本發(fā)明屬于藥物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢測方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目前，檢測阿苯達(dá)唑的方法中使用乙醚、乙腈等毒性大的溶劑，或者直接使用乙腈提取，這些方法不僅使樣品提取不充分，而且目標(biāo)化合物在提取過程中極易遭到破壞，從而影響定量結(jié)果。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢測方法，利用2，6-二叔丁基對甲酚和NaOH提取樣品中的阿苯達(dá)唑及其代謝物，之后使用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測；所述2，6-二叔丁基對甲酚的濃度為1％；所述NaOH溶液的濃度為50％。在上述方案的基礎(chǔ)上，所述阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢測方法步驟如下：1)提取純化稱取樣品5.00g，加入5mL水、150μL50％NaOH溶液和1mL1％2，6-二叔丁基對甲酚，渦旋混合，再加入20mL乙酸乙酯，振蕩1min超聲提取20min，4000r/min離心5min，取上清液，向殘渣中加入10mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次上清液于梨形瓶中，40℃旋蒸至干；向旋干后的梨形瓶中加入6mL乙腈飽和正己烷，振蕩混勻，倒入離心管中，再向梨形瓶中加入2mL乙腈，渦旋超聲1min后一并倒入離心管中，向離心管中加入6mL0.1mol/L的鹽酸溶液，渦旋2min，4000r/min離心5min，除去正己烷層，備用；若乳化，超聲并用吸管攪拌后離心；2)凈化柱凈化用5mL甲醇和5mL水平衡活化PCX固相萃取柱后，取提取液過PCX凈化柱，分別用3mL水和3mL甲醇淋洗，然后用15mL體積濃度為5％氨水甲醇溶液洗脫，接收的洗脫液于40℃旋蒸至干后；分別加入1mL甲醇和1mL水，渦旋，過0.22μm尼龍濾膜，待測；3)高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測質(zhì)譜參數(shù)：離子源AJSESI源；GasTemp：325℃；GasFlow：10L/min；SheathGasTemp350℃；SheathGasflow：11L/min；液相參數(shù)：A為0.1％甲酸水溶液，B為甲醇。在上述方案的基礎(chǔ)上，所述阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢測方法應(yīng)用于檢測動物源性食品中的阿苯達(dá)唑及其代謝物。在上述方案的基礎(chǔ)上，所述動物源性食品為肌肉、蛋類、乳類、肝臟和腎臟。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明方法中用2，6-二叔丁基對甲酚和NaOH提取阿苯達(dá)唑及其代謝物，毒性較??；此外，阿苯達(dá)唑及其代謝物在水溶液中呈堿性，加入質(zhì)量濃度為50％NaOH水溶液可使阿苯達(dá)唑及其代謝物成分子狀態(tài)，利于有機(jī)試劑提??；加入質(zhì)量濃度為1％2，6-二叔丁基對甲酚可以保護(hù)阿苯達(dá)唑不被氧化；乙酸乙酯為弱極性的有機(jī)試劑，其加入有利于阿苯達(dá)唑的提取且雜質(zhì)提取的少；乙腈飽和正己烷用來去除樣品中的油脂類雜質(zhì)，加入鹽酸可使阿苯達(dá)唑成離子狀態(tài)有利于PCX凈化柱凈化；5％氨水甲醇呈強(qiáng)堿性，洗脫時可將PCX凈化柱吸附的阿苯達(dá)唑置換下來。本發(fā)明的方法檢測范圍較廣，相比于其他方法的單一基質(zhì)，本方法不僅僅適用于動物肌肉而且也適用于肝臟等復(fù)雜基質(zhì)的檢測，眾所周知，動物肝臟含有很多蛋白、脂肪、糖類、維生素和礦物質(zhì)，凈化不干凈對目標(biāo)化合物回收影響很大；本發(fā)明的方法使用2，6-二叔丁基對甲酚、NaOH和乙酸乙酯作為提取液，毒性小，成本低，節(jié)約時間，又能有效地減少對雜質(zhì)的提取，簡化凈化步驟；本方法采用安捷倫PCX固相萃取小柱，也可用國產(chǎn)PCX小柱代替，有效降低檢測成本；采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測，相比于單一的高效液相色譜，具有靈敏度高，重復(fù)性好，檢測限低的優(yōu)勢。附圖說明圖1阿苯達(dá)唑-2-氨基砜保留時間的測定，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間。圖2阿苯達(dá)唑-2-氨基砜定量定性離子明細(xì)，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間。圖3阿苯達(dá)唑-2-氨基砜質(zhì)譜圖，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為m/z。圖4阿苯達(dá)唑亞砜保留時間的測定，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間。圖5阿苯達(dá)唑亞砜定量定性離子明細(xì)，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間。圖6阿苯達(dá)唑亞砜質(zhì)譜圖，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為m/z。圖7阿苯達(dá)唑砜保留時間的測定，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間。圖8阿苯達(dá)唑砜定量定性離子明細(xì)，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間。圖9阿苯達(dá)唑砜質(zhì)譜圖，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為m/z。圖10阿苯達(dá)唑保留時間的測定，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間。圖11阿苯達(dá)唑定量定性離子明細(xì)，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間。圖12阿苯達(dá)唑質(zhì)譜圖，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為m/z。