本發(fā)明屬于分析化學技術領域，具體涉及一種快速測定多菌靈的電化學傳感器、制備方法及在測定多菌靈中的應用。

背景技術：

多菌靈又名棉萎靈、苯并咪唑44號。多菌靈是一種廣譜性殺菌劑，對多種作物由真菌(如半知菌、多子囊菌)引起的病害有防治效果。因其殺菌效果好而在農業(yè)上有廣泛的應用。多菌靈對人、動物均有一定的毒性，農副產品、食品中常殘留一定量的多菌靈，對我們人體健康構成威脅。因此，農副產品、食品中多菌靈殘留量的測定越來越受到人們的重視。

目前，對多菌靈含量測定方法主要有高效液相色譜法、質譜法、固相萃取法-HCLP、電化學法和氣-質聯用等方法。這些方法常常要對待測樣品進行預處理，步驟麻煩、耗費大量時間，且大多需要大型高檔分析儀器、檢測成本高，不能滿足大量樣品的現場快速測定的要求，因此應用受到限制?，F在，已有很多有關修飾電極快速檢驗對多菌靈含量的文獻報道。

碳納米管(CNTs)是一種由單層或多層石墨烯片卷曲而成的中空管狀納米碳材料，用作電極材料能很好地促進電活性物質的電子傳遞，加快了材料中電子的相互交換，電化學反應活性顯著增強，已廣泛應用于制備化學或生物傳感器。氨基和羧基共同組成纈氨酸，正因如此，用纈氨酸來修飾電極，電極會有特殊的性質，被纈氨酸修飾的材料現在已得到廣泛的研究。電聚合由電極反應誘發(fā)聚合反應。近些年，電聚合方法作為修飾電極方法之一得到了快速發(fā)展，在傳感器、電催化方面得到廣泛應用，電化學方面的地位日益顯著。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速測定多菌靈的電化學傳感器、該電化學傳感器的制備方法及在測定多菌靈中的應用。

為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是，一種快速測定多菌靈的電化學傳感器，該傳感器為纈氨酸/多壁碳納米管復合材料修飾的玻碳電極。

所述的電化學傳感器的制備方法，包括以下步驟：將MWCNTs/GCE電極放置在VAL-PBS(5mmol/L)溶液中，在電位為-0.8-2.0V區(qū)間以時間900s進行電流-時間掃描，制備VAL-MWCNTs/GCE電極。

所述的傳感器的對比電極VAL/GCE電極的制備方法如下：先稱量纈氨酸，加入PBS緩沖液，超聲2h，制成5mmol/L溶液液備用。將裸電極放置在該溶液中，在電位為-0.8-2.0V以時間900s進行電流-時間掃描，制得VAL/GCE.。

優(yōu)選的，所述MWCNTs/GCE電極的制備方法如下：稱取MWCNTs，加入DMF溶液，超聲處理2h，得到1mg/ml的黑色懸浮液，先用XK96-B快速混勻器將此懸浮液進行混勻，然后用移液槍吸取5μL懸浮液均勻滴涂在處理好的GCE上，然后放在紅外燈下烘干即可。

優(yōu)選的，所述GCE電極的處理方法如下：先將GCE電極在砂紙上打磨，然后依次用倒有0.3μm和0.05μm的氧化鋁制成拋光粉的玻璃板上拋光至表面光潔，然后分別在溶液中超聲清洗，備用。

優(yōu)選的，所述溶液為無水乙醇、二次蒸餾水，超聲順序為先是無水乙醇，再是二次蒸餾水，最后用二次蒸餾水沖洗。

本發(fā)明利用循環(huán)伏安法(CV)分別研究了在鐵氰化鉀溶液和(BMC)待測物的磷酸-硼酸-醋酸緩沖溶液(B-R)中修飾電極的電化學行為。利用差分脈沖伏安法(DPV)測定出不同濃度的多菌靈(BMC)對氧化峰電流產生的影響。同時也對阻抗、計時庫侖、掃速、pH等進行分析測定，整個測定過程在室溫下進行，多菌靈均用一定pH的B-R緩沖溶液進行稀釋。

優(yōu)選的，所述磷酸-硼酸-醋酸緩沖溶液的pH為1.38、1.62、1.68、2.08、2.16、2.25。

優(yōu)選的，所述磷酸-硼酸-醋酸緩沖溶液的pH優(yōu)選1.38。

本發(fā)明產生的有益效果是：本發(fā)明所制備的電化學傳感器制備方法簡單、快速且穩(wěn)定性好，該電極能夠有效地提高多菌靈在此修飾電極上的氧化峰的電流，因此該電極對多菌靈具有良好的電催化活性，測定多菌靈的靈敏度較高、成本低廉，特別適合于生物活性分析，具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1為不同電極在鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安圖(a：GCE，b：VAL/GCE，c：MWCNTs/GCE，d：VAL/MWCNTs/GCE)；

