本發(fā)明涉及大型溞快速檢測(cè)水質(zhì)毒性技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種用于大型蚤急性毒性檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
大型溞屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱、枝角類(lèi)，是常見(jiàn)的浮游甲殼動(dòng)物，是淡水食物鏈中不可缺少的組成成分。因其生活周期短、生長(zhǎng)快、生殖量高、易培養(yǎng)、對(duì)水環(huán)境脅迫敏感等特點(diǎn)使其成為國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的模式生物，在農(nóng)藥、化學(xué)品的急慢性毒性和環(huán)境激素效應(yīng)的測(cè)試方面具有重要的作用，且其在水域生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的地位，因此受到眾多國(guó)家毒理學(xué)工作者的重視。大型溞是敏感性較強(qiáng)，非常有代表性的一種浮游動(dòng)物，現(xiàn)已成為一種標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)生物，被廣泛用于水生生物毒理學(xué)的研究中。目前，ISO標(biāo)準(zhǔn)、OECD指南、美國(guó)EPA標(biāo)準(zhǔn)以及我國(guó)國(guó)標(biāo)中都有涉及大型溞的生長(zhǎng)抑制和繁殖的標(biāo)準(zhǔn)。
大型蚤急性毒性試驗(yàn)以蚤體的死亡和運(yùn)動(dòng)抑制表征急性毒性，大型蚤的急性毒性測(cè)定即用大型蚤為試驗(yàn)生物，測(cè)定物質(zhì)或廢水的24或48小時(shí)的半數(shù)抑制濃度(24h-EC50或48h-EC50)，或半數(shù)致死濃度(24h-LC50或48h-LC50)，以反映物質(zhì)或廢水的毒性程度。
在水質(zhì)物質(zhì)對(duì)溞類(lèi)(大型溞)的急性毒性測(cè)定方法中的測(cè)定原理主要是：24h-EC、48h-EC指在24h或48h內(nèi)百分之五十的受試蚤運(yùn)動(dòng)受抑制時(shí)被測(cè)物濃度。(運(yùn)動(dòng)受抑制是指反復(fù)轉(zhuǎn)動(dòng)試驗(yàn)容器，15s之內(nèi)失去活動(dòng)能力的大型蚤，被認(rèn)為運(yùn)動(dòng)受抑制；即使其觸角仍能活動(dòng)，也應(yīng)算做不活動(dòng)的個(gè)體。)24h-LC、48h-LC指在24h或48h內(nèi)百分之五十的受試蚤死亡時(shí)被測(cè)物的濃度，以受試蚤心臟停止跳動(dòng)為其死亡標(biāo)志。以試驗(yàn)樣品濃度(或其對(duì)數(shù))和相應(yīng)濃度下大型蚤的死亡率(或運(yùn)動(dòng)受抑制率)為基礎(chǔ)建立正相關(guān)關(guān)系，并據(jù)此估算得到該物質(zhì)對(duì)大型蚤的LC、EC值，因此如果能結(jié)合此原理快速測(cè)定液體毒性，從物理的角度直觀的表征方便判斷，那么就是對(duì)此方法應(yīng)用的更大進(jìn)步。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用于大型蚤急性毒性檢測(cè)試劑盒，設(shè)計(jì)合理、結(jié)果直觀、使用方便，檢測(cè)效率高。
本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種用于大型蚤急性毒性檢測(cè)的試劑盒，所述的試劑盒主要包括：包裝殼、觀察通道、加液通道、補(bǔ)光系統(tǒng)、培養(yǎng)容器；所述的觀察通道是指白色的透光片，所述的加液通道是指漏斗形的加液管連接的管路，所述的補(bǔ)光系統(tǒng)是由發(fā)光裝置、導(dǎo)線(xiàn)、開(kāi)關(guān)、電池組成，所述的培養(yǎng)容器分為兩組，對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組包含稀釋水母液容器、餌料容器和大型溞卵容器；所述的觀察通道安裝在培養(yǎng)容器上方，所述的補(bǔ)光系統(tǒng)安裝在培養(yǎng)容器的下方，所述的加液通道分別連接對(duì)照組和試驗(yàn)組的培養(yǎng)容器。
