本發(fā)明涉及一種用于檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分含量的組合物、試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

狗骨為為犬科動物狗的骨骼，具有健脾和絡(luò)、活血生肌的功效，主治風(fēng)濕痹痛、腰腿無力、四肢麻木、久痢、瘡瘺。以狗骨為主藥制成的制劑有狗骨膠、狗骨膠藥酒、復(fù)方狗骨膠、壯骨伸筋膠囊、駁骨丸等。目前狗骨的鑒別主要為性狀鑒別和顯微鑒別，因?qū)傩圆粡?，常存在鑒別不準(zhǔn)確等情況，對于用狗骨加工后的產(chǎn)品無法鑒別，更無法定量檢測。因為缺乏專屬性鑒別方法和定量方法，部分不法廠家進(jìn)行造假或摻假，以降低成本獲得非法利潤。

因此，目前迫切需要提出一種能夠快速、準(zhǔn)確檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分含量的方法，進(jìn)而實現(xiàn)對含狗骨源成分的產(chǎn)品的真?zhèn)舞b定。本發(fā)明從狗骨中主要成分出發(fā)，利用所含蛋白的氨基酸序列不同，找出狗骨特征性肽段，利用狗骨的特征肽段實現(xiàn)膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源性成分含量的檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于，提供一種能夠快速、準(zhǔn)確鑒定膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分含量的組合物。

本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種能夠快速、準(zhǔn)確鑒定膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分含量的試劑盒。

本發(fā)明的再一個目的在于，提供一種能夠快速、準(zhǔn)確鑒定膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分含量的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

一種用于檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分含量的組合物，所述組合物由多肽及對照品檢測基質(zhì)組成，所述多肽的氨基酸序列為Gln-Gly-Pro-Ser-Gly-Thr-Ser-Gly-Glu-Arg(SEQIDNO.1所示)，對照品檢測基質(zhì)為魚骨膠。

含有所述組合物的檢測試劑盒也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分含量的方法，具體包括如下步驟：

(1)對照品溶液的制備

1)基質(zhì)溶液的制備：將稱量好的對照品檢測基質(zhì)置于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，加NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度；

2)對照品母液的制備：將稱量好的對照品檢測基質(zhì)置于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，將稱量好的的多肽放入該量瓶中，用NH₄HCO₃溶液溶解并稀釋至刻度；

3)對照品溶液制備：以步驟1)制得的基質(zhì)溶液為溶劑，將步驟2)制得的對照品母液稀釋，微孔濾膜過濾，續(xù)濾液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

(2)待檢測樣品溶液的制備

將稱量好的待測膠類中藥置于量瓶中，加NH₄HCO₃溶液，超聲使膠類中藥完全溶解，加NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，續(xù)濾液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

(3)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測

分別取步驟(1)制得的對照品溶液、步驟(2)制得的待檢測樣品溶液放入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測，選擇m/z488.5→693.3、549.3作為檢測離子對進(jìn)行MRM掃描，其中選擇m/z488.5→693.3作為多肽的定量離子對；

(4)樣品中狗骨源成分含量的計算

以對照品溶液的多肽的含量為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，線性相關(guān)系數(shù)R≥0.9992，由此計算出樣品中多肽的含量，然后，按下式計算出各樣品中狗骨源成分的含量：

狗骨源成分的含量(％)＝(待測樣品中多肽含量/待測樣品的重量)÷(6.389×10^-3)×100％。

優(yōu)選的，步驟(1)及步驟(2)所述的酶解溫度為37℃。

本發(fā)明的用于檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中的狗骨源成分含量的方法，其中，步驟(3)中液質(zhì)聯(lián)用儀檢測的液相條件為：C₁₈反相色譜柱，流動相A為0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：5→20min，流動相A 95％→80％，流動相B 5％→20％，質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測。

優(yōu)選的，所述的用于檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分含量的組合物，所述膠類中藥為阿膠、黃明膠、龜甲膠、鹿角膠、驢骨膠、牛骨膠、豬骨膠、羊骨膠或其他膠類中藥。