圖13阿苯達(dá)唑-2-氨基砜的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)為峰面積響應(yīng)，橫坐標(biāo)為阿苯達(dá)唑-2-氨基砜濃度。圖14阿苯達(dá)唑亞砜的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)為峰面積響應(yīng)，橫坐標(biāo)為阿苯達(dá)唑亞砜濃度。圖15阿苯達(dá)唑砜的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)為峰面積響應(yīng)，橫坐標(biāo)為阿苯達(dá)唑砜濃度。圖16阿苯達(dá)唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)為峰面積響應(yīng)，橫坐標(biāo)為阿苯達(dá)唑濃度。圖17阿苯達(dá)唑及其代謝物定量離子S/N圖，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間，從上到下依次為阿苯達(dá)唑-2-氨基砜、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑。具體實施方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)的描述本發(fā)明。以下實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制1.1儲備液的配制分別稱量10.00mg阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜、阿苯達(dá)唑亞砜和阿苯達(dá)唑砜的標(biāo)準(zhǔn)品，溶解到甲醇中，定容到10mL，作為1000mg/L的儲備液(置于-18℃冷藏保存)。1.2標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制分別準(zhǔn)確量取1mL阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜、阿苯達(dá)唑亞砜和阿苯達(dá)唑砜標(biāo)準(zhǔn)品的儲備液，溶解到甲醇中，定容到10mL，作為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液(置于-18℃冷藏保存)。1.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制用標(biāo)準(zhǔn)中間液配制成1、5、10、20、50、100μg/L的標(biāo)液(用甲醇+水(v/v＝1:1)定容)，作為工作曲線用的標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.樣品處理2.1提取純化稱取樣品5.00g，加入5mL水、150μL50％NaOH溶液和1mL1％2，6-二叔丁基對甲酚，渦旋混合，再加入20mL乙酸乙酯，振蕩1min超聲提取20min，4000r/min離心5min，取上清液，向殘渣中加入10mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次上清液于梨形瓶中，40℃旋蒸至干；向旋干后的梨形瓶中加入6mL乙腈飽和正己烷，振蕩混勻，倒入離心管中，再向梨形瓶中加入2mL乙腈，渦旋超聲1min后一并倒入離心管中，向離心管中加入6mL0.1mol/L的鹽酸溶液，渦旋2min，4000r/min離心5min，除去正己烷層，備用；若乳化，超聲并用吸管攪拌后離心；2.2凈化柱凈化用5mL甲醇和5mL水平衡活化PCX固相萃取柱后，取提取液過PCX凈化柱，分別用3mL水和3mL甲醇淋洗，然后用15mL體積濃度為5％氨水甲醇溶液洗脫，接收的洗脫液于40℃旋蒸至干后；分別加入1mL甲醇和1mL水，渦旋，過0.22μm尼龍濾膜，待測；3.高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測使用的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀為AgilentLC-MSMS1290/6460；質(zhì)譜參數(shù)：離子源AJSESI源；GasTemp：325℃；GasFlow：10L/min；SheathGasTemp350℃；SheathGasflow：11L/min。液相參數(shù)：A為0.1％甲酸水溶液，B為甲醇。流動相梯度如表1所示：表1流動相梯度時間甲醇濃度1.00202.001004.001004.01205.5204.結(jié)果及分析4.1質(zhì)譜結(jié)果阿苯達(dá)唑及其代謝物的質(zhì)譜結(jié)果如表2所示：表2質(zhì)譜結(jié)果4.2專屬性4.2.1阿苯達(dá)唑-2-氨基砜的專屬性50ppb阿苯達(dá)唑-2-氨基砜通過C18色譜柱分離，確定保留時間。如圖1所示，保留時間約為2.4min，且色譜的峰形較佳，無干擾峰出現(xiàn)，其中橫坐標(biāo)為保留時間，縱坐標(biāo)為響應(yīng)。阿苯達(dá)唑-2-氨基砜定量定性離子明細(xì)如圖2所示，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間。如圖3所示，1ppm阿苯達(dá)唑-2-氨基砜上機(jī)，通過質(zhì)譜優(yōu)化得到3個離子對，縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為m/z。4.2.2阿苯達(dá)唑亞砜的專屬性50ppb阿苯達(dá)唑亞砜通過C18色譜柱分離，確定保留時間。如圖4所示，保留時間約為2.9min，且色譜的峰形較佳，無干擾峰出現(xiàn)，其中橫坐標(biāo)為保留時間，縱坐標(biāo)為響應(yīng)。阿苯達(dá)唑亞砜定量定性離子明細(xì)如圖5所示，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間。如圖6所示，1ppm阿苯達(dá)唑亞砜上機(jī)，通過質(zhì)譜優(yōu)化得到3個離子對，縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為m/z。4.2.3阿苯達(dá)唑砜的專屬性50ppb阿苯達(dá)唑砜通過C18色譜柱分離，確定保留時間。