進(jìn)一步的，所述的試劑盒的制備方法主要包括以下步驟：a.挑選適宜的大型溞幼蟲(chóng)進(jìn)行培養(yǎng)，選擇體大、健康的大型溞作為母溞，然后選擇母溞制備溞卵，保存溞卵，備用；b.制備稀釋水母液、餌料；c.制備包裝殼，并將觀察通道、加液通道、補(bǔ)光系統(tǒng)、培養(yǎng)容器進(jìn)行生產(chǎn)組裝，即得到所述的用于大型蚤急性毒性檢測(cè)的試劑盒。
進(jìn)一步的，所述的挑選適宜的大型溞幼蟲(chóng)進(jìn)行培養(yǎng)是指選用試驗(yàn)室條件下培養(yǎng)3代以上的、出生12-24h的發(fā)育好，運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)的幼蚤，然后在20±2℃室內(nèi)條件下，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)注入水，所述的培養(yǎng)器皿內(nèi)的水可以循環(huán)流動(dòng)，給大型蚤培養(yǎng)器皿的水中加入微藻濃縮液，添加量為每100ml水添加2-5ml的微藻濃縮液，運(yùn)行循環(huán)水裝置10-30鐘，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)加入幼蚤，在蚤的生長(zhǎng)過(guò)程中每天運(yùn)行循環(huán)水裝置1小時(shí)，7-10日后，選擇體形較大、活動(dòng)能力強(qiáng)大型溞母體，然后進(jìn)行餌料喂養(yǎng)，餌料投放量為：每次30-50g/㎡，每天投喂3-5次，投喂時(shí)間為10-15天，然后使用分離裝置將成溞與幼溞進(jìn)行分離，將得到的成溞單獨(dú)在16-20℃的溫度下培養(yǎng)，觀察其產(chǎn)卵情況，并在24-48h內(nèi)收集所產(chǎn)的溞卵，將溞卵置入保存液放入大型溞卵容器。
進(jìn)一步的，所述的保存液優(yōu)選為甘油，所述的甘油濃度為25-50％，甘油能從空氣中吸收潮氣，也能吸收硫化氫、氰化氫和二氧化硫可以作為優(yōu)良的生物保存劑。
進(jìn)一步的，所述的將成溞與幼溞進(jìn)行分離的分離裝置主要包括分離容器和分離篩網(wǎng)，所述的分離篩網(wǎng)包括從下而上分別與分離容器的內(nèi)壁密封固定的下分離篩網(wǎng)和上分離篩網(wǎng)，所述的下分離篩網(wǎng)為1500μm的聚乙烯篩網(wǎng)，所述第二分離篩網(wǎng)為1200μm的聚乙烯篩網(wǎng)，分別對(duì)應(yīng)兩個(gè)分離容器，上下兩個(gè)分離篩網(wǎng)之間安裝有多個(gè)固定裝置，可根據(jù)選擇的細(xì)度大小，從而增加或減小不同孔徑大小的分離篩網(wǎng)及對(duì)應(yīng)的分離容器的數(shù)量。
進(jìn)一步的，所述的稀釋水母液的配制方法為：選用電導(dǎo)率為10μs/cm(lms/m)以下的蒸餾水或去離子水，按下述方法配制：a.氯化鈣溶液是將1g氯化鈣(CaC12·2H2O)溶于水中稀釋至80ml，b.硫酸鎂溶液是將0.5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)溶于水中稀釋至100ml，c.碳酸氫鈉溶液是將0.1g碳酸氫鈉(NaHCO3)溶于水中稀釋至40ml，d.氯化鉀溶液是將2.5mg氧化鉀(KCI)溶于水中稀釋至100ml；各取以上四種溶液25mL分別裝入的稀釋水母液容器中，備用。
進(jìn)一步的，所述的餌料是將小球藻經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后進(jìn)行脫水，離心，將收集到的小球藻冷凍干燥后按照常規(guī)工藝制備凍干粉，即得到所述的餌料，所述的餌料放入餌料容器中保存。
