本發(fā)明屬于液相色譜分離代謝小分子的方法領(lǐng)域，特別涉及一種液相色譜法測定類胡蘿卜素的流動相配方及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

類胡蘿卜素作為小分子特殊代謝物，可有效清除自由基、有顯著的抗氧化、提高人體免疫力、延緩衰老、防癌抗癌等保護人類健康具有積極重要的作用。由于人體自身不能合成該類物質(zhì)，補充人工合成的此類物質(zhì)對防病抗癌沒有效果，所以從自然界食物中攝取成為了唯一必然的獲得方式。食物中分布的類胡蘿卜素主要有葉黃素、玉米黃素、α-隱黃素、β-隱黃素、α-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、(6R)-δ-胡蘿卜素、ε-胡蘿卜素等，而高效液相色譜法具有分離效能高，分析速度快，成本低廉等優(yōu)點，是應(yīng)用最廣最適用于食物中此類物質(zhì)的分離測定方法。類胡蘿卜素物質(zhì)之間有些化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似，有些為同分異構(gòu)體，所以同時將這類物質(zhì)在C18柱上分離比較困難，而C30柱的出現(xiàn)為此提供了新的分離方法。目前，使用C30柱液相色譜法多為分離單一或少數(shù)幾種類胡蘿卜素的測定方法，同時測定五種或以上多種的方法中，常會出現(xiàn)峰型不好，峰分不開，相對偏差大，響應(yīng)值低等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種液相色譜法測定類胡蘿卜素的流動相配方。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述液相色譜法測定類胡蘿卜素的流動相配方的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種液相色譜法測定類胡蘿卜素的流動相配方，包括以下體積百分比的成份：

A1相：90％～100％甲醇-水；

B1相：90％～100％叔丁基甲醚-甲醇(又名甲基叔丁基醚，簡稱MTBE)。

進一步的改進在于：包括以下質(zhì)量或體積百分比的成份：

A相：90％A2相+10％B2相；

B相：10％A2相+90％B2相。

其中，

A2相：90％～100％甲醇-水，含有0～0.5M乙酸銨和0～0.5％(W/V)2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(簡稱BHT)；

B2相：90％～100％叔丁基甲醚-甲醇，含有0～0.5％(W/V)BHT。

優(yōu)選地，

A2相：97％甲醇-水，含有0～0.1M乙酸銨和0～0.15％(W/V)2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(簡稱BHT)；

B2相：100％MTBE，含有0～0.2％(W/V)BHT。

更優(yōu)選的，

A2相：97％甲醇-水，含有0.05M乙酸銨和0.1％(W/V)2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(簡稱BHT)；

B2相：100％MTBE，含有0.1％(W/V)BHT。

所述的類胡蘿卜素為葉黃素(Lutein)、玉米黃素(Zeaxanthin)、α-隱黃素(α-Cryptoxanthin)、β-隱黃素(β-Cryptoxanthin)、ε-胡蘿卜素(ε-carotene)、α-胡蘿卜素(α-carotene)、β-胡蘿卜素(β-carotene)、(6R)-δ-胡蘿卜素((6R)-δ-carotene)、γ-胡蘿卜素(γ-carotene)和番茄紅素(Lycopene)。

所述的液相色譜法測定類胡蘿卜素的流動相配方的制備方法，包括如下步驟：

步驟一：配制A2相：分別量取甲醇和/或超純水，在容器藍(lán)蓋瓶中混勻；稱量乙酸銨(LC/MS級)和BHT(LC/MS級)，混合溶解；

步驟二：配制B2相：量取MTBE(HPLC級)和/或甲醇，稱量BHT(LC/MS級)至MTBE中，混合溶解；

步驟三：將A2相和B2相同時進行超聲處理；

步驟四：將步驟三中脫氣后的A2和B2分別按照體積比9:1和1:9配制得到A相和B相，用于高效液相色譜分析測試。

具體的，包括如下步驟：

步驟一：配制A2相：使用量筒分別量取HPLC級別的甲醇和超純水，在容器藍(lán)蓋瓶中混勻；使用萬分之一天平稱量乙酸銨(LC/MS級)和BHT(LC/MS級)至該容器瓶中，混合溶解；