如圖7所示，保留時間約為2.9min，且色譜的峰形較佳，無干擾峰出現(xiàn)。其中橫坐標(biāo)為保留時間，縱坐標(biāo)為響應(yīng)。阿苯達(dá)唑砜定量定性離子明細(xì)如圖8所示，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間。如圖9所示，1ppm阿苯達(dá)唑砜上機(jī)，通過質(zhì)譜優(yōu)化得到3個離子對，縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為m/z。4.2.4阿苯達(dá)唑的專屬性50ppb阿苯達(dá)唑砜通過C18色譜柱分離，確定保留時間。如圖10所示，保留時間約為3.159min，且色譜的峰形較佳，無干擾峰出現(xiàn)，橫坐標(biāo)為保留時間，縱坐標(biāo)為響應(yīng)。阿苯達(dá)唑定量定性離子明細(xì)如圖11所示，其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為保留時間。如圖12所示，1ppm阿苯達(dá)唑上機(jī)，通過質(zhì)譜優(yōu)化各得到3個離子對，縱坐標(biāo)為響應(yīng)，橫坐標(biāo)為m/z。4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線4.3.1阿苯達(dá)唑-2-氨基砜的標(biāo)準(zhǔn)曲線精密吸取阿苯達(dá)唑-2-氨基砜標(biāo)準(zhǔn)品，用50％甲醇水溶液稀釋成系列濃度為1，5，10，20，50，100ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣測定，以峰面積響應(yīng)為縱坐標(biāo)，阿苯達(dá)唑-2-氨基砜濃度為橫坐標(biāo)。如圖13所示，得到阿苯達(dá)唑-2-氨基砜的回歸方程為Y＝1378.144404*X-594.187990，R2＝0.9999，由相關(guān)系數(shù)可見，在1ng/mL～100ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，UPLC-MSMS法測定線性關(guān)系良好，此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于準(zhǔn)確定量。4.3.2阿苯達(dá)唑亞砜的標(biāo)準(zhǔn)曲線精密吸取阿苯達(dá)唑亞砜標(biāo)準(zhǔn)品，用50％甲醇水溶液稀釋成系列濃度為1，5，10，20，50，100ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣測定，以峰面積響應(yīng)為縱坐標(biāo)，阿苯達(dá)唑亞砜濃度為橫坐標(biāo)。如圖14所示，得到阿苯達(dá)唑亞砜的回歸方程為Y＝519.827117*X-28.361658，R2＝0.9998，由相關(guān)系數(shù)可見，在1ng/mL～100ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，UPLC-MSMS法測定線性關(guān)系良好，此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于準(zhǔn)確定量。4.3.3阿苯達(dá)唑砜的標(biāo)準(zhǔn)曲線精密吸取阿苯達(dá)唑砜標(biāo)準(zhǔn)品，用50％甲醇水溶液稀釋成系列濃度為1，5，10，20，50，100ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣測定，以峰面積響應(yīng)為縱坐標(biāo)，阿苯達(dá)唑砜濃度為橫坐標(biāo)。如圖15所示，得到阿苯達(dá)唑砜的回歸方程為Y＝1384.923769*X-533.206880，R2＝0.9998，由相關(guān)系數(shù)可見，在1ng/mL～100ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，UPLC-MSMS法測定線性關(guān)系良好，此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于準(zhǔn)確定量。4.3.4阿苯達(dá)唑精密吸取阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)品，用50％甲醇水溶液稀釋成系列濃度為1，5，10，20，50，100ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣測定，以峰面積響應(yīng)為縱坐標(biāo)，阿苯達(dá)唑濃度為橫坐標(biāo)。如圖16所示，得到阿苯達(dá)唑的回歸方程為Y＝8382.358953*X-2437.446609，R2＝0.9999，由相關(guān)系數(shù)可見，在1ng/mL～100ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，UPLC-MSMS法測定線性關(guān)系良好，此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于準(zhǔn)確定量。4.4檢出限在基質(zhì)中添加相當(dāng)于樣品含有1.0μg/kg的阿苯達(dá)唑及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)前處理上機(jī)檢測，計算其信噪比(S/N)＞10，如圖17所示。測得本發(fā)明方法對阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢出限為1.0μg/kg。4.5驗證基體及回收率基體及回收率的驗證如表3所示：表3基體及回收率的驗證從市場上購買牛肉、豬肝、豬腎、從超市購買雞蛋、原料乳、鯽魚基質(zhì)做加標(biāo)實驗回收率70％-90％之間，說明本方法穩(wěn)定性良好。5.結(jié)論通過運(yùn)用UPLC-LCMSMS法對動物源基體中的阿苯達(dá)唑及其代謝物進(jìn)行測定，確定使用2，6-二叔丁基對甲酚、NaOH和乙酸乙酯進(jìn)行提取，正己烷純化，PCX小柱進(jìn)行凈化，使阿苯達(dá)唑及其代謝物色譜峰達(dá)到基線分離，峰形良好，檢測限低，靈敏度高，方法回收穩(wěn)定，本研究為動物源基質(zhì)中的阿苯達(dá)唑及其代謝物殘留量的測定建立了一種可靠地分析方法。當(dāng)前第1頁1 2 3