本發(fā)明屬于海洋環(huán)境污染監(jiān)測技術(shù)，主要涉及一種測定海洋無脊椎多毛類石油烴含量的方法。
背景技術(shù)：
：石油烴化合物是造成海洋污染的主要物質(zhì)之一，海洋中的石油烴類富集在海洋生物體內(nèi)，可以通過食物鏈傳遞進(jìn)而對人體造成危害。多毛類隸屬于環(huán)節(jié)動物門，是廣泛分布于海洋近岸和河口潮灘的優(yōu)勢底棲動物，由于其具有體型大、生命周期長、行動緩慢等特點，極易接觸并富集沉積質(zhì)中的石油烴化合物在體內(nèi)。研究表明，海洋多毛類能夠攝入大量的沉積物，通過一系列的轉(zhuǎn)化和分解作用使之成為無毒的代謝產(chǎn)物排出體外，表現(xiàn)出對許多持久性污染物較強(qiáng)的耐受性和生物利用性，因此目前已作為海洋沉積環(huán)境污染評價的指示生物和毒理研究的模型動物。故測定其體內(nèi)石油烴的含量可以深入了解石油烴化合物在其體內(nèi)的轉(zhuǎn)化和分解，為海洋環(huán)境污染監(jiān)測和海洋風(fēng)險評估提供新的技術(shù)支持。目前測定海洋生物體內(nèi)石油烴的含量應(yīng)用皂化方法處理樣品，但是皂化效果的差異會導(dǎo)致樣品石油烴含量測定產(chǎn)生巨大的差異性。如果皂化效果不好，萃取液會出現(xiàn)較嚴(yán)重的棕黃色，使得乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，影響萃取的效果，從而影響測定結(jié)果。此外皂化過程較為復(fù)雜耗時，皂化萃取過程中，試劑加入的順序、加入水的質(zhì)量和數(shù)量、取樣量多少、皂化時間、溫度、萃取次數(shù)均會影響最終測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。許巖等人（2014）研究了熒光分光光度計法測定貝類產(chǎn)品石油烴含量過程中所產(chǎn)生的不確定度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)貝類產(chǎn)品石油烴測定的不確定度主要由樣品的皂化反應(yīng)處理過程中的損失所致。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種能夠高效便捷、測試結(jié)果準(zhǔn)確的超聲-熒光檢測多毛類體內(nèi)石油烴含量的方法，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的超聲-熒光檢測多毛類體內(nèi)石油烴含量的方法，是利用超聲萃取提取多毛類體內(nèi)石油烴，進(jìn)而利用熒光檢測來測定多毛類體內(nèi)石油烴含量，所述方法包括以下步驟：a、油標(biāo)準(zhǔn)液的配置：稱取0.1g標(biāo)準(zhǔn)油于稱量瓶中，用色譜純正己烷溶解，全量移入100mL容量瓶中，用色譜純正己烷稀釋至標(biāo)線，混勻；將100mL容量瓶中混勻的溶液移取5mL溶液于50mL容量瓶中，用正己烷稀釋至標(biāo)線，混勻，配置成100ug/mL的油標(biāo)準(zhǔn)使用溶液；分別量取0mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL油標(biāo)準(zhǔn)使用溶液于6只10mL具塞比色管中，用色譜純正己烷稀釋至標(biāo)線混勻；依次用1cm石英測定池，以正己烷作參比，測定360nm處的熒光強(qiáng)度Ii和I0，并記錄測定數(shù)據(jù)，以熒光強(qiáng)度Ii—I0作為縱坐標(biāo)，相應(yīng)以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；b、在105℃條件下將多毛類烘干成粉末，烘干時間16小時；c、將粉末狀多毛類樣品與色譜純二氯甲烷混合進(jìn)行超聲萃取，每0.05g粉末狀多毛類樣品加入1ml色譜純二氯甲烷，每次超聲時間為10min，間隔3min，重復(fù)此操作4次，4000r/min離心10分鐘，收集上清液；d、將c步驟中收集的上清液加入預(yù)先用色譜純二氯甲烷平衡8~12小時的60~100目硅膠層析柱，利用20ml二氯甲烷進(jìn)行洗脫；e、將d步驟獲得的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)處理，用正己烷定容至10ml后，用孔徑0.22um的尼龍膜過濾后，于激發(fā)波長310nm，發(fā)射波長360nm，狹縫設(shè)置1nm，掃描速度1200nm/min，PMT700V的條件下進(jìn)行熒光分光光度測定；f、以e步驟所測數(shù)據(jù)從a步驟的標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)數(shù)值，按照公式W=(m·V)/(F·M)計算出多毛類樣品中石油烴含量；其中m代表從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得石油烴的含量，單位為微克每毫升，V為萃取劑的體積，單位為毫升，F(xiàn)代表樣品的干濕比；M代表樣品的稱取量，單位為克；所述的多毛類為雙齒圍沙蠶或日本此沙蠶或多齒圍沙蠶；所述的樣品油為石油原油標(biāo)準(zhǔn)油20-3#。