步驟二：配制B2相：使用量筒量取MTBE(HPLC級)至容器藍(lán)蓋瓶中；使用萬分之一天平稱量BHT(LC/MS級)至該容器瓶中，混合溶解；

步驟三：將A2相和B2相同時放在超聲波清洗機中，超聲15min；

步驟四：將步驟三中脫氣后的A2和B2分別按照體積比9:1和1:9配制得到A相和B相，用于高效液相色譜分析測試。

所述的液相色譜法測定類胡蘿卜素的流動相配方在液相色譜中的應(yīng)用。

所述的流動相配方的梯度洗脫程序：0→10min，A相90％→60％，B相10％→40％；10→20min，A相60％→50％，B相40％→50％；20→25min，A相50％→10％，B相50％→90％；25→29min，A相10％→10％，B相90％→90％；29→29.5min，A相10％→90％，B相90％→10％；29.5→40min，A相90％→90％，B相10％→10％。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：

本發(fā)明提供的一種液相色譜法測定類胡蘿卜素的流動相配方，可以簡單，快速(整個過程可在40min之內(nèi)完成)，準(zhǔn)確，并可以得到各組份獨立，峰型好，線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率高，相對偏差小的7～10種類胡蘿卜素色譜圖和測試結(jié)果。

附圖說明

圖1是在高效液相色譜儀測定類胡蘿卜素方法中，使用A1和B1配方作為流動相的色譜圖。

圖2是在高效液相色譜儀測定類胡蘿卜素方法中，使用A和B配方作為流動相的色譜圖。

1：葉黃素(Lutein)；2：玉米黃素(Zeaxanthin)；3：α-隱黃素(α-Cryptoxanthin)；4：β-隱黃素(β-Cryptoxanthin)；5：ε-胡蘿卜素(ε-carotene)；6：α-胡蘿卜素(α-carotene)；7：β-胡蘿卜素(β-carotene)；8：(6R)-δ-胡蘿卜素((6R)-δ-carotene)；9：γ-胡蘿卜素(γ-carotene)；10：番茄紅素(Lycopene)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1：

1.試劑和儀器

1.1試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：葉黃素(Lutein)、玉米黃素(Zeaxanthin)、α-隱黃素(α-Cryptoxanthin)、β-隱黃素(β-Cryptoxanthin)、α-胡蘿卜素(α-carotene)，β-胡蘿卜素(β-carotene)、γ-胡蘿卜素(γ-carotene)、(6R)-δ-胡蘿卜素((6R)-δ-carotene)、ε-胡蘿卜素(ε-carotene)、番茄紅素(Lycopene)均購自Sigma公司；甲醇，乙醇和叔丁基甲醚(MTBE)為色譜純試劑；乙酸銨和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)均為質(zhì)譜級純試劑；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2儀器

美國DIONEX UltiMate 3000高效液相色譜工作站，配備HPG-3200RS二元梯度泵、TCC-3000RS柱溫箱，WPS-3000TFC自動進樣器、DAD-3000RS二極管陣列檢測器和Chromelein6.8分析軟件；CPA224S型萬分之一天平，德國Sartorius；SB5200DTS型超聲波清洗機，寧波新芝。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量的葉黃素(Lutein)、玉米黃素(Zeaxanthin)、α-隱黃素(α-Cryptoxanthin)、β-隱黃素(β-Cryptoxanthin)、α-胡蘿卜素(α-carotene)、β-胡蘿卜素(β-carotene)、γ-胡蘿卜素(γ-carotene)、(6R)-δ-胡蘿卜素((6R)-δ-carotene)、ε-胡蘿卜素(ε-carotene)、番茄紅素(Lycopene)固體標(biāo)準(zhǔn)品，分別用乙醇溶解，配制成單個1mg/mL的單標(biāo)和80μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于-20℃下避光保存。分析測試前，再使用50％MTBE-甲醇逐級稀釋至20、10、5、2.5、2、1、0.5μg/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4色譜條件