再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的組合物或所述的試劑盒在檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中的狗骨源成分含量中的應(yīng)用。

直接對膠類中藥中狗骨源成分進(jìn)行準(zhǔn)確的含量檢測，首先要找出能標(biāo)志狗骨源成分且在不同生產(chǎn)工藝的膠類中藥中含量相對穩(wěn)定的物質(zhì)；其次膠類中藥的成分非常復(fù)雜，檢測時信號不穩(wěn)定，因此該物質(zhì)要滿足在檢測時具有較高的信號響應(yīng)、較低的噪音及其他物質(zhì)干擾，還應(yīng)考慮檢測信號的穩(wěn)定性；第三需要設(shè)立合適的對照品等。

對此，本發(fā)明通過選取狗骨源特征性多肽，從而實現(xiàn)對膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分的含量檢測。實驗證明，采用本發(fā)明的方法，能夠準(zhǔn)確地檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分的含量，且操作簡單，在膠類中藥產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中：

圖1是對照品溶液MRM掃描模式下選擇離子對m/z488.5→693.3監(jiān)測的質(zhì)譜圖；

圖2是各種純品膠類中藥樣品MRM掃描模式下選擇離子對m/z488.5→693.3監(jiān)測的質(zhì)譜圖。

具體實施方式

以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實例中沒有注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

實施例1

1、材料和試劑

材料：各種膠類中藥，包括狗骨膠、驢骨膠、牛骨膠、豬骨膠、羊骨膠、魚骨膠(對照品檢測基質(zhì))，分別用狗骨、驢骨、牛骨、豬骨、羊骨、魚骨煎煮獲得。

多肽交由生物公司合成。

試劑：碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純)。

2、檢測方法

(1)對照品溶液的制備

1)基質(zhì)溶液的制備

稱取0.50g對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻；

2)對照品母液的制備

將稱量好的0.05g對照品檢測基質(zhì)置于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，稱取38.1mg的多肽于該量瓶中，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；

3)對照品溶液的制備

采用分步稀釋的方法，以步驟1)制得的基質(zhì)溶液為溶劑，將步驟2)制得的對照品母液稀釋1000倍，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h；

(2)待測樣品溶液的制備

稱取0.05g待測樣品于25ml量瓶中，加入1％(w/w)NH₄HCO₃(pH8.0)溶液，超聲使樣品完全溶解，繼續(xù)加1％(w/w)NH₄HCO₃(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h；

(3)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測

分別取步驟(1)制得的對照品溶液、步驟(2)制得的待檢測樣品溶液各5μl放入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測，液相條件：C₁₈反相色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相A為0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：5→20min，流動相A 95％→80％，流動相B 5％→20％。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測，選擇m/z488.5→693.3、549.3作為檢測離子對進(jìn)行MRM掃描，其中選擇m/z488.5→693.3作為多肽的定量離子對；

(4)樣品中狗骨源成分含量的計算

圖1是對照品溶液MRM掃描模式下選擇離子對m/z488.5→693.3監(jiān)測的質(zhì)譜圖；圖2是各種動物骨樣品MRM掃描模式下選擇離子對m/z488.5→693.3監(jiān)測的質(zhì)譜圖。

以對照品溶液的多肽的含量為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，線性相關(guān)系數(shù)R≥0.9992，由此計算出樣品中多肽的含量，然后，按下式計算出各樣品中狗骨源成分的含量：

狗骨源成分的含量(％)＝(待測樣品中多肽含量/待測樣品的重量)÷(6.389×10^-3)×100％。

其中，各樣品中狗骨源成分的含量：

狗骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0.3189×10^-3g/0.0502g)÷(6.389×10^-3)×100％＝99.43％≈100％

驢骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0mg/0.0506g)÷(6.389×10^-3)×100％＝0％

牛骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0mg/0.0504g)÷(6.389×10^-3)×100％＝0％

豬骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0mg/0.0512g)÷(6.389×10^-3)×100％＝0％

羊骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0mg/0.0502g)÷(6.389×10^-3g)×100％＝0％

