本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

本品為類白色至淡黃色粉末。在水中不溶，在丙酮中微溶，在乙醇中幾乎不溶。為抗微生物藥。頭孢菌素類為半合成的第三代動物專用頭孢菌素。制成鈉鹽和鹽酸鹽供注射用。

本品肌內(nèi)和皮下注射后吸收迅速，血中和組織中藥物濃度高，有效血藥濃度維持時間長，消除緩慢，半衰期長。給牛，豬肌內(nèi)注射本品后，15MIN內(nèi)迅速被吸收在血漿內(nèi)生成一級代謝物脫呋喃甲酰頭孢噻呋（Desfuroyl ceftiofur,DFC）.由于內(nèi)酰胺環(huán)未受破壞，其抗菌活性與頭孢噻呋基本相同。DFC在組織內(nèi)可進一步形成無活性的DFC半胱胺酸二流化物。本品的表觀分布容積≤1L/KG。豬，綿羊，牛多劑量肌內(nèi)注射后在腎中濃度最高，其次為肺，肝，脂肪和肌肉，一般可維持高于MIC的濃度。例如豬按3mg/kg肌內(nèi)注射，一日1次，連用3天，其組織濃度分別為：血漿3.25，呼吸道0.60，皮膚0.57，肺0.49，扁桃體0.30，關(guān)節(jié)液0.29。牛按1mg/kg肌內(nèi)注射，一日1次，連用5天，其組織濃度分別為血漿1.0（注射后7.5H）關(guān)節(jié)液0.65（注射后2.5H），肺0.36，空腸0.34。在奶中主要以無活性的游離代謝物-DFC半胱胺酸二硫化物的形成出現(xiàn)。頭孢塞呋排泄較緩慢，動物的半衰期有明顯的種屬差異（馬，牛，綿羊，豬，犬，雞，火雞的T1/2）分別為3.15，7.12，2.83，14.5，4.12，6.77和7.45H。但大部分可在肌內(nèi)注射后24H內(nèi)由尿和糞中排出。DFC在牛，豬和雞的糞便中迅速降解為無活性化合物，所以需要一種頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒，具有多種數(shù)據(jù)綜合監(jiān)測特點，解決現(xiàn)有動物代謝物檢測頭孢噻呋的問題。

本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒，包括色譜儀、二極管陣列檢測器、色譜柱、漩渦混合器、電熱恒溫水浴鍋、離心機、分析天平、勻漿機、氮氣吹干儀和雙重水蒸餾器、頭孢噻呋標準品、乙腈、甲醇為色譜純、二硫赤蘚醇（純度99%）、碘乙酰胺（純度99%）、三氟乙酸和四硼酸鈉等，其特征在于：該頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒檢測步驟為：

S1、配制主要溶液，主要溶液包括標準儲備液、標準工作液、硼酸緩沖液、磷酸緩沖液、二硫赤蘚醇提取液、碘乙酰胺溶液和流動相；

S2、待檢測物和設(shè)備檢測前準備，包括：（1）全價不含抗菌藥物的飼料，全價飼料連續(xù)喂養(yǎng)十天的動物，之后收集動物代謝物備用，（2）色譜柱：AgilentZorbaxXDB－C18（4.6m×250mm×5μm，I.D），（3）檢測器：紫外檢測器，檢測波長266nm；（4）流動相為水：三氟乙酸∶乙腈=800∶1∶200 （體積比）；（5）柱溫：30℃；流速：1mL/min；進樣量：100μL；

S3、樣品的提取和凈化，提取衍生，將動物代謝物攪拌均勻，轉(zhuǎn)移到100mL干凈的小燒杯中，用玻璃棒將其攪拌均勻，稱取（5.0±0.1）g代謝物樣品，置50mL具塞離心管中，加入0.4%二硫赤蘚醇提取液10mL，渦旋1～2min混勻，50℃水浴30min，每隔3～5min渦旋振蕩1次，振蕩后立即放入水浴中， 30min后置于室溫，冷卻后加入4%碘乙酰胺溶液3mL，渦旋1～2min混勻，室溫避光衍生30min，每隔 10min，渦旋混勻1次，衍生完畢后加入0．025mol/L磷酸緩沖液5mL，調(diào)節(jié)pH值至2.5～3.0，于4℃10000r/min離心20min，取上清液置于另一離心管中，備用凈化，用3mL甲醇、3mL磷酸緩沖液預(yù)先將C18固相萃取柱活化，然后將上清液加入柱中，用10mL超純水淋洗，真空固相萃取裝置抽干，最后用5mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，45℃氮氣吹干， 用0．5mL流動相溶解，渦旋振蕩5min，超聲5min，0.22μm微孔濾膜過濾，取100μL進行HPLC檢測；