進(jìn)一步地，所述的容器及管路均選用無(wú)毒材料制成，耐高溫、耐腐蝕，每個(gè)組成部分都有明確的中英文標(biāo)記。
進(jìn)一步的，所述的試劑盒的使用方法為：
(1)取以上四種稀釋水母液25mL混合，稀釋至1L，必要時(shí)可用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使其穩(wěn)定在7.6-8.0，標(biāo)準(zhǔn)稀釋水應(yīng)容許大型蚤在其中生存至少48h，檢查稀釋水中不含有任何已知的對(duì)大型蚤有毒的物質(zhì)，例如：氯、重金屬、農(nóng)藥、氨或多氯聯(lián)苯等。
(2)將大型溞容器中的溞卵使用純凈水進(jìn)行沖洗，將保存液沖洗干凈；將沖洗干凈的大型蚤卵轉(zhuǎn)至孵化皿中，加入已配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水10-20ml，將試劑盒整體放入光照培養(yǎng)箱中，在18-25℃，6000LUX，72h的環(huán)境下進(jìn)行孵化；
(3)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果確定正式試驗(yàn)的濃度范圍，按幾何級(jí)數(shù)的濃度系列，即等比級(jí)數(shù)間距設(shè)計(jì)5-7個(gè)濃度；等比級(jí)系數(shù)不超過(guò)2.2，如1、2、4、8、16等比級(jí)系數(shù)為2，最高濃度處理組抑制或死亡率為100％，最低濃度處理組抑制或死亡率為0，系列濃度中以能出現(xiàn)一個(gè)大型蚤運(yùn)動(dòng)抑制率在40％-60％的濃度最為理想；
(4)給培養(yǎng)容器中滴加待測(cè)液，平均每蚤的待測(cè)液不低于2mL，每個(gè)濃度至少有4-6個(gè)平行，對(duì)照組內(nèi)裝相等體積的稀釋水，試驗(yàn)開(kāi)始后，打開(kāi)補(bǔ)光系統(tǒng)開(kāi)關(guān)，應(yīng)于24h-48h內(nèi)每隔12h定期通過(guò)觀察通道觀察每個(gè)孔中仍能活動(dòng)的水蚤數(shù)，測(cè)定0-100％大型蚤不活動(dòng)或死亡的濃度范圍，并記錄它們?nèi)魏尾徽５男袨?，通過(guò)對(duì)照試驗(yàn)首先來(lái)判斷待測(cè)液是否具有毒性，然后計(jì)算每個(gè)濃度中不活動(dòng)的試驗(yàn)蚤，包括死亡蚤，占試驗(yàn)總數(shù)的百分比，用概率單位目測(cè)法，計(jì)算EC50，也可用計(jì)算機(jī)EC50程序即寇氏修正法處理，獲得EC50。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒的有益效果體現(xiàn)在：由于該試劑盒是將優(yōu)選的大型溞卵直接孵化測(cè)定的，過(guò)程直接簡(jiǎn)單，有效的排除因?yàn)橥饨绛h(huán)境對(duì)溞卵生長(zhǎng)特性的影響，通過(guò)物理補(bǔ)光系統(tǒng)，可以?xún)?yōu)先判斷待測(cè)液的毒性，提高定性檢測(cè)效率，然后更進(jìn)一步的進(jìn)行定量檢測(cè)計(jì)算，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，應(yīng)用范圍廣，待測(cè)物質(zhì)不僅僅局限于水質(zhì)等其他液體，固體或不同狀態(tài)的物質(zhì)也可以使用。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明所述的一種用于大型蚤急性毒性檢測(cè)試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；
其中，1-包裝殼，2-觀察通道，3-加液通道，4-補(bǔ)光系統(tǒng)，5-試驗(yàn)組，6-對(duì)照組。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
