本發(fā)明涉及離子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特指一種銅離子顯色試劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

銅離子是人體內(nèi)含量?jī)H次于鐵和鋅的第三種必需元素，它在骨骼的形成、細(xì)胞呼吸、造血功能、心血管疾病的預(yù)防、促進(jìn)結(jié)締組織形成等生理過(guò)程中起著重的作用，；同時(shí)也是集中金屬酶的催化因子。它在人體中的含量對(duì)人類健康十分重要，通常隨著人年齡的增長(zhǎng)，人體對(duì)銅離子的需求也就越大，從嬰兒時(shí)期的0.4～0.6mg到成人之后的1.5～3mg。若人體細(xì)胞中的銅離子平衡失調(diào)，可能會(huì)引起許多類似如老年癡呆癥、朊病毒病的神經(jīng)退行性疾病，另外利用重金屬離子可以使蛋白質(zhì)變性的原理，銅離子可以配制瓜果蔬菜等職務(wù)的殺菌劑—波爾多液，還可以作為木質(zhì)或皮質(zhì)材料的防腐劑。

目前常見的銅離子檢測(cè)方法主要包括離子色譜法、分子光譜法(分光光度法、紫外可見分光光度法、熒光光譜法)和原子吸收/發(fā)射光譜法、電化學(xué)方法等。上述方法在使用成本、操作復(fù)雜程度、檢測(cè)靈敏度及選擇性方面各有優(yōu)缺點(diǎn)。例如：國(guó)標(biāo)中常用的二乙胺基二硫代甲酸鈉分光光度法成本較低，但操作步驟繁瑣，檢測(cè)靈敏度相對(duì)有限；而高靈敏度的原子吸收/發(fā)射光譜法則需要借助價(jià)格和運(yùn)行成本較為昂貴的大型儀器，以及高素質(zhì)專業(yè)技術(shù)人員，從而限制了它們的使用范圍。

相對(duì)而言，基于銅離子顯色劑的紫外可見分光光度檢測(cè)法在儀器普及程度、使用成本具有綜合優(yōu)勢(shì)。該檢測(cè)方法的靈敏度和選擇性方面則取決于銅離子顯色試劑的性能。

因此，本發(fā)明人對(duì)此做進(jìn)一步研究，研發(fā)出一種銅離子顯色試劑及其制備方法和應(yīng)用，本案由此產(chǎn)生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種銅離子顯色試劑，其靈敏度高，在生物和環(huán)境等體系中檢測(cè)低濃度的Cu²⁺分析等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種銅離子顯色試劑的制備方法，以熒光素為母體，通過(guò)三步合成反應(yīng)來(lái)制備，工藝簡(jiǎn)單。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種銅離子顯色試劑的應(yīng)用，該顯色試劑可建立簡(jiǎn)便快捷、高靈敏度的紫外可見分光光度銅離子檢測(cè)法，

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：

一種銅離子顯色試劑，包含6-O-己基肼熒光素甲酯，其結(jié)構(gòu)式為：

一種銅離子顯色試劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟一：熒光素甲酯的合成，將熒光素溶于甲醇，濃硫酸為催化劑，反應(yīng)式如下：

步驟二：6-O-己基溴熒光素甲酯的合成，將步驟一得到的熒光素甲酯溶于無(wú)水乙腈中，加入BrCH₂(CH₂)₄CH₂Br和K₂CO₃，反應(yīng)式如下：

步驟三：6-O-己基肼熒光素甲酯的合成，將步驟二中得到的6-O-溴已酰熒光素甲酯溶于無(wú)水乙腈中，加入水合肼，反應(yīng)式如下：

優(yōu)選的，在步驟一中，取熒光素3.32g溶于10mL的甲醇中，然后滴入2.5mL的濃硫酸做催化劑，用磁力攪拌器加熱回流大約14小時(shí)，當(dāng)反應(yīng)停止后，再加入10g冰，之后用10gNaHCO₃粉末小心中和，過(guò)濾，再加入質(zhì)量百分濃度為1％的醋酸溶液溶解反應(yīng)中過(guò)量的NaHCO₃，過(guò)濾，水洗，干燥后得到熒光素甲酯2.946g。

優(yōu)選的，在步驟二中，取熒光素甲酯0.5g溶于10mL無(wú)水乙腈中，加入BrCH₂(CH₂)₄CH₂Br 2.03mL，其物質(zhì)的量濃度為13.2mmol/mL，以及K₂CO₃ 1.7g，放入90℃油浴加熱攪拌5小時(shí)，混合物經(jīng)飽和NaCl沉淀，過(guò)濾，干燥，得6-O-己基溴熒光素甲酯1.97g。