S4、回收率和精密度確定，稱代謝物5g，置于50mL聚丙烯離心管中，分別加入0.1、1.0、10.0μg/mL的標準工作液各1mL，經(jīng)上述方法提取和凈化后，HPLC檢測，求得雞蛋樣品中頭孢噻呋在0.02、0.20、2.00μg/g水平上的回收率，測定時，每個濃度處理在同一工作日內(nèi)測定5次（日內(nèi)）；在不同工作日測定5批次（日間），每批次5次重復(fù)，分別計算日內(nèi)和日間的色譜峰面積平均值及標準誤，求日內(nèi)和日間相對標準偏差（RS）；

S5、靈敏度測定稱取5份空白雞蛋勻漿各5g，置于50mL聚丙烯離心管中，分別加0.05、 0.10、0.25、0.50、1.00μg/mL的標準工作液各1mL，使每1g雞蛋勻漿含頭孢 噻呋0.01、0.02、0.05、0.10、0.20μg，按上述方法提取、凈化。

優(yōu)選的，步驟S1中的標準儲備液包括精密稱取10．0mg頭孢噻呋標準品， 置于100mL容量瓶內(nèi)，用磷酸緩沖液溶解并稀釋定容至刻度，即成濃度為100μg/mL的頭孢噻呋儲備液，臨用前用磷酸緩沖液配成系列標準濃度，標準工作液包括取1mL頭孢噻呋儲備液，依次用磷酸緩沖 液稀釋定容至10.00、 5.00、1.00、0.50、0.25、0.10、0.05μg/mL，硼酸緩沖液包括0.05mol/L硼酸緩沖液（pH值9），準確稱 取四硼酸鈉19.05g、氯化鉀3.70g，定容至1000mL，磷酸緩沖液包括0.025mol/L磷酸緩沖液（pH值7）：準確稱取3．4g磷酸二氫鉀，加水約700mL后用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至7.0，定容至1000mL，二硫赤蘚醇提取液包括0.4%二硫赤蘚醇提取液：稱取4.0g二硫赤蘚醇，溶于1000mL0.05mol/L硼酸緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），碘乙酰胺溶液包括4%碘乙酰胺溶液：稱取4.0g碘乙酰胺，溶于100mL0.025mol/L磷酸緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），流動相，分別量取800mL水，1mL三氟乙酸，200mL乙腈，然后混勻。

優(yōu)選的，步驟S2中待檢測物和設(shè)備檢測前準備，包括：（1）全價不含抗菌藥物的飼料，（2）色譜柱：AgilentZorbaxXDB－C18（4.6m×250mm×5μm，I.D），（3）檢測器：紫外檢測器，檢測波長266nm；（4）流動相為水：三氟乙酸∶乙腈=800∶1∶200（體積比）；（5）柱溫：30℃；流速：1mL/min；進樣量：100μL。

優(yōu)選的，步驟S3中樣品的提取和凈化，提取衍生，取上清液置于另一離心管中，之后備用凈化，用3mL甲醇、3mL磷酸緩沖液預(yù)先將C18固相萃取柱活化，然后將上清液加入柱中，用10mL超純水淋洗，真空固相萃取裝置抽干，最后用5mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，45℃氮氣吹干，用0.5mL流動相溶解，渦旋振蕩5min，超聲5min，0.22μm微孔濾膜過濾，取100μL進行HPLC檢測。

本發(fā)明的有益效果：建立了用高效液相色譜技術(shù)測定代謝物中頭孢噻呋殘留的方法，代謝物樣品經(jīng)二硫赤蘚醇提取，碘乙酰胺衍生，C18固相柱萃取凈化，甲醇溶液洗脫，結(jié)果表明，該方法操作簡便、快速、靈敏度高。

具體實施方式

基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明提供一種技術(shù)方案：一種頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒，包括色譜儀、二極管陣列檢測器、色譜柱、漩渦混合器、電熱恒溫水浴鍋、離心機、分析天平、勻漿機、氮氣吹干儀和雙重水蒸餾器、頭孢噻呋標準品、乙腈、甲醇為色譜純、二硫赤蘚醇（純度99%）、碘乙酰胺（純度99%）、三氟乙酸和四硼酸鈉等，其特征在于：該頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒檢測步驟為：