為便于對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的理解，下面將結(jié)合附圖及具體實(shí)施例為例做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明，實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的限定。
實(shí)施例1：如圖1所示，一種用于大型蚤急性毒性檢測(cè)的試劑盒，主要包括：包裝殼1、觀察通道2、加液通道3、補(bǔ)光系統(tǒng)4、培養(yǎng)容器；觀察通道2是指白色的透光片，加液通道3是指漏斗形的加液管連接的管路，補(bǔ)光系統(tǒng)4是由發(fā)光裝置、導(dǎo)線(xiàn)、開(kāi)關(guān)、電池組成，培養(yǎng)容器分為兩組，對(duì)照組6和試驗(yàn)組5，每組包含稀釋水母液容器、餌料容器和大型溞卵容器；觀察通道2安裝在培養(yǎng)容器上方，補(bǔ)光系統(tǒng)4安裝在培養(yǎng)容器的下方，加液通道3分別連接對(duì)照組6和試驗(yàn)組5的培養(yǎng)容器。
試劑盒的制備方法主要包括以下步驟：
a.挑選適宜的大型溞幼蟲(chóng)進(jìn)行培養(yǎng)是指選用試驗(yàn)室條件下培養(yǎng)3代以上的、出生12h的發(fā)育好，運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)的幼蚤，然后在18℃室內(nèi)條件下，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)注入水，培養(yǎng)器皿內(nèi)的水可以循環(huán)流動(dòng)，給大型蚤培養(yǎng)器皿的水中加入微藻濃縮液，添加量為每100ml水添加2ml的微藻濃縮液，運(yùn)行循環(huán)水裝置10鐘，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)加入幼蚤，在蚤的生長(zhǎng)過(guò)程中每天運(yùn)行循環(huán)水裝置1小時(shí)，7日后，選擇體形較大、活動(dòng)能力強(qiáng)大型溞母體，然后進(jìn)行餌料喂養(yǎng)，餌料投放量為：每次30g/㎡，每天投喂3次，投喂時(shí)間為10天，然后使用分離裝置將成溞與幼溞進(jìn)行分離，將得到的成溞單獨(dú)在16℃的溫度下培養(yǎng)，觀察其產(chǎn)卵情況，并在24h內(nèi)收集所產(chǎn)的溞卵，將溞卵置入保存液放入大型溞卵容器，保存溞卵，備用；
保存液優(yōu)選為甘油，甘油濃度為25％，甘油能從空氣中吸收潮氣，也能吸收硫化氫、氰化氫和二氧化硫可以作為優(yōu)良的生物保存劑。
將成溞與幼溞進(jìn)行分離的分離裝置主要包括分離容器和分離篩網(wǎng)，分離篩網(wǎng)包括從下而上分別與分離容器的內(nèi)壁密封固定的下分離篩網(wǎng)和上分離篩網(wǎng)，下分離篩網(wǎng)為1500μm的聚乙烯篩網(wǎng)，第二分離篩網(wǎng)為1200μm的聚乙烯篩網(wǎng)，分別對(duì)應(yīng)兩個(gè)分離容器，上下兩個(gè)分離篩網(wǎng)之間安裝有多個(gè)固定裝置，可根據(jù)選擇的細(xì)度大小，從而增加或減小不同孔徑大小的分離篩網(wǎng)及對(duì)應(yīng)的分離容器的數(shù)量。
b.制備稀釋水母液、餌料：
稀釋水母液的配制方法為：選用電導(dǎo)率為10μs/cm(lms/m)以下的蒸餾水或去離子水，按下述方法配制：a.氯化鈣溶液是將1g氯化鈣(CaC12·2H2O)溶于水中稀釋至80ml，b.硫酸鎂溶液是將0.5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)溶于水中稀釋至100ml，c.碳酸氫鈉溶液是將0.1g碳酸氫鈉(NaHCO3)溶于水中稀釋至40ml，d.氯化鉀溶液是將2.5mg氧化鉀(KCI)溶于水中稀釋至100ml；各取以上四種溶液25mL分別裝入的稀釋水母液容器中，備用；