本發(fā)明首次利用超聲-熒光檢測方法測定了海洋多毛類動物體內(nèi)石油烴的含量，通過正交實驗和數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在用二氯甲烷作為溶劑和洗脫劑，超聲10分鐘重復(fù)4次條件下，加標(biāo)回收率范圍在89.3%-94.6%，能夠高效并準(zhǔn)確測定海洋多毛類動物體內(nèi)石油烴的含量，這一方法為深入了解石油烴化合物在海洋多毛類動物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化和分解提供技術(shù)支持，亦為海洋環(huán)境污染監(jiān)測和海洋風(fēng)險評估奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的方法高效便捷、測試結(jié)果準(zhǔn)確。附圖說明圖1為實施例石油烴檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實施方式本發(fā)明的方法是利用超聲萃取提取多毛類體內(nèi)石油烴，進(jìn)而利用熒光檢測來測定多毛類體內(nèi)石油烴含量，方法包括以下步驟：a、油標(biāo)準(zhǔn)液的配置：稱取0.1g標(biāo)準(zhǔn)油于稱量瓶中，用色譜純正己烷溶解，全量移入100mL容量瓶中，用色譜純正己烷稀釋至標(biāo)線，混勻；將100mL容量瓶中混勻的溶液移取5mL溶液于50mL容量瓶中，用正己烷稀釋至標(biāo)線，混勻，配置成100ug/mL的油標(biāo)準(zhǔn)使用溶液；分別量取0mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL油標(biāo)準(zhǔn)使用溶液于6只10mL具塞比色管中，用色譜純正己烷稀釋至標(biāo)線混勻；依次用1cm石英測定池，以正己烷作參比，測定360nm處的熒光強(qiáng)度Ii和I0，并記錄測定數(shù)據(jù)，以熒光強(qiáng)度Ii—I0作為縱坐標(biāo)，相應(yīng)以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；b、在105℃條件下將多毛類烘干成粉末，烘干時間16小時；c、將粉末狀多毛類樣品與色譜純二氯甲烷混合進(jìn)行超聲萃取，每0.05g粉末狀多毛類樣品加入1ml色譜純二氯甲烷，每次超聲時間為10min，間隔3min，重復(fù)此操作4次，4000r/min離心10分鐘，收集上清液；d、將c步驟中收集的上清液加入預(yù)先用色譜純二氯甲烷平衡8~12小時的60~100目硅膠層析柱，利用20ml二氯甲烷進(jìn)行洗脫；e、將d步驟獲得的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)處理，用正己烷定容至10ml后，用孔徑0.22um的尼龍膜過濾后，于激發(fā)波長310nm，發(fā)射波長360nm，狹縫設(shè)置1nm，掃描速度1200nm/min，PMT700V的條件下進(jìn)行熒光分光光度測定；f、以e步驟所測數(shù)據(jù)從a步驟的標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)數(shù)值，按照公式W=(m·V)/(F·M)計算出多毛類樣品中石油烴含量；其中m代表從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得石油烴的含量，單位為微克每毫升，V為萃取劑的體積，單位為毫升，F(xiàn)代表樣品的干濕比；M代表樣品的稱取量，單位為克；所述的多毛類為雙齒圍沙蠶或日本此沙蠶或多齒圍沙蠶；所述的樣品油為石油原油標(biāo)準(zhǔn)油20-3#。具體實例如下：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：用正己烷配置100ug/ml油標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別量取0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL油標(biāo)準(zhǔn)使用液，用正己烷稀釋混勻，以正己烷作為參比，測定360nm處的熒光強(qiáng)度（Ii和I0），以熒光強(qiáng)度（Ii-I0）作為縱坐標(biāo)，相應(yīng)以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1所示）。雙齒圍沙蠶或日本此沙蠶或多齒圍沙蠶體內(nèi)石油烴萃取：稱取0.3g粉末狀雙齒圍沙蠶樣品，加入5mL二氯甲烷萃取劑進(jìn)行超聲萃取，每次萃取時間為10min，重復(fù)此操作4次，收集上清液。將獲得的上清液加入到硅膠層析柱中，加入20mL二氯甲烷進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。將洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，用正己烷定容至10mL。沙蠶體內(nèi)石油烴的測定：用熒光分光光度計測量其吸光值。熒光掃描條件設(shè)置為ex/em=310nm/360nm，狹縫設(shè)置1nm，掃描速度1200nm/min，PMT700V，將所測數(shù)據(jù)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算得出雙齒圍沙蠶樣品中石油烴含量。實驗過程中利用加標(biāo)回收試驗測得回收率范圍是89.3%-94.6%，平均值為92.2%。表明該方法提取效率高。表1超聲波萃取-熒光法測定雙齒圍沙蠶體內(nèi)石油烴含量回收率實驗次數(shù)加標(biāo)量μg測得量μg回收率%13027.69223028.494.633027.99343026.889.3平均值27.692.2當(dāng)前第1頁1 2 3