S1、配制主要溶液，主要溶液包括標準儲備液、標準工作液、硼酸緩沖液、磷酸緩沖液、二硫赤蘚醇提取液、碘乙酰胺溶液和流動相，包括標準儲備液包括精密稱取10．0mg頭孢噻呋標準品，置于100mL容量瓶內(nèi)，用磷酸緩沖液溶解并稀釋定容至刻度，即成濃度為100μg/mL的頭孢噻呋儲備液，臨用前用磷酸緩沖液配成系列標準濃度，標準工作液包括取1mL頭孢噻呋儲備液，依次用磷酸緩沖 液稀釋定容至10.00、 5.00、1.00、0.50、0.25、0.10、0.05μg/mL，硼酸緩沖液包括0.05mol/L硼酸緩沖液（pH值9），準確稱 取四硼酸鈉19.05g、氯化鉀3.70g，定容至1000mL，磷酸緩沖液包括0.025mol/L磷酸緩沖液（pH值7）：準確稱取3．4g磷酸二氫鉀，加水約700mL后用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至7.0，定容至1000mL，二硫赤蘚醇提取液包括0.4%二硫赤蘚醇提取液：稱取4.0g二硫赤蘚醇，溶于1000mL0.05mol/L硼酸緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），碘乙酰胺溶液包括4%碘乙酰胺溶液：稱取4.0g碘乙酰胺，溶于100mL0.025mol/L磷酸緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），流動相，分別量取800mL水，1mL三氟乙酸，200mL乙腈，然后混勻；

S2、待檢測物和設(shè)備檢測前準備，包括：（1）全價不含抗菌藥物的飼料，全價飼料連續(xù)喂養(yǎng)十天的動物，之后收集動物代謝物備用，（2）色譜柱：AgilentZorbaxXDB－C18（4.6m×250mm×5μm，I.D），（3）檢測器：紫外檢測器，檢測波長266nm；（4）流動相為水：三氟乙酸∶乙腈=800∶1∶200 （體積比）；（5）柱溫：30℃；流速：1mL/min；進樣量：100μL；

S3、樣品的提取和凈化，提取衍生，將動物代謝物攪拌均勻，轉(zhuǎn)移到100mL干凈的小燒杯中，用玻璃棒將其攪拌均勻，稱?。?.0±0.1）g代謝物樣品，置50mL具塞離心管中，加入0.4%二硫赤蘚醇提取液10mL，渦旋1～2min混勻，50℃水浴30min，每隔3～5min渦旋振蕩1次，振蕩后立即放入水浴中， 30min后置于室溫，冷卻后加入4%碘乙酰胺溶液3mL，渦旋1～2min混勻，室溫避光衍生30min，每隔 10min，渦旋混勻1次，衍生完畢后加入0．025mol/L磷酸緩沖液5mL，調(diào)節(jié)pH值至2.5～3.0，于4℃10000r/min離心20min，取上清液置于另一離心管中，備用凈化，用3mL甲醇、3mL磷酸緩沖液預(yù)先將C18固相萃取柱活化，然后將上清液加入柱中，用10mL超純水淋洗，真空固相萃取裝置抽干，最后用5mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，45℃氮氣吹干， 用0．5mL流動相溶解，渦旋振蕩5min，超聲5min，0.22μm微孔濾膜過濾，取100μL進行HPLC檢測；

S4、回收率和精密度確定，稱代謝物5g，置于50mL聚丙烯離心管中，分別加入0.1、1.0、10.0μg/mL的標準工作液各1mL，經(jīng)上述方法提取和凈化后，HPLC檢測，求得雞蛋樣品中頭孢噻呋在0.02、0.20、2.00μg/g水平上的回收率，測定時，每個濃度處理在同一工作日內(nèi)測定5次（日內(nèi)）；在不同工作日測定5批次（日間），每批次5次重復(fù)，分別計算日內(nèi)和日間的色譜峰面積平均值及標準誤，求日內(nèi)和日間相對標準偏差（RS）；

S5、靈敏度測定稱取5份空白雞蛋勻漿各5g，置于 50mL聚丙烯離心管中，分別加0.05、 0.10、0.25、0.50、1.00μg/mL的標準工作液各1mL，使每1g雞蛋勻漿含頭孢 噻呋0.01、0.02、0.05、0.10、0.20μg，按上述方法提取、凈化。