餌料是將小球藻經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后進(jìn)行脫水，離心，將收集到的小球藻冷凍干燥后按照常規(guī)工藝制備凍干粉，即得到所述的餌料，所述的餌料放入餌料容器中保存。
c.制備試劑盒盒體，并將觀察通道2、加液通道3、補(bǔ)光系統(tǒng)4、培養(yǎng)容器進(jìn)行生產(chǎn)組裝，即得到所述的用于大型蚤急性毒性檢測(cè)的試劑盒，容器及管路均選用無(wú)毒材料制成，耐高溫、耐腐蝕，每個(gè)組成部分都有明確的中英文標(biāo)記。
一種用于大型溞急性毒性檢測(cè)的試劑盒的使用方法為：
(1)取以上四種稀釋水母液25mL混合，稀釋至1L，必要時(shí)可用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使其穩(wěn)定在7.6，標(biāo)準(zhǔn)稀釋水應(yīng)容許大型蚤在其中生存至少48h，檢查稀釋水中不含有任何已知的對(duì)大型蚤有毒的物質(zhì)，例如：氯、重金屬、農(nóng)藥、氨或多氯聯(lián)苯等。
(2)將大型溞容器中的溞卵使用純凈水進(jìn)行沖洗，將保存液沖洗干凈；將沖洗干凈的大型蚤卵轉(zhuǎn)至孵化皿中，加入已配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水10ml，將試劑盒整體放入光照培養(yǎng)箱中，在18℃，6000LUX，72h的環(huán)境下進(jìn)行孵化；
(3)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果確定正式試驗(yàn)的濃度范圍，按幾何級(jí)數(shù)的濃度系列，即等比級(jí)數(shù)間距設(shè)計(jì)5個(gè)濃度；等比級(jí)系數(shù)不超過(guò)2.2，如1、2、4、8、16等比級(jí)系數(shù)為2，最高濃度處理組抑制或死亡率為100％，最低濃度處理組抑制或死亡率為0，系列濃度中以能出現(xiàn)一個(gè)大型蚤運(yùn)動(dòng)抑制率在40％的濃度最為理想。
(4)給培養(yǎng)容器中滴加待測(cè)液，平均每蚤的待測(cè)液不低于2mL，每個(gè)濃度至少有4個(gè)平行，對(duì)照組6內(nèi)裝相等體積的稀釋水，試驗(yàn)開(kāi)始后，打開(kāi)補(bǔ)光系統(tǒng)4開(kāi)關(guān)，應(yīng)于24h內(nèi)每隔12h定期通過(guò)觀察通道2觀察每個(gè)孔中仍能活動(dòng)的水蚤數(shù)，測(cè)定大型蚤不活動(dòng)或死亡的濃度范圍，并記錄它們?nèi)魏尾徽５男袨?，通過(guò)對(duì)照試驗(yàn)首先來(lái)判斷待測(cè)液是否具有毒性，然后計(jì)算每個(gè)濃度中不活動(dòng)的試驗(yàn)蚤，包括死亡蚤，占試驗(yàn)總數(shù)的百分比，用概率單位目測(cè)法，計(jì)算EC50，也可用計(jì)算機(jī)EC50程序即寇氏修正法處理，獲得EC50。
實(shí)施例2：如圖1所示，一種用于大型蚤急性毒性檢測(cè)的試劑盒，主要包括：包裝殼1、觀察通道2、加液通道3、補(bǔ)光系統(tǒng)4、培養(yǎng)容器；觀察通道2是指白色的透光片，加液通道3是指漏斗形的加液管連接的管路，補(bǔ)光系統(tǒng)4是由發(fā)光裝置、導(dǎo)線(xiàn)、開(kāi)關(guān)、電池組成，培養(yǎng)容器分為兩組，對(duì)照組6和試驗(yàn)組5，每組包含稀釋水母液容器、餌料容器和大型溞卵容器；觀察通道2安裝在培養(yǎng)容器上方，補(bǔ)光系統(tǒng)4安裝在培養(yǎng)容器的下方，加液通道3分別連接對(duì)照組6和試驗(yàn)組5的培養(yǎng)容器。
試劑盒的制備方法主要包括以下步驟：