優(yōu)選的，在步驟三中，取6-O-溴已酰熒光素甲酯1.35g溶于30mL無(wú)水乙腈中，加入水合肼5.4mL，常溫?cái)嚢?小時(shí)，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，真空干燥，得到6-O-己基肼熒光素甲酯0.57g。

一種銅離子顯色試劑的應(yīng)用，該顯色試劑選擇性的對(duì)溶液體系中的Cu²⁺進(jìn)行高靈敏度快速響應(yīng)，建立銅離子溶液濃度紫外可見分光光度檢測(cè)法。

優(yōu)選的，檢測(cè)線性范圍為0.3μmol/L-5μmol/L、檢測(cè)限為0.03μmol/L。

優(yōu)選的，將顯色試劑溶于乙醇溶液，其中，6-O-己基肼熒光素甲酯物質(zhì)的量濃度為50μmol/L-100μmol/L。

采用上述方案后，由于本發(fā)明采用簡(jiǎn)單合成路線，方便易得的原料，以熒光素為母體，通過(guò)三步合成反應(yīng)制備了一種新型Cu²⁺顯色試劑，該顯色試劑可選擇性的對(duì)溶液體系中的Cu²⁺進(jìn)行高靈敏度快速響應(yīng)，基于該顯色試劑可建立簡(jiǎn)便快捷、高靈敏度的紫外可見分光光度銅離子檢測(cè)法，在生物和環(huán)境等體系中檢測(cè)低濃度的Cu²⁺分析等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。6-O-己基肼熒光素作為新型熒光素衍生物，它具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)越性和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的6-O-己基肼熒光素甲酯的吸收光譜圖，溶液1的吸收光譜曲線(a)，溶液2的吸收光譜曲線(b)，溶液3的吸收光譜曲線(c)；

圖2是本發(fā)明的不同pH值6-O-己基肼熒光素甲酯和Cu²⁺顯色反應(yīng)的吸收峰峰值；

圖3是本發(fā)明的顯色效果隨時(shí)間變化圖；

圖4是本發(fā)明不同金屬離子與6-O-己基肼熒光素甲酯顯色反應(yīng)的吸收光譜曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。

取熒光素3.32g溶于10mL的甲醇中，然后滴入2.5mL的濃硫酸做催化劑，用磁力攪拌器加熱回流大約14小時(shí)，當(dāng)反應(yīng)停止后，再加入10g冰，之后用10g NaHCO₃粉末小心中和，過(guò)濾，再加入質(zhì)量百分濃度為1％的醋酸溶液溶解反應(yīng)中過(guò)量的NaHCO₃，過(guò)濾，水洗，干燥后得到熒光素甲酯2.946g。

取熒光素甲酯0.5g溶于10mL無(wú)水乙腈中，加入BrCH₂(CH₂)₄CH₂Br 2.03mL，其中，BrCH₂(CH₂)₄CH₂Br物質(zhì)的量濃度為13.2mmol/mL，以及K₂CO₃ 1.7g，放入90℃油浴加熱攪拌5小時(shí)，混合物經(jīng)飽和NaCl沉淀，過(guò)濾，干燥，得6-O-己基溴熒光素甲酯1.97g。

取6-O-溴已酰熒光素甲酯1.35g溶于30mL無(wú)水乙腈中，加入水合肼5.4mL，常溫?cái)嚢?小時(shí)，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，真空干燥，得到6-O-己基肼熒光素甲酯0.57g。

以上述獲得6-O-己基肼熒光素甲酯來(lái)進(jìn)行以下測(cè)試。在測(cè)試之前，先將本發(fā)明的顯色試劑溶于乙醇溶液，其中，6-O-己基肼熒光素甲酯物質(zhì)的量濃度為50μmol/L-100μmol/L。

首先，測(cè)試6-O-己基肼熒光素甲酯和Cu²⁺的顯色反應(yīng)，取兩個(gè)500mL燒杯，燒杯1保持空白加入250mL蒸餾水，燒杯2中加入250mL的2μmol/LCuSO₄溶液。向兩個(gè)燒杯中分別滴加50μL的100μmol/L6-O-己基肼熒光素甲酯乙醇溶液。搖勻靜止片刻，燒杯1中溶液(溶液1)顏色基本不變，燒杯2溶液(溶液2)從無(wú)色變成了淺褐色。表明6-O-己基肼熒光素甲酯和Cu²⁺會(huì)發(fā)生明顯的顯色反應(yīng)。取燒杯2溶液100mL調(diào)為酸性(溶液3)待用。