實施例一

一種頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒，包括色譜儀、二極管陣列檢測器、色譜柱、漩渦混合器、電熱恒溫水浴鍋、離心機、分析天平、勻漿機、氮氣吹干儀和雙重水蒸餾器、頭孢噻呋標準品、乙腈、甲醇為色譜純、二硫赤蘚醇（純度99%）、碘乙酰胺（純度99%）、三氟乙酸和四硼酸鈉等，其特征在于：該頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒檢測步驟為：

S1、配制主要溶液，主要溶液包括標準儲備液、標準工作液、硼酸緩沖液、磷酸緩沖液、二硫赤蘚醇提取液、碘乙酰胺溶液和流動相，包括標準儲備液包括精密稱取10.0mg頭孢噻呋標準品，置于100mL容量瓶內(nèi)，用磷酸緩沖液溶解并稀釋定容至刻度，即成濃度為100μg/mL的頭孢噻呋儲備液，臨用前用磷酸緩沖液配成系列標準濃度，標準工作液包括取1mL頭孢噻呋儲備液，依次用磷酸緩沖液稀釋定容至10.00、 5.00、1.00、0.50、0.25、0.10、0.05μg/mL，硼酸緩沖液包括0.05mol/L硼酸緩沖液（pH值9），準確稱取四硼酸鈉19.05g、氯化鉀3.70g，定容至1000mL，磷酸緩沖液包括0.025mol/L磷酸緩沖液（pH值7）：準確稱取3．4g磷酸二氫鉀，加水約700mL后用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至7.0，定容至1000mL，二硫赤蘚醇提取液包括0.4%二硫赤蘚醇提取液：稱取4.0g二硫赤蘚醇，溶于1000mL0.05mol/L硼酸緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），碘乙酰胺溶液包括4%碘乙酰胺溶液：稱取4.0g碘乙酰胺，溶于100mL0.025mol/L磷酸緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），流動相，分別量取800mL水，1mL三氟乙酸，200mL乙腈，然后混勻；

S2、待檢測物和設(shè)備檢測前準備，包括：（1）全價不含抗菌藥物的飼料，全價飼料連續(xù)喂養(yǎng)十天的動物，之后收集動物代謝物備用，（2）色譜柱：AgilentZorbaxXDB－C18（4.6m×250mm×5μm，I.D），（3）檢測器：紫外檢測器，檢測波長266nm；（4）流動相為水：三氟乙酸∶乙腈=800∶1∶200 （體積比）；（5）柱溫：30℃；流速：1mL/min；進樣量：100μL；

S3、樣品的提取和凈化，提取衍生，將動物代謝物攪拌均勻，轉(zhuǎn)移到100mL干凈的小燒杯中，用玻璃棒將其攪拌均勻，稱取4.9g代謝物樣品，置50mL具塞離心管中，加入0.4%二硫赤蘚醇提取液10mL，渦旋1～2min混勻，50℃水浴30min，每隔3～5min渦旋振蕩1次，振蕩后立即放入水浴中， 30min后置于室溫，冷卻后加入4%碘乙酰胺溶液3mL，渦旋1min混勻，室溫避光衍生30min，每隔 10min，渦旋混勻1次，衍生完畢后加入0．025mol/L磷酸緩沖液5mL，調(diào)節(jié)pH值至2.8，于4℃10000r/min離心20min，取上清液置于另一離心管中，備用凈化，用3mL甲醇、3mL磷酸緩沖液預(yù)先將C18固相萃取柱活化，然后將上清液加入柱中，用10mL超純水淋洗，真空固相萃取裝置抽干，最后用5mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，45℃氮氣吹干，用0.5mL流動相溶解，渦旋振蕩5min，超聲6min，0.22μm微孔濾膜過濾，取100μL進行HPLC檢測；

S4、回收率和精密度確定，稱代謝物5g，置于50mL聚丙烯離心管中，分別加入0.1、1.0、10.0μg/mL的標準工作液各1mL，經(jīng)上述方法提取和凈化后，HPLC檢測，求得雞蛋樣品中頭孢噻呋在0.02、0.20、2.00μg/g水平上的回收率，測定時，每個濃度處理在同一工作日內(nèi)測定5次（日內(nèi)）；在不同工作日測定5批次（日間），每批次5次重復(fù)，分別計算日內(nèi)和日間的色譜峰面積平均值及標準誤，求日內(nèi)和日間相對標準偏差（RS）；