圖2為不同電極測定多菌靈(BMC)的循環(huán)伏安圖(a：GCE，b：VAL/GCE，c：MWCNTs/GCE，d：VAL/MWCNTs/GCE；1.0mmol/L的BMC(0.04mol/L-B-R 1.38)，scan：100mV/s)；

圖3為不同電極的交流阻抗圖(a：GCE，d：VAL/MWCNTs/GCE)；

圖4為不同電極上的計時庫侖行為(曲線a為裸電極，曲線b為VAL/MWCNTs/GCE)；

圖5為不同掃速對BMC氧化還原行為的影響(BMC濃度：5mmol/L，pH＝1.38，a-f掃描速度：20，80，100，120，150，200mV/s)；

圖6為不同pH對BMC峰電流的影響(a-f的pH：1.38，1.62，1.68，2.08，2.16，2.25)；

圖7為不同濃度下BMC的循環(huán)伏安圖(pH＝1.38，工作電極：VAL/MWCNTs/GCE，a-i：0.1、0.8、1、3、10、80、100、300、800μmol/L)。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。

實施例1

1)電極的預處理

先將玻碳電極(GCE，d＝3.0mm)在砂紙上打磨，然后依次用倒有0.3μm和0.05μm的氧化鋁制成拋光粉的玻璃板上拋光至表面光潔，然后分別在以下溶液中超聲清洗，順序是先無水乙醇，再二次蒸餾水，最后用二次水沖洗，備用。

2)VAL修飾電極的制備

先稱量5.8575mg的纈氨酸(VAL)，加入10mL PBS緩沖液，超聲2h，制成5mmol/L溶液液備用。將裸電極放置在該溶液中，在電位為-0.8-2.0V以時間900s進行電流-時間掃描，制得VAL/GCE.。

3)MWCNTs修飾電極的制備

稱量1.5mg多壁碳納米管(MWCNTs)，加入1.5mL DMF溶液，超聲處理2h，即可得到1mg/ml的黑色懸浮液。在制備MWCNTs/GCE電極電極時，要先用XK96-B快速混勻器將此懸浮液進行混勻，然后用移液槍吸取5μL懸浮液均勻滴涂在處理好的GCE上，然后放在紅外燈下烘干即可。

4)VAL-MWCNTs修飾電極的制備

稱取1.5mg MWCNTs加入1.5mLDMF，超聲2h，制成1mg/ml的黑色懸浮液，混勻，用移液槍吸取5μL懸浮液均勻滴涂在處理好的GCE上，放在紅外燈下烘干，然后把制備好的MWCNTs/GCE電極放置在VAL-PBS(5mmol/L)溶液在電位為-0.8-2.0V以時間900s進行電流-時間掃描，即可制備VAL-MWCNTs/GCE電極。

5)本實施例制備的修飾電極的系列測試

利用循環(huán)伏安法(CV)分別研究了在鐵氰化鉀溶液和多菌靈(BMC)待測物的磷酸-硼酸-醋酸緩沖溶液(B-R)中本實施例中VAL-MWCNTs修飾電極的電化學行為。利用差分脈沖伏安法(DPV)測定出不同濃度的多菌靈(BMC)對氧化峰電流產生的影響。同時也對阻抗、計時庫侖、掃速、pH等進行分析測定，整個實驗過程在室溫下進行，多菌靈均用一定pH的B-R緩沖溶液進行稀釋。

1.不同電極在鐵氰化鉀溶液中的CV電化學行為表征

分別用玻碳電極(GCE)、VAL修飾電極(VAL/GCE)、多壁碳納米管修飾電極(MWCNTs/GCE)、工作電極：纈氨酸-碳納米管復合納米材料修飾電極(VAL/MWCNTs/GCE)，以飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，輔助電極：鉑電極，構成三電極體系。在鐵氰化鉀溶液中，研究出不同電極的電化學行為(如圖1)，我們用這一工具進行：循環(huán)伏安法。如圖1結果表明，VAL-MWCNTs/GCE復合納米材料修飾電極所測峰電流最大且峰型基本對稱，可見此電極具有良好的電催化活性，可明顯提高分析靈敏度。