a.挑選適宜的大型溞幼蟲(chóng)進(jìn)行培養(yǎng)是指選用試驗(yàn)室條件下培養(yǎng)3代以上的、出生18h的發(fā)育好，運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)的幼蚤，然后在20℃室內(nèi)條件下，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)注入水，培養(yǎng)器皿內(nèi)的水可以循環(huán)流動(dòng)，給大型蚤培養(yǎng)器皿的水中加入微藻濃縮液，添加量為每100ml水添加3.5ml的微藻濃縮液，運(yùn)行循環(huán)水裝置20鐘，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)加入幼蚤，在蚤的生長(zhǎng)過(guò)程中每天運(yùn)行循環(huán)水裝置1小時(shí)，8日后，選擇體形較大、活動(dòng)能力強(qiáng)大型溞母體，然后進(jìn)行餌料喂養(yǎng)，餌料投放量為：每次40g/㎡，每天投喂4次，投喂時(shí)間為13天，然后使用分離裝置將成溞與幼溞進(jìn)行分離，將得到的成溞單獨(dú)在18℃的溫度下培養(yǎng)，觀察其產(chǎn)卵情況，并在36h內(nèi)收集所產(chǎn)的溞卵，將溞卵置入保存液放入大型溞卵容器，保存溞卵，備用；
保存液優(yōu)選為甘油，甘油濃度為37.5％，甘油能從空氣中吸收潮氣，也能吸收硫化氫、氰化氫和二氧化硫可以作為優(yōu)良的生物保存劑。
將成溞與幼溞進(jìn)行分離的分離裝置主要包括分離容器和分離篩網(wǎng)，分離篩網(wǎng)包括從下而上分別與分離容器的內(nèi)壁密封固定的下分離篩網(wǎng)和上分離篩網(wǎng)，所述的下分離篩網(wǎng)為1500μm的聚乙烯篩網(wǎng)，第二分離篩網(wǎng)為1200μm的聚乙烯篩網(wǎng)，分別對(duì)應(yīng)兩個(gè)分離容器，上下兩個(gè)分離篩網(wǎng)之間安裝有多個(gè)固定裝置，可根據(jù)選擇的細(xì)度大小，從而增加或減小不同孔徑大小的分離篩網(wǎng)及對(duì)應(yīng)的分離容器的數(shù)量。
b.制備稀釋水母液、餌料：
稀釋水母液的配制方法為：選用電導(dǎo)率為10μs/cm(lms/m)以下的蒸餾水或去離子水，按下述方法配制：a.氯化鈣溶液是將1g氯化鈣(CaC12·2H2O)溶于水中稀釋至80ml，b.硫酸鎂溶液是將0.5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)溶于水中稀釋至100ml，c.碳酸氫鈉溶液是將0.1g碳酸氫鈉(NaHCO3)溶于水中稀釋至40ml，d.氯化鉀溶液是將2.5mg氧化鉀(KCI)溶于水中稀釋至100ml；各取以上四種溶液25mL分別裝入的稀釋水母液容器中，備用。
餌料是將小球藻經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后進(jìn)行脫水，離心，將收集到的小球藻冷凍干燥后按照常規(guī)工藝制備凍干粉，即得到餌料，餌料放入餌料容器中保存。
c.制備試劑盒盒體，并將觀察通道2、加液通道3、補(bǔ)光系統(tǒng)4、培養(yǎng)容器進(jìn)行生產(chǎn)組裝，即得到所述的用于大型蚤急性毒性檢測(cè)的試劑盒，容器及管路均選用無(wú)毒材料制成，耐高溫、耐腐蝕，每個(gè)組成部分都有明確的中英文標(biāo)記。
一種用于大型溞急性毒性檢測(cè)的試劑盒的使用方法為：
(1)取以上四種稀釋水母液25mL混合，稀釋至1L，必要時(shí)可用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使其穩(wěn)定在7.8，標(biāo)準(zhǔn)稀釋水應(yīng)容許大型蚤在其中生存至少48h，檢查稀釋水中不含有任何已知的對(duì)大型蚤有毒的物質(zhì)，例如：氯、重金屬、農(nóng)藥、氨或多氯聯(lián)苯等。
(2)將大型溞容器中的溞卵使用純凈水進(jìn)行沖洗，將保存液沖洗干凈；將沖洗干凈的大型蚤卵轉(zhuǎn)至孵化皿中，加入已配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水15ml，將試劑盒整體放入光照培養(yǎng)箱中，在22℃，6000LUX，72h的環(huán)境下進(jìn)行孵化；
