本發(fā)明涉及藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種奈帕芬胺及其降解雜質(zhì)和工藝雜質(zhì)的反向高效液相色譜檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

奈帕芬胺，化學(xué)名為2-氨基-3-苯甲酰基苯基乙酰胺，其結(jié)構(gòu)式如下：

奈帕芬胺(Nepafenac)是一種新型眼用非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥(NSAIDs)。用于眼內(nèi)炎癥的治療。目前研究結(jié)果表明Nepafenac效果優(yōu)于傳統(tǒng)NSAIDs且安全性良好。2005年8月19日，美國食品與藥物管理局(FDA)允許其眼用混懸液(商品名為Nevanac，Alton公司)應(yīng)用于臨床，使其成為FDA批準(zhǔn)的首個(gè)眼科用非激素類抗炎前體藥物。

Nepafenac經(jīng)眼部給藥后，可迅速穿過角膜，并在眼組織水解酶的作用下轉(zhuǎn)化為氨芬酸，迅速到達(dá)靶位點(diǎn)發(fā)揮作用。而氨芬酸又通過抑制前列腺素H合成酶(環(huán)氧化酶)，阻斷前列腺素的合成，來發(fā)揮其抗炎止痛的作用。NSAIDs經(jīng)眼部給藥后，可抑制前列腺素在虹膜、睫狀體和結(jié)膜的合成，因此可預(yù)防眼部炎癥的發(fā)生，減少相關(guān)的疼痛。與傳統(tǒng)NSAIDs相比，Nepafenac具有滲透力強(qiáng)、靶向作用強(qiáng)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。

在藥物分析中所稱的“有關(guān)物質(zhì)(related substances)”是指在原料藥生產(chǎn)過程中帶入的起始原料、試劑、中間體、副產(chǎn)物和異構(gòu)體等物質(zhì)，也可能是制劑在生產(chǎn)、貯藏和運(yùn)輸過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物、聚合物或晶型轉(zhuǎn)變等特殊雜質(zhì)。有關(guān)物質(zhì)的種類與藥物的合成路線和制劑工藝密切相關(guān)，藥物在合成和制劑過程中的任何一個(gè)因素的改變都可能導(dǎo)致其有關(guān)物質(zhì)的種類不同，因而有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)和控制過程相對(duì)復(fù)雜。有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)是控制藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)。

在奈帕芬胺原料藥生產(chǎn)過程中帶入的起始原料、試劑、中間體、副產(chǎn)物和異構(gòu)體等雜質(zhì)，確定相關(guān)雜質(zhì)譜：雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、H、I(見表1)。

表1奈帕芬胺各雜質(zhì)名稱及結(jié)構(gòu)

現(xiàn)有文獻(xiàn)中為見能夠分離上述8種雜質(zhì)的分析方法，本發(fā)明提供一種能夠分離上述雜質(zhì)和奈帕芬胺的分析方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種高靈敏度的檢測(cè)方法，解決將奈帕芬胺特征峰與降解雜質(zhì)、較多的合成中間體及工藝雜質(zhì)特征峰分離的問題。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

奈帕芬胺的有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的RT-HPLC檢測(cè)方法，包括下列步驟：

a)配置分析溶液

用甲醇、乙腈單一溶劑或甲醇-水、乙腈-水混合溶液溶解樣品，制成分析溶液；

b)色譜條件

色譜柱為反相色譜柱，所述反相色譜柱選自苯基硅烷鍵合硅膠色譜柱、十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱或八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

以酸銨鹽溶液-有機(jī)相的混合液為流動(dòng)相，流動(dòng)相pH范圍5～8，所述的有機(jī)相為甲醇或乙腈；采用梯度洗脫方法，流速為0.8-1.3ml/min；柱溫為25-50℃，檢測(cè)波長為205-300nm；運(yùn)行時(shí)間40-70min；

c)上機(jī)測(cè)定

取步驟a)制成的分析溶液5-40μl注入高效液相色譜儀，進(jìn)行色譜分析，并記錄色譜圖。

在一些實(shí)施例中，所述反相色譜柱的填充劑為苯基硅烷鍵合硅膠色譜柱或十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱或八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，優(yōu)選為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱。