上述計算結(jié)果表明：狗骨膠中狗骨源成分的含量100％，驢骨膠、牛骨膠、豬骨膠、羊骨膠中狗骨源成分的含量為0％。這與實際情況相符，表明該方法能準(zhǔn)確檢測膠類中藥中狗骨源成分的含量。

實施例2

1、材料和試劑

材料：各種純品膠類中藥，包括狗骨膠、驢骨膠、牛骨膠、豬骨膠、羊骨膠、魚骨膠(對照品檢測基質(zhì))，分別用狗骨、驢骨、牛骨、豬骨、羊骨、魚骨煎煮獲得。

多肽交由生物公司合成。

試劑：碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純)。

膠類中藥復(fù)方制劑：向上述純品膠類中藥中加入不同質(zhì)量百分比的狗骨膠制成3個復(fù)方膠類中藥制劑，包括含15％狗骨膠的牛骨膠、含30％狗骨膠的牛骨膠、含30％狗骨膠的豬骨膠，分別命名為制劑1、制劑2以及制劑3。

2、檢測方法

(1)對照品溶液的制備

1)基質(zhì)溶液的制備

稱取0.50g對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻；

2)對照品母液的制備

將稱量好的0.05g對照品檢測基質(zhì)置于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，稱取38.1mg的多肽于該量瓶中，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻；

3)對照品溶液的制備

采用分步稀釋的方法，以步驟1)制得的基質(zhì)溶液為溶劑，將步驟2)制得的對照品母液稀釋500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、10000倍，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h；

(2)待測樣品溶液的制備

取0.05g待測膠樣品于25ml量瓶中，加入1％(w/w)NH₄HCO₃(pH8.0)溶液溶解后，繼續(xù)加1％(w/w)NH₄HCO₃(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h；

(3)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測

分別取步驟(1)制得的對照品溶液、步驟(2)制得的待檢測樣品溶液各5μl放入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測，液相條件：C₁₈反相色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相A為0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：5→20min，流動相A 95％→80％，流動相B 5％→20％。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測，選擇m/z488.5→693.3、549.3作為檢測離子對進(jìn)行MRM掃描，其中選擇m/z488.5→693.3作為多肽的定量離子對；

(4)樣品中狗骨源成分含量的計算

以對照品溶液的多肽的含量為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，線性相關(guān)系數(shù)R≥0.9992，由此計算出樣品中多肽的含量，然后，按下式計算出各樣品中狗骨源成分的含量：

狗骨源成分的含量(％)＝(待測樣品中多肽含量/待測樣品的重量)÷(6.389×10^-3)×100％。

其中，各樣品中狗骨源成分的含量：

狗骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0.3208×10^-3g/0.0506g)÷(6.389×10^-3)×100％＝99.23％≈100％

含15％狗骨膠的牛骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0.0482×10^-3g/0.0502g)÷(6.389×10^-3)×100％＝15.03％

含30％狗骨膠的牛骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0.0981×10^-3g/0.0508g)÷(6.389×10^-3)×100％＝30.23％

含30％狗骨膠的豬骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0.0966×10^-3g/0.0506g)÷(6.389×10^-3)×100％＝29.88％

上述計算結(jié)果表明：利用本發(fā)明的檢測方法得到的制劑1-3中的狗骨源的檢測含量與實際情況相符，表明該方法能準(zhǔn)確檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分的含量。

綜上所述，利用本發(fā)明公開的多肽以及對照品檢測基質(zhì)，采用液質(zhì)聯(lián)用儀，能準(zhǔn)確檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分的含量。

需要說明的是，以上實施例僅用以說明發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明作的各種改動或修改而不背離本發(fā)明的精神與范圍，這些等價形式同樣落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

序列表

<110> 東阿阿膠股份有限公司

<120>一種用于檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中狗骨源成分含量的組合物、試劑盒及其檢測方法

<130> KLPI161253

<160> 1

<170>PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 多肽

<400> 1

Gln Gly Pro Ser Gly Thr Ser Gly Glu Arg 10