色譜條件為：YMC Carotenoid C30(250*4.5mm，5μm)色譜柱，流動相為A相和B相，柱溫25℃，紫外檢測波長450nm，流速1mL/min，進樣體積10μL。梯度洗脫程序：0→10min，A相90％→60％，B相10％→40％；10→20min，A相60％→50％，B相40％→50％；20→25min，A相50％→10％，B相50％→90％；25→29min，A相10％→10％，B相90％→90％；29→29.5min，A相10％→90％，B相90％→10％；29.5→40min，A相90％→90％，B相10％→10％。

1.5測定指標(biāo)

1.5.1線性關(guān)系、檢出限及定量限

按照1.4色譜條件，使用A和B流動相配方(A相：90％A2相+10％B2相；B相：10％A2相+90％B2相。其中，A2相：97％甲醇-水，含有0.05M乙酸銨和0.1％(W/V)BHT；B2相：100％MTBE，含有0.1％(W/V)BHT)，測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。以各待測物濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積y為終坐標(biāo)進行線性回歸分析，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。同時，以10種類胡蘿卜素特征色譜峰的信噪比(S/N)≥3時為該方法的檢出限，S/N≥10時為該方法的定量限，結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示本發(fā)明配方在0.5～20μg/mL范圍內(nèi)，10種類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R²)均大于0.995；檢出限和定量限分別為0.01～1.6μg/mL、0.2～4.0μg/mL，說明在液相色譜方法中使用該發(fā)明配方確實可行、靈敏度高，可以滿足10種類胡蘿卜同時測定的要求。

使用A和B配方作為流動相的色譜圖，如圖2所示。從圖2中可以看出，當(dāng)檢測波長為450nm時對標(biāo)準(zhǔn)品分析發(fā)現(xiàn)，10種類胡蘿卜素的出峰時間為葉黃素(Lutein)＜玉米黃素(Zeaxanthin)＜α-隱黃素(α-Cryptoxanthin)＜β-隱黃素(β-Cryptoxanthin)＜ε-胡蘿卜素(ε-carotene)＜α-胡蘿卜素(α-carotene)＜β-胡蘿卜素(β-carotene)＜(6R)-δ-胡蘿卜素((6R)-δ-carotene)＜γ-胡蘿卜素(γ-carotene)＜番茄紅素(Lycopene)，10種不同組分的保留時間分別約為8.25，9.103，11.41，12.66，13.987，15.41，17.067，23.767，25.653和29.223min。10種樣品通過高效液相色譜同時檢查可在40min內(nèi)完成。

表1：10種類胡蘿卜素保留時間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

1.5.2加標(biāo)回收率和精密度

取已知濃度的10種類胡蘿卜素的單標(biāo)樣品標(biāo)準(zhǔn)液，分別按照低、中、高3個濃度(0.5、3、8μg/mL)三種濃度添加，每個處理樣品濃度平行重復(fù)測定三次，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，10種類胡蘿卜素的平均回收率在96.29～104.47％之間，其相對偏差(RSD)為0.03～1.24％。由此可知，在高效液相色譜儀方法測定類胡蘿卜素中，使用該配方作為流動相，無論是回收率還是精密度均能符合檢測要求，且具有較好的重復(fù)性和較高的準(zhǔn)確度。

表2回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在高效液相色譜儀測定類胡蘿卜素方法中，使用A1和B1配方作為流動相的色譜圖，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，當(dāng)檢測波長為450nm時對標(biāo)準(zhǔn)品分析發(fā)現(xiàn)，10種類胡蘿卜素組分出峰時間為葉黃素(Lutein)玉米黃素(Zeaxanthin)＜α-隱黃素(α-Cryptoxanthin)＜β-隱黃素(β-Cryptoxanthin)＜(6R)-δ-胡蘿卜素((6R)-δ-carotene)＜γ-胡蘿卜素(γ-carotene)＜番茄紅素(Lycopene)，只可以測定出7種組分。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。