(3)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果確定正式試驗(yàn)的濃度范圍，按幾何級(jí)數(shù)的濃度系列，即等比級(jí)數(shù)間距設(shè)計(jì)6個(gè)濃度；等比級(jí)系數(shù)不超過(guò)2.2，如1、2、4、8、16、32等比級(jí)系數(shù)為2，最高濃度處理組抑制或死亡率為100％，最低濃度處理組抑制或死亡率為0，系列濃度中以能出現(xiàn)一個(gè)大型蚤運(yùn)動(dòng)抑制率在50％的濃度最為理想。
(4)給培養(yǎng)容器中滴加待測(cè)液，平均每蚤的待測(cè)液不低于2mL，每個(gè)濃度至少有5個(gè)平行，對(duì)照組6內(nèi)裝相等體積的稀釋水，試驗(yàn)開(kāi)始后，打開(kāi)補(bǔ)光系統(tǒng)4開(kāi)關(guān)，應(yīng)于36h內(nèi)每隔12h定期通過(guò)觀察通道2觀察每個(gè)孔中仍能活動(dòng)的水蚤數(shù)，測(cè)定大型蚤不活動(dòng)或死亡的濃度范圍，并記錄它們?nèi)魏尾徽５男袨椋ㄟ^(guò)對(duì)照試驗(yàn)首先來(lái)判斷待測(cè)液是否具有毒性，然后計(jì)算每個(gè)濃度中不活動(dòng)的試驗(yàn)蚤，包括死亡蚤，占試驗(yàn)總數(shù)的百分比，用概率單位目測(cè)法，計(jì)算EC50，也可用計(jì)算機(jī)EC50程序即寇氏修正法處理，獲得EC50。
實(shí)施例3：如圖1所示，一種用于大型蚤急性毒性檢測(cè)的試劑盒，試劑盒主要包括：包裝殼1、觀察通道2、加液通道3、補(bǔ)光系統(tǒng)4、培養(yǎng)容器；觀察通道2是指白色的透光片，加液通道3是指漏斗形的加液管連接的管路，補(bǔ)光系統(tǒng)4是由發(fā)光裝置、導(dǎo)線(xiàn)、開(kāi)關(guān)、電池組成，培養(yǎng)容器分為兩組，對(duì)照組6和試驗(yàn)組5，每組包含稀釋水母液容器、餌料容器和大型溞卵容器；觀察通道2安裝在培養(yǎng)容器上方，補(bǔ)光系統(tǒng)4安裝在培養(yǎng)容器的下方，加液通道3分別連接對(duì)照組6和試驗(yàn)組5的培養(yǎng)容器。
試劑盒的制備方法主要包括以下步驟：
a.挑選適宜的大型溞幼蟲(chóng)進(jìn)行培養(yǎng)是指選用試驗(yàn)室條件下培養(yǎng)3代以上的、出生24h的發(fā)育好，運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)的幼蚤，然后在22℃室內(nèi)條件下，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)注入水，培養(yǎng)器皿內(nèi)的水可以循環(huán)流動(dòng)，給大型蚤培養(yǎng)器皿的水中加入微藻濃縮液，添加量為每100ml水添加5ml的微藻濃縮液，運(yùn)行循環(huán)水裝置30鐘，向大型蚤培養(yǎng)器皿內(nèi)加入幼蚤，在蚤的生長(zhǎng)過(guò)程中每天運(yùn)行循環(huán)水裝置1小時(shí)，10日后，選擇體形較大、活動(dòng)能力強(qiáng)大型溞母體，然后進(jìn)行餌料喂養(yǎng)，餌料投放量為：每次50g/㎡，每天投喂5次，投喂時(shí)間為15天，然后使用分離裝置將成溞與幼溞進(jìn)行分離，將得到的成溞單獨(dú)在20℃的溫度下培養(yǎng)，觀察其產(chǎn)卵情況，并在48h內(nèi)收集所產(chǎn)的溞卵，將溞卵置入保存液放入大型溞卵容器，保存溞卵，備用；
保存液優(yōu)選為甘油，甘油濃度為50％，甘油能從空氣中吸收潮氣，也能吸收硫化氫、氰化氫和二氧化硫可以作為優(yōu)良的生物保存劑。
將成溞與幼溞進(jìn)行分離的分離裝置主要包括分離容器和分離篩網(wǎng)，分離篩網(wǎng)包括從下而上分別與分離容器的內(nèi)壁密封固定的下分離篩網(wǎng)和上分離篩網(wǎng)，下分離篩網(wǎng)為1500μm的聚乙烯篩網(wǎng)，第二分離篩網(wǎng)為1200μm的聚乙烯篩網(wǎng)，分別對(duì)應(yīng)兩個(gè)分離容器，上下兩個(gè)分離篩網(wǎng)之間安裝有多個(gè)固定裝置，可根據(jù)選擇的細(xì)度大小，從而增加或減小不同孔徑大小的分離篩網(wǎng)及對(duì)應(yīng)的分離容器的數(shù)量。
