氣流速9L/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速10L/min，離子掃描范圍m/z 100～1100。二級質(zhì)譜參數(shù)中碰撞能量設(shè)定為10～40eV。每天采集運行前，必須使用調(diào)諧液(氟化膦嗪、三嗪、三甲銨乙內(nèi)酯和三氟醋酸混合物)進行質(zhì)量軸校準，確保質(zhì)量精度誤差在1×10^-6以下。

應(yīng)用UHPLC-Q-TOF/MS在上述色譜和質(zhì)譜條件下對茶葉籽提取物進行分析，在負離子模式下測定提取液，得到圖1該提取物的總離子流色譜圖及圖2提取特征離子流色譜圖。

其中圖1為茶葉籽提取液的UHPLC-QTOF/MS分離檢測得到的總離子流色譜圖，橫坐標為采集時間，縱坐標為離子豐度，圖2橫坐標為離子保留時間，縱坐標為離子豐度，由圖2可得特征離子在保留時間1-12min產(chǎn)生了24個波峰，每一波峰代表一種化合物。

茶葉籽提取物化學(xué)成分的初步鑒別：通過Qualitative Analysis離線分析軟件對圖1提取特征離子得到對應(yīng)的提取離子色譜圖(圖2)，通過Q-TOF定性軟件計算該特征離子對應(yīng)的化合物的元素組成，通過查閱參考文獻匯總山茶屬植物酚類化合物的基礎(chǔ)信息，將未知化合物的元素組成與匯總的化合物信息進行比對，依據(jù)精確分子量對未知化合物進行初步鑒定。

誘導(dǎo)解離：選擇合適的分子離子峰對未知化合物進行碰撞誘導(dǎo)解離，通過裂解所得的二級質(zhì)譜得到未知化合物相應(yīng)的碎片離子。

茶葉籽提取物化學(xué)成分判斷：根據(jù)離子的裂解情況推斷茶葉籽乙醇提取物中的24種酚類化合物，其中包括13種酚酸化合物、4種兒茶素類化合物和7種黃酮類化合物，結(jié)果見表1，表1中總結(jié)出了不同峰號對應(yīng)的保留時間、標準品保留時間、分子式、準分子離子峰及理論值、誤差、二級特征碎片、定性化合物，結(jié)構(gòu)示于圖3A-圖3H，由表1和圖3A-圖3H可知，其中圖3A、圖3B、圖3C、圖3D為酚酸化合物包含化合物1,2,3,5,6,7,9,10,13,14,15,17,21，圖3E、圖3F為兒茶素類化合物包含化合物4,8，11,12，圖3G、圖3H為黃酮類化合物包含化合物16,18,19,20,22,23,24。

表1茶葉籽酚類化合物UHPLC-Q-TOF/MS鑒定分析結(jié)果表

(1)酚酸類

酚酸類化合物極性強，保留時間較短，結(jié)合文獻及專業(yè)數(shù)據(jù)庫，在茶葉籽乙醇提取物中共鑒定出13種酚酸類物質(zhì),化合物1,2,3,5,6,7,9,10,13,14,15,17,21。以化合物2為例，其精確質(zhì)量提取離子色譜圖見圖4，由圖4可知化合物2的保留時間為2.562對應(yīng)的二級質(zhì)譜圖見圖5。如圖5所示，母離子[M-H]-的m/z為153.0197，對應(yīng)的最佳分子式為C₇H₆O₄，經(jīng)參考文獻比對，發(fā)現(xiàn)其與原兒茶酸分子離子峰一致，故初步推測其為原兒茶酸?？赡艿牧呀夥绞绞居趫D6所示，母離子[M-H]-丟失羧基上一個-CO₂基團，產(chǎn)生m/z 109.0295的碎片離子，進一步脫水得到m/z 91.0189的碎片離子。這個特征離子與實際采集得到的二級碎片離子圖一致，結(jié)合文獻報道，推斷該化合物為原兒茶酸。