在一些實(shí)施例中，所述反相色譜柱的規(guī)格為：柱長介于100mm至300mm，色譜柱內(nèi)徑介于1mm至10mm，粒徑介于1μm至10μm，優(yōu)選為Agilent ZORBAX C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱。

在一些實(shí)施例中，所述酸銨鹽溶液的濃度為0.001-0.05mol/L、pH 2.0-7.0，優(yōu)選酸銨鹽溶液的濃度為0.01mol/L、pH 6.5。

在一些實(shí)施例中，所述酸銨鹽為甲酸銨、乙酸銨、碳酸氫銨中之一，優(yōu)選乙酸銨。

所述酸銨鹽溶液-有機(jī)相的體積比為90:10-20:80。在一些實(shí)施例中，所述酸銨鹽溶液-有機(jī)相，所述酸銨鹽溶液-有機(jī)相的體積比為90:10～30:70，優(yōu)選為70:30～30:70。

所述步驟b為所述反相色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，所述流動(dòng)相為乙酸銨溶液與乙腈混合液，乙酸銨溶液0.01mol/L，所述流動(dòng)相中乙酸銨溶液-乙腈的比例按0、25～30、38～42、48～52、53～57、63～67min時(shí)間點(diǎn)，水相體積比為73～77％、73～77％、58～62％、13～16％、13～16％、73～77％、進(jìn)行梯度洗脫。。

所述樣品為奈帕芬胺原料藥或其制劑，所述制劑為片劑、膠囊劑、顆粒劑、眼用制劑、鼻用制劑、栓劑、丸劑、軟膏劑乳膏劑、糊劑、吸入制劑、噴霧劑、氣霧劑、凝膠劑、散劑、糖漿劑、搽劑、涂劑、涂膜劑、酊劑、貼劑、口服溶液劑、植入劑、膜劑、洗劑、沖洗劑、煎膏劑、膏藥、露劑、茶劑。

有益效果：

本發(fā)明能夠有效的測(cè)定奈帕芬胺溶液中各種相關(guān)雜質(zhì)的存在，尤其實(shí)現(xiàn)了譜圖中奈帕芬胺特征峰與奈帕芬胺降解雜質(zhì)特征峰及其相關(guān)中間體、工藝雜質(zhì)特征峰的分離。同時(shí)本發(fā)明的方法還可用于奈帕芬胺制劑的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。

本發(fā)明的分析方法各雜質(zhì)的分離度都大于1.5，不對(duì)稱因子都在1.9-1.2范圍內(nèi)，達(dá)到準(zhǔn)確有效分離目的。上述方法的檢測(cè)可以確保產(chǎn)品的質(zhì)量可控。

附圖說明

圖1實(shí)施例1方法梯度洗脫的色譜圖；

(注：圖中1‐10分別為雜質(zhì)A、B、C、奈帕芬胺、D、E、F、G、H、I)

圖2實(shí)施例1方法梯度洗脫的色譜圖；

(注：圖中1‐10分別為雜質(zhì)A、B、C、奈帕芬胺、D、E、F、G、H、I)

圖3實(shí)施例1方法梯度洗滌的色譜圖；

(注：圖中1‐10分別為雜質(zhì)A、B、C、奈帕芬胺、D、E、F、G、H、I)

圖4實(shí)施例1方法梯度洗滌的色譜圖；

(注：圖中1‐10分別為雜質(zhì)A、B、C、奈帕芬胺、D、E、F、G、H、I)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

實(shí)施例1

(1)儀器與色譜條件

高效液相色譜儀：u3000高效液相色譜系統(tǒng)及工作站；

色譜柱：Thermo Syncronis C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱

配置0.01mol/L乙酸銨溶液、稀氨水調(diào)節(jié)pH至3.5為水相，流動(dòng)相中水相-乙腈的比例按0、26、35、40、47、50、60min時(shí)間點(diǎn)，水相體積比為72％、72％、55％、15％、75％、75％，設(shè)置流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長為240nm，柱溫50℃。