b.制備稀釋水母液、餌料:
稀釋水母液的配制方法為：選用電導(dǎo)率為10μs/cm(lms/m)以下的蒸餾水或去離子水，按下述方法配制：a.氯化鈣溶液是將1g氯化鈣(CaC12·2H2O)溶于水中稀釋至80ml，b.硫酸鎂溶液是將0.5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)溶于水中稀釋至100ml，c.碳酸氫鈉溶液是將0.1g碳酸氫鈉(NaHCO3)溶于水中稀釋至40ml，d.氯化鉀溶液是將2.5mg氧化鉀(KCI)溶于水中稀釋至100ml；各取以上四種溶液25mL分別裝入的稀釋水母液容器中，備用。
餌料是將小球藻經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后進(jìn)行脫水，離心，將收集到的小球藻冷凍干燥后按照常規(guī)工藝制備凍干粉，即得到所述的餌料，餌料放入餌料容器中保存。
c.制備試劑盒盒體，并將觀察通道2、加液通道3、補(bǔ)光系統(tǒng)4、培養(yǎng)容器進(jìn)行生產(chǎn)組裝，即得到所述的用于大型蚤急性毒性檢測(cè)的試劑盒，容器及管路均選用無(wú)毒材料制成，耐高溫、耐腐蝕，每個(gè)組成部分都有明確的中英文標(biāo)記。
一種用于大型溞急性毒性檢測(cè)的試劑盒的使用方法為：
(1)取以上四種稀釋水母液25mL混合，稀釋至1L，必要時(shí)可用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使其穩(wěn)定在8.0，標(biāo)準(zhǔn)稀釋水應(yīng)容許大型蚤在其中生存至少48h，檢查稀釋水中不含有任何已知的對(duì)大型蚤有毒的物質(zhì)，例如：氯、重金屬、農(nóng)藥、氨或多氯聯(lián)苯等。
(2)將大型溞容器中的溞卵使用純凈水進(jìn)行沖洗，將保存液沖洗干凈；將沖洗干凈的大型蚤卵轉(zhuǎn)至孵化皿中，加入已配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水20ml，將試劑盒整體放入光照培養(yǎng)箱中，在25℃，6000LUX，72h的環(huán)境下進(jìn)行孵化；
(3)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果確定正式試驗(yàn)的濃度范圍，按幾何級(jí)數(shù)的濃度系列，即等比級(jí)數(shù)間距設(shè)計(jì)7個(gè)濃度；等比級(jí)系數(shù)不超過(guò)2.2，如1、2、4、8、16等比級(jí)系數(shù)為2，最高濃度處理組抑制或死亡率為100％，最低濃度處理組抑制或死亡率為0，系列濃度中以能出現(xiàn)一個(gè)大型蚤運(yùn)動(dòng)抑制率在60％的濃度最為理想。
(4)給培養(yǎng)容器中滴加待測(cè)液，平均每蚤的待測(cè)液不低于2mL，每個(gè)濃度至少有6個(gè)平行，對(duì)照組6內(nèi)裝相等體積的稀釋水，試驗(yàn)開(kāi)始后，打開(kāi)補(bǔ)光系統(tǒng)4開(kāi)關(guān)，應(yīng)于48h內(nèi)每隔12h定期通過(guò)觀察通道2觀察每個(gè)孔中仍能活動(dòng)的水蚤數(shù)，測(cè)定大型蚤不活動(dòng)或死亡的濃度范圍，并記錄它們?nèi)魏尾徽５男袨?，通過(guò)對(duì)照試驗(yàn)首先來(lái)判斷待測(cè)液是否具有毒性，然后計(jì)算每個(gè)濃度中不活動(dòng)的試驗(yàn)蚤，包括死亡蚤，占試驗(yàn)總數(shù)的百分比，用概率單位目測(cè)法，計(jì)算EC50，也可用計(jì)算機(jī)EC50程序即寇氏修正法處理，獲得EC50。
最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。