(2)兒茶素類

兒茶素類化合物容易發(fā)生丟失C₂H₂O碎片、C環(huán)的1，4鍵斷裂和丟失B環(huán)的裂解方式。在茶葉籽乙醇提取物中共鑒定出4種兒茶素類物質(zhì),化合物4,8，11,12。以化合物4為例，化合物4的精確質(zhì)量提取色譜圖及二級質(zhì)譜圖如圖7和圖8所示，其[M-H]^-離子峰m/z為305.0653，對應(yīng)的最佳分子式為C₁₅H₁₄O₇，經(jīng)參考文獻比對，發(fā)現(xiàn)其與表沒食子兒茶素一致，故初步推測其為表沒食子兒茶素。可能的碎裂方式如圖9所示，C環(huán)的1-4鍵斷裂，可產(chǎn)生m/z 125.0244的碎片離子。而丟掉B環(huán)和部分A環(huán)，可分別生成m/z為179.0350和219.0663的碎片離子。除了碎片離子m/z 219.0663由于豐度偏低而實測值偏大，相對偏差為9.13ppm之外,母離子和其它兩個主要碎片離子的實測m/z值與理論值相對偏差均在3ppm以內(nèi)，而且子離子碎片信息與文獻報道一致。據(jù)此推斷，該化合物應(yīng)該為表沒食子兒茶素。

(3)黃酮類

黃酮類化合物母體骨架特殊，負離子模式下，不同的黃酮類化合物均有典型的裂解規(guī)律，如C環(huán)易發(fā)生逆Diels-Alder(RDA)裂解。依據(jù)這些典型裂解方式，共初步鑒定出7種黃酮類成分：柚皮素、楊梅素、槲皮素、山奈酚、木犀草素、二氫槲皮素、芹菜素。如化合物18的碎片離子峰m/z為317.0299，經(jīng)參考資料及數(shù)據(jù)庫比對與楊梅素分子離子峰一致，初步推測其為楊梅素。楊梅素C環(huán)RDA裂解產(chǎn)生m/z 151.0037的碎片離子，丟失B環(huán)產(chǎn)生m/z 178.9991的碎片離子。在化合物18的碎片離子中發(fā)現(xiàn)m/z 151.0030和m/z 178.9978的碎片離子，因此鑒定該化合物為楊梅素。

實施例2：驗證試驗

為驗證本發(fā)明提供的茶葉籽酚類化合物定性效果，進一步將已初步鑒定出的化合物與標準品進行保留時間和二級質(zhì)譜圖比對。在與實施例1相同色譜質(zhì)譜條件下，得到混合標準品的總離子流色譜圖，經(jīng)精確質(zhì)量數(shù)提取，得到精確質(zhì)量提取色譜圖(圖10)。由圖10可知茶葉籽中有24中酚類化合物，將鑒定的茶葉籽酚類化合物與標準品的保留時間進行比較，如表1所示，所有24個鑒定的化合物與對應(yīng)標準品的保留時間差異均在±0.1min以內(nèi)。同時，樣品中實際采集得到的二級碎片離子與標準品中分子離子峰裂解的碎片離子偏差均在1m/z以下。以表沒食子兒茶素(圖11)和原兒茶素(圖12)為例，由圖11可知茶葉籽中二級質(zhì)譜圖中的特征離子m/z 109.0296及m/z 153.0197與表沒食子兒茶素的標準品的特征離子基本一致，分別為m/z 109.0295及m/z 153.0202，相對質(zhì)量偏差在5ppm以內(nèi)。，由圖12可知茶葉籽中二級質(zhì)譜圖中的特征離子m/z 109.0290、125.0247、179.0350、305.0653與原兒茶素的標準品的特征離子基本一致，分別為m/z 109.0296、125.0242、179.0347、305.0663，相對質(zhì)量偏差在5ppm以內(nèi)。因此本發(fā)明可有效的判斷茶葉籽中酚類化合物的種類。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種茶葉籽酚類化合物的定性方法，應(yīng)用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-Q-TOF-MS)檢測茶葉籽酚類化合物具有無需標準品、分析靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。