S5、靈敏度測定稱取5份空白雞蛋勻漿各5g，置于 50mL聚丙烯離心管中，分別加0.05、 0.10、0.25、0.50、1.00μg/mL的標準工作液各1mL，使每1g雞蛋勻漿含頭孢 噻呋0.01、0.02、0.05、0.10、0.20μg，按上述方法提取、凈化。

實施例二

一種頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒，包括色譜儀、二極管陣列檢測器、色譜柱、漩渦混合器、電熱恒溫水浴鍋、離心機、分析天平、勻漿機、氮氣吹干儀和雙重水蒸餾器、頭孢噻呋標準品、乙腈、甲醇為色譜純、二硫赤蘚醇（純度99%）、碘乙酰胺（純度99%）、三氟乙酸和四硼酸鈉等，其特征在于：該頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒檢測步驟為：

S1、配制主要溶液，主要溶液包括標準儲備液、標準工作液、硼酸緩沖液、磷酸緩沖液、二硫赤蘚醇提取液、碘乙酰胺溶液和流動相，包括標準儲備液包括精密稱取10.0mg頭孢噻呋標準品，置于100mL容量瓶內(nèi)，用磷酸緩沖液溶解并稀釋定容至刻度，即成濃度為100μg/mL的頭孢噻呋儲備液，臨用前用磷酸緩沖液配成系列標準濃度，標準工作液包括取1mL頭孢噻呋儲備液，依次用磷酸緩沖 液稀釋定容至10.00、5.00、1.00、0.50、0.25、0.10、0.05μg/mL，硼酸緩沖液包括0.05mol/L硼酸緩沖液（pH值9），準確稱 取四硼酸鈉19.05g、氯化鉀3.70g，定容至1000mL，磷酸緩沖液包括0.025mol/L磷酸緩沖液（pH值7）：準確稱取3.4g磷酸二氫鉀，加水約700mL后用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至7.0，定容至1000mL，二硫赤蘚醇提取液包括0.4%二硫赤蘚醇提取液：稱取4.0g二硫赤蘚醇，溶于1000mL0.05mol/L硼酸緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），碘乙酰胺溶液包括4%碘乙酰胺溶液：稱取4.0g碘乙酰胺，溶于100mL0.025mol/L磷酸緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），流動相，分別量取800mL水，1mL三氟乙酸，200mL乙腈，然后混勻；

S2、待檢測物和設(shè)備檢測前準備，包括：（1）全價不含抗菌藥物的飼料，全價飼料連續(xù)喂養(yǎng)十天的動物，之后收集動物代謝物備用，（2）色譜柱，（3）檢測器，（4）流動相為水，（5）柱溫；

S3、樣品的提取和凈化，提取衍生，將動物代謝物攪拌均勻，轉(zhuǎn)移到100mL干凈的小燒杯中，用玻璃棒將其攪拌均勻，稱取5.1g代謝物樣品，置50mL具塞離心管中，加入0.4%二硫赤蘚醇提取液10mL，渦旋1.5min混勻，50℃水浴30min，每隔4min渦旋振蕩1次，振蕩后立即放入水浴中，30min后置于室溫，冷卻后加入4%碘乙酰胺溶液3mL，渦旋1.5混勻，室溫避光衍生30min，每隔 10min，渦旋混勻1次，衍生完畢后加入0．025mol/L磷酸緩沖液5mL，調(diào)節(jié)pH值至2.8，于4℃10000r/min離心25min，取上清液置于另一離心管中，備用凈化，用3mL甲醇、3mL磷酸緩沖液預(yù)先將C18固相萃取柱活化，然后將上清液加入柱中，用10mL超純水淋洗，真空固相萃取裝置抽干，最后用5mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，45℃氮氣吹干，用0.5mL流動相溶解，渦旋振蕩5min，超聲8min，0.22μm微孔濾膜過濾，取100μL進行HPLC檢測；

S4、回收率和精密度確定，稱代謝物5g，置于50mL聚丙烯離心管中，分別加入0.1、1.0、10.0μg/mL的標準工作液各1mL，經(jīng)上述方法提取和凈化后，HPLC檢測，求得雞蛋樣品中頭孢噻呋在0.02、0.20、2.00μg/g水平上的回收率；