如圖1所示，在紫外可見分光光度計(jì)上對(duì)上述中最終得到的三種溶液(溶液1、溶液2和溶液3)進(jìn)行吸收光譜掃描。圖1表明，三種溶液在516nm處都有吸收峰，而6-O-己基肼熒光素甲酯空白溶液(溶液1)的光譜曲線a在516nm處僅有微弱吸收峰；當(dāng)Cu²⁺存在時(shí)溶液2的光譜曲線b在516nm處產(chǎn)生了明顯吸收峰；當(dāng)溶液體系為酸性時(shí)的溶液3，其光譜曲線c在516nm處的吸收峰得到了顯著增強(qiáng)。

其次，溶液體系pH對(duì)6-O-己基肼熒光素甲酯和Cu²⁺的顯色反應(yīng)的吸收光譜曲線的影響，考察pH 1-12溶液體系中6-O-己基肼熒光素甲酯和Cu²⁺的顯色反應(yīng)效果，其中6-O-己基肼熒光素甲酯濃度均為100μmol/L，銅離子濃度均為5μmol/L。pH＝1和pH＝2溶液體系由硝酸調(diào)節(jié)，pH 3-7由醋酸-醋酸鈉緩沖調(diào)節(jié)，pH 8-12由硼酸-硼砂緩沖體系調(diào)節(jié)。在紫外—可見分光光度計(jì)分別掃描上述12種溶液的吸收光譜。各曲線的吸收峰峰值如圖2所示，從圖2可以看出，溶液體系的對(duì)6-O-己基肼熒光素甲酯和Cu²⁺顯色反應(yīng)的有明顯影響，較強(qiáng)的酸性或堿性環(huán)境均為不利影響，而弱酸性條件下pH 4-6時(shí)，體系的吸光度較大，當(dāng)pH＝4時(shí)，吸光度達(dá)到最大。因此后續(xù)檢測(cè)過(guò)程中均在pH＝4溶液體系條件下進(jìn)行。

再次，測(cè)試顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響，在室溫(25℃)下，考察顯色反應(yīng)吸光度隨時(shí)間變化，顯色反應(yīng)開始后，每隔5分鐘測(cè)試體系的吸收峰峰值，檢測(cè)時(shí)段為1小時(shí)，如圖3所示，從圖3可以看出，在25min時(shí)，溶液體系達(dá)到了最大吸光度，之后基本穩(wěn)定。因此，后續(xù)檢測(cè)過(guò)程均在顯色反應(yīng)開始后25min進(jìn)行。

最后，測(cè)試6-O-己基肼熒光素甲酯檢測(cè)Cu²⁺的選擇性，同等條件下考察常與銅離子共存的一些金屬離子與6-O-己基肼熒光素甲酯顯色反應(yīng)的吸收光譜曲線，可知，它們?cè)?16nm處不產(chǎn)生吸收峰，如圖4所示，這說(shuō)明當(dāng)這些金屬離子與銅離子共存時(shí)不會(huì)干擾銅離子的分析檢測(cè)。因此，本發(fā)明的試劑只與溶液中銅離子發(fā)生顯色反應(yīng)，吸收波長(zhǎng)在516nm左右，與其它常見的金屬離子不發(fā)生顯色反應(yīng)。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程所得檢測(cè)條件，改變Cu²⁺濃度，在516nm處測(cè)量吸光度，可知在銅離子濃度0.3μmol/L-5μmol/L范圍內(nèi)，吸光度與Cu²⁺濃度呈線性相關(guān)。線性關(guān)系為：y＝0.01668x+0.7768，R²＝0.9803，檢測(cè)限為0.03μmol/L。式中y為吸光度，x為銅離子濃度單位μmol/L。

因而，將本發(fā)明的顯示試劑運(yùn)用于紫外可見分光光度檢測(cè)法中，來(lái)檢測(cè)在生物和環(huán)境等體系樣品中的Cu²⁺，是一種方便快捷的銅離子檢測(cè)方法。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明的技術(shù)范圍作任何限制，故但凡依本發(fā)明的權(quán)利要求和說(shuō)明書所做的變化或修飾，皆應(yīng)屬于本發(fā)明專利涵蓋的范圍之內(nèi)。