(2)實(shí)驗(yàn)步驟

分別取奈帕芬胺、雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、H、I適量，用乙腈-乙酸銨水溶液(80:20)溶解并稀釋成每1ml中約含奈帕芬胺及各雜質(zhì)10μg的混合溶液，作為分析溶液；

取上述分析溶液5μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見附圖1，雜質(zhì)和奈帕芬胺基本可以分離開，但該條件下雜質(zhì)B峰形較差，不對(duì)稱性因子較大0.7，一般而言不對(duì)稱性因子在0.9-1.2范圍內(nèi)較為理想。雜質(zhì)E、F、G未能實(shí)現(xiàn)基線完全分離。綜上，該方法需進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化。

實(shí)施例2

(1)儀器與色譜條件

高效液相色譜儀：u3000高效液相色譜系統(tǒng)及工作站；

色譜柱：Thermo Syncronis C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

配置0.01mol/L乙酸銨溶液、稀氨水調(diào)節(jié)pH至6.8為水相，流動(dòng)相中水相-乙腈的比例按0、25、50、53、65min時(shí)間點(diǎn)，水相體積比為78％、78％、20％、78％、78％進(jìn)行梯度洗脫，設(shè)置流速為1.3ml/min，檢測(cè)波長為240nm，柱溫40℃。

(2)實(shí)驗(yàn)步驟

分別取奈帕芬胺、雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、H、I適量，用乙腈-水(70:30)

溶解并稀釋成每1ml中約含奈帕芬胺及雜質(zhì)各20μg的混合溶液，作為分析溶液；

取上述分析溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見附圖2，可以看出該條件下奈帕芬胺主峰和其他雜質(zhì)峰完全分離。

實(shí)施例3

(1)儀器與色譜條件

高效液相色譜儀：U3000高效液相色譜系統(tǒng)及工作站；

色譜柱：Agilent ZORBAX C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

配置0.01mol/L乙酸銨溶液為水相，流動(dòng)相中水相-乙腈的比例按0、28、50、52、60min時(shí)間點(diǎn)，水相體積比為75％、75％、25％、75％、75％進(jìn)行梯度洗脫，流速1.1ml/min；柱溫35℃，檢測(cè)波長250nm；

(2)實(shí)驗(yàn)步驟

分別取奈帕芬胺、雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、H、I適量，用乙腈-水(70:30)溶解并稀釋成每1ml中約含奈帕芬胺及雜質(zhì)各10μg的混合溶液，作為分析溶液；

取上述分析溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見附圖3，可以看出該條件下萘帕芬胺主峰和其他雜質(zhì)峰完全分離。

實(shí)施例4

(1)儀器與色譜條件

高效液相色譜儀：U3000高效液相色譜系統(tǒng)及工作站

色譜柱：Phenomenex Luna C₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱

配置甲醇-0.01mol/L乙酸銨溶液pH至6.0(10:90)為水相，流動(dòng)相中水相-乙腈的比例按0、25、50、53、65min時(shí)間點(diǎn)，水相體積比為80％、80％、60％、20％、80％、80％，設(shè)置流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長為240nm，柱溫50℃。

(2)實(shí)驗(yàn)步驟

分別取奈帕芬胺、雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、H、I適量，用甲醇-水(70:30)溶解并稀釋成每1ml中約含奈帕芬胺各20μg的混合溶液，作為分析溶液；

取上述分析溶液30μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見附圖3，可以看出該條件下奈帕芬胺主峰和其他雜質(zhì)峰完全分離。

如下表2所示，實(shí)施例1的方法分離出來結(jié)果，雜質(zhì)B、F不對(duì)稱性較差，并且雜質(zhì)E、F分離度為1.4和1.3，未完全分離。實(shí)施例2、3、4分離度和不對(duì)稱因子都比較好，能夠到達(dá)有效分離。

表2實(shí)施例1-4雜質(zhì)分離度和不對(duì)稱因子情況表