2.不同電極測定BMC的CV電化學行為表征

用0.04mol/L pH＝1.38的B-R作溶劑，配制出1.0mmol/L的BMC溶液。工作電極：分別為玻碳電極(GCE)、纈氨酸修飾電極(VAL/GCE)、多壁碳納米管修飾電極(MWCNTs/GCE)、纈氨酸-碳納米管復合納米材料修飾的電極(VAL/MWCNTs/GCE)，參比電極：飽和甘汞電極(SCE)，輔助電極：鉑電極，組成了三電極體系。在配制的BMC溶液中，進行循環(huán)伏安掃描，研究出不同電極的電化學行為(圖2)。由圖2所得，在BMC溶液中，用VAL-MWCNTs/GCE復合納米修飾電極峰電流也是最大。可見，由于纈氨酸和碳納米管所具有的好的導電特性，使得測定的靈敏度得到顯著提高。

3.交流阻抗測試

在1mmol/L Fe(CN)63-/4-、0.1mol/LKCl混合液中，對不同修飾電極的阻抗進行研究。由圖3可以看出，與裸電極(曲線a)相比，VAL-MWCNTs復合材料修飾玻碳電極(曲線b)上的阻抗比裸電極要小。由此可見，VAL-MWCNTs/GCE復合修飾材料修飾的電極阻抗小，導電性較好好，可以有效促進電極表面的電子轉移速率。

4.計時庫侖研究

用0.1mmol/L鐵氫化鉀溶液，對裸電極與VAL-MWCNTs/GCE電極上的計時庫侖進行了分析研究(圖5)。與裸電極(曲線a)相比，在VAL-MWCNTs復合物修飾玻碳電極(曲線b)上的計時庫侖明顯減少。

依據Anson公式

Q＝2nFAcD^1/2t^1/2π^1/2+Qdc+Qds

底物濃度：c，其中工作電極表面積：A，Qdc是雙電層電荷可以消除，Qds是法拉第電荷，其他符號具有通常的意義。

通過實驗測定分析，裸電極的Q-t^1/2關系曲線為：

Q(μC)＝-18.45t^1/2+0.072

因此，根據Anson公式計算出裸電極電極表面積為0.0539cm²。

VAL-MWCNTs/GCE電極的Q-t^1/2關系曲線為：

Q(μC)＝-42.70t^1/2-15.04

因此，根據Anson公式計算出VAL-MWCNTs/GCE電極表面積為0.1248cm²。

可見，VAL-MWCNTs/GCE電極比表面積比裸電極比表面積大2.3倍，說明VAL-MWCNTs/GCE用作電極材料能加快電子傳遞，增強電化學反應活性，提高反應靈敏度。

5.不同掃速對BMC電化學行為的影響測試

用含5mmol/L BMC的pH＝1.38的B-R溶液，將從20mV/s到200mV/s范圍內改變掃速，用VAL/MWCNTs/GCE作為工作電極，采用循環(huán)伏安法進行掃描研究(圖5)。由圖5可以看出，掃速在20-600mV/s變化時，隨著掃速的增加，氧化峰電流不斷增大。氧化峰電流與掃速的平方根呈現較好的線性關系。其中，氧化峰電流的線性方程為：I(μA)＝-11.398V1/2-23.313，線性相關系數R＝0.991，說明BMC在電極上的氧化還原過程受擴散控制。實驗用100mV/s掃速，也能夠降低實驗的背景電流。

6.不同pH的緩沖溶液對BMC電化學行為的影響測試

用含5mmol/LBMC的一系列不同pH的B-R溶液，用VAL/MWCNTs/GCE修飾電極作為工作電極，采用循環(huán)伏安法進行掃描研究(圖6)。由圖6可以看出，BMC的氧化峰電位Ep與pH值線性方程：Ep(V)＝-0.023PH+1.21，線性相關系數R＝0.995。對于氧化峰電流，可觀察到隨著pH的增加，電流先增大后減小，在pH＝1.38時氧化峰電流最大。故pH＝1.38的B-R緩沖溶液處可視為最佳支持電解質。

7.用pH＝1.38的B-R緩沖溶液配制一系列不同濃度的BMC溶液，用VAL/MWCNTs/GCE修飾電極作為工作電極，采用差分脈沖法(DPV)進行電化學行為的研究分析(圖7)。由圖7可看出，隨著BMC溶液濃度增大，氧化峰電流也逐漸增大。而且，氧化峰電流與濃度呈現出較好的線性，線性方程為I(μA)＝-0.1164c(mol/L)-7.513，線性相關系數為0.994，檢出限為0.08mol/L。

綜上所述，本發(fā)明以纈氨酸-多壁碳納米管復合納米材料作為電化學傳感器進行多菌靈(BMC)的測定。該電化學傳感器制備方法簡單、快速且穩(wěn)定性好，由于該電極能夠有效地提高多菌靈在此修飾電極上的氧化峰的電流，因此該電極對多菌靈具有良好的電催化活性，測定多菌靈的靈敏度較高、成本低廉，特別適合于生物活性分析，具有良好的應用前景。