S5、靈敏度測定稱取5份空白雞蛋勻漿各5g，置于 50mL聚丙烯離心管中，分別加0.05、 0.10、0.25、0.50、1.00μg/mL的標準工作液各1mL，使每1g雞蛋勻漿含頭孢 噻呋0.01、0.02、0.05、0.10、0.20μg，按上述方法提取、凈化。

實施例三

一種頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒，包括色譜儀、二極管陣列檢測器、色譜柱、漩渦混合器、電熱恒溫水浴鍋、離心機、分析天平、勻漿機、氮氣吹干儀和雙重水蒸餾器、頭孢噻呋標準品、乙腈、甲醇為色譜純、二硫赤蘚醇（純度99%）、碘乙酰胺（純度99%）、三氟乙酸和四硼酸鈉等，其特征在于：該頭孢噻呋代謝物檢測方法及試劑盒檢測步驟為：

S1、配制主要溶液，主要溶液包括標準儲備液、標準工作液、硼酸緩沖液、磷酸緩沖液、二硫赤蘚醇提取液、碘乙酰胺溶液和流動相，包括標準儲備液包括精密稱取10.0mg頭孢噻呋標準品，置于100mL容量瓶內(nèi)，用磷酸緩沖液溶解并稀釋定容至刻度，即成濃度為100μg/mL的頭孢噻呋儲備液，臨用前用磷酸緩沖液配成系列標準濃度，標準工作液包括取1mL頭孢噻呋儲備液，依次用磷酸緩沖 液稀釋定容至10.00、 5.00、1.00、0.50、0.25、0.10、0.05μg/mL，硼酸緩沖液包括0.05mol/L硼酸緩沖液（pH值9），準確稱 取四硼酸鈉19.05g、氯化鉀3.70g，定容至1000mL，磷酸緩沖液包括0.025mol/L磷酸緩沖液（pH值7）：準確稱取3．4g磷酸二氫鉀，加水約700mL后用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至7.0，定容至1000mL，二硫赤蘚醇提取液包括0.4%二硫赤蘚醇提取液：稱取4.0g二硫赤蘚醇，溶于1000mL0.05mol/L硼酸緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），碘乙酰胺溶液包括4%碘乙酰胺溶液：稱取4.0g碘乙酰胺，溶于100mL0.025mol/L磷酸緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），流動相，分別量取800mL水，1mL三氟乙酸，200mL乙腈，然后混勻；

S2、待檢測物和設(shè)備檢測前準備，包括：（1）全價不含抗菌藥物的飼料，（2）色譜柱，（3）檢測器，（4）流動相為水，（5）柱溫。

S3、樣品的提取和凈化，提取衍生，將動物代謝物攪拌均勻，轉(zhuǎn)移到100mL干凈的小燒杯中，用玻璃棒將其攪拌均勻，稱取5.1g代謝物樣品，置50mL具塞離心管中，加入0.4%二硫赤蘚醇提取液10mL，渦旋2min混勻，50℃水浴30min，每隔5min渦旋振蕩1次，振蕩后立即放入水浴中， 30min后置于室溫，冷卻后加入4%碘乙酰胺溶液3mL，渦旋混勻，室溫避光衍生，每隔10min，渦旋混勻1次，衍生完畢后加入0.025mol/L磷酸緩沖液5mL，調(diào)節(jié)pH值至3.0，于4℃10000r/min離心20min，取上清液置于另一離心管中，備用凈化，用甲醇、磷酸緩沖液預(yù)先將C18固相萃取柱活化，然后將上清液加入柱中，用超純水淋洗，真空固相萃取裝置抽干，最后用甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，45℃氮氣吹干，用0.5mL流動相溶解，渦旋振蕩5min，超聲7min，0.22μm微孔濾膜過濾，取100μL進行HPLC檢測；

S4、回收率和精密度確定，稱代謝物5g，置于50mL聚丙烯離心管中，分別加入0.1、1.0、10.0μg/mL的標準工作液各1mL，經(jīng)上述方法提取和凈化后，HPLC檢測；

S5、靈敏度測定稱取5份空白雞蛋勻漿各5g，置于50mL聚丙烯離心管中，分別加0.05、 0.10、0.25、0.50、1.00μg/mL的標準工作液各1mL，使每1g雞蛋勻漿含頭孢 噻呋0.01、0.02、0.05、0.10、0.20μg，按上述方法提取、凈化。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。