本發(fā)明涉及一種生物蛋白檢測技術方案，特別是一種中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白含量檢測試劑盒。
背景技術：
：人類中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，NGAL)分子量約為25kDa，共價結合于中性粒細胞明膠酶。NGAL生理狀態(tài)下是一種生長因子，主要參與了早期腎臟上皮的發(fā)生、生長。在正常組織包括腎臟，肺，胃及結腸的上皮組織中表達量較低。腎臟缺血再灌注損傷后，近曲小管上皮大量表達NGAL，是近來發(fā)現(xiàn)的早期診斷AKI(急性腎損傷)的敏感的生物學標志物。尿NGAL是腎臟缺血再灌注損傷的一個敏感的指標，同時其表達量與腎臟缺血時間相關。在尋找AKI早期診斷標記物的研究中，人們發(fā)現(xiàn)NGAL是一個很好的預測及診斷指標。有學者在急性缺血再灌注和順鉑誘導的AKI小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)在損傷發(fā)生數(shù)小時之內(nèi)即可檢測到NGAL的表達明顯增高。尿NGAL是缺血性腎損傷的一個早期、敏感的指標，即AKI時血、尿NGAL水平均升高，尿NGAL水平升高更為顯著。并且NGAI升高較早期腎臟損傷的其他指標如腎臟損傷分子(kidneyinjurymolecular1，KIM一1)、Cyr61(cysteinrichprotein61)、132一微球蛋白等出現(xiàn)得要早。同時，NGAL水平與腎臟損傷程度呈正相關，血和尿NGAL可作為診斷AKI的早期、敏感、特異性的早期生物學標記物，并在一定程度上可以反映AKI嚴重程度及判斷預后。NGAL已被證實作為小兒心臟搭橋手術后，預測急性腎損害的早期可靠指標。NGAL也是反映腎臟慢性損害的一種有潛力的新標記物，在慢性腎臟病(chronickidneydis-ease，CKD)患者中，NGAL能確切反映腎臟損害的程度，是CKD進展的一個強力和獨立的風險指標。Suzuki等發(fā)現(xiàn)與血NGAL水平相比，尿NGAL是兒童SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)患者LN(狼瘡性腎炎)活動度和腎損害的一個新的標記物，且LN病理分型不同其NGAL水平亦不同(依據(jù)WHO的LN分型，IV型患兒NGAL水平明顯高于V型)。在對抗中性粒細胞胞漿抗體(antineutrophilcytoplasmican-tibodies，ANCA)相關性血管炎的研究中，Chen等發(fā)現(xiàn)患者血清NGAL水平在疾病初期和復發(fā)期均較緩解期顯著升高，提示循環(huán)NGAL水平可作為評價ANCA相關性血管炎疾病活動的一個有用指標。目前NGAL的檢測方法有酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、Western-blotting、化學發(fā)光法以及膠乳免疫比濁法。酶聯(lián)免疫法自動化程度不高，且受人為因素影響較大；放射免疫法存在著環(huán)境污染問題；Western-blotting操作復雜，測定精密度低；而化學發(fā)光法靈敏度雖高，但測試程序復雜且檢測成本較高，并且需要特定化學發(fā)光檢測儀；膠乳免疫比濁法也是測定人血漿或尿液中NGAL濃度的常用方法，它與上述其他幾種方法相比較，存在操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬、無污染、應用范圍廣等顯著的特點。因此，膠乳免疫比濁法有著極大的研究價值，但是目前市場上的膠乳免疫比濁法檢測試劑盒存在著檢測不到NGAL二聚體、NGAL/MMP-9復合物等問題，有待改進。中國專利CN103048464公開了一種NGAL檢測試劑盒，采用中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白抗體既能和中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白抗原結合又能和MMP-9/NGAL復合物相結合，有效避免了NGAL/MMP-9復合物對檢測結果的影響。但是此方法容易造成對游離MMP-9的非特異性反應的結果假陽性升高；另外，對NGAL二聚體的響應信號與NGAL單體相同，造成結果的假陰性降低。技術實現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種能夠解離自身聚合形成46kD的同源二聚體，也能夠解離與MMP-9聚合形成135kD的異源二聚體，釋放出NGAL單體，消除上述兩種二聚體對檢測干擾的中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白的檢測試劑盒。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：一種中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白檢測試劑盒，該試劑盒由試劑Ⅰ(R1)和試劑Ⅱ(R2)組成，所述試劑Ⅰ的組分包括緩沖劑；所述試劑Ⅱ的組分包括包被中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)抗體的膠乳顆粒，所述試劑Ⅰ還包括變性劑。本發(fā)明變性劑的加入能夠解離自身聚合形成46kD的同源二聚體，也能夠解離與MMP-9聚合形成135kD的異源二聚體，釋放出NGAL單體，消除上述兩種二聚體對檢測干擾。本發(fā)明所述的變性劑優(yōu)選為：鹽酸胍、異硫氰酸胍、硫氰酸胍、尿素、SDS(十二烷基硫酸鈉)中的一種或者兩種以上。過度的變性則可能會影響抗體的特異性反應，因此變性劑的濃度選擇是非常重要的；因此，本發(fā)明的變性劑濃度范圍控制在0.01mmol/L～10mmol/L，進一步優(yōu)選為0.1mmol/L～2mmol/L；在此濃度下NGAL聚集體解離，但是變性程度不大，基本維持其三維結構，不影響抗體的結合。由于同源異源二聚體中含有二硫鍵，試劑中如果添加巰基解離劑會使NGAL單體釋放的更加徹底，因此，在試劑Ⅰ中添加將有助于NGAL的釋放；優(yōu)選的巰基解離劑為：三(2-羧乙基)膦、DTT(二硫蘇糖醇)、GSH(谷胱甘肽)、半胱氨酸中的一種或者兩種以上，優(yōu)選的巰基解離劑的濃度為0.1mmol/L～2mmol/L。為了增加解離的速度，在試劑Ⅰ中添加表面活性劑是很有幫助的，對于解聚蛋白質(zhì)兩性離子表面活性劑卻具有良好的作用，因此優(yōu)選為兩性離子表面活性劑；優(yōu)選的兩性離子表面活性劑為CHAPS(3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸)、3-磺丙基十四烷基二甲基銨、Pluracare1307中的一種或者兩種以上，優(yōu)選的兩性離子表面活性劑的濃度為0.02％～1％(質(zhì)量百分比)。在試劑Ⅰ中除了上述的兩性離子表面活性劑外，還可以包括促進試劑體系中各組分以及檢測樣本中各物質(zhì)的均勻分散及提高檢測的精密度、達到減少樣本濁度對測定結果的影響目的的表面活性劑；因此，現(xiàn)有的具有增溶性質(zhì)的表面活性劑都可作為試劑Ⅰ的表面活性劑，例如，吐溫20、吐溫40、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇等中的一種或者兩種以上。上述的兩性離子表面活性劑可以單獨添加，或者與具有增溶性質(zhì)的表面活性劑混合添加到本發(fā)明的試劑Ⅰ中。本發(fā)明試劑Ⅰ中的緩沖劑是能夠用于維持一定pH值的各種緩沖劑，例如可以是三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)、三羥甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1,4-二羥基丙磺酸(POPSO)、3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)等各種常用生物緩沖液，為了達到更好的檢測效果，試劑Ⅰ中所述的生物緩沖劑優(yōu)選為三羥甲基氨基甲烷(Tris)。試劑Ⅰ還包括：促凝劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、阻斷劑、螯合劑。試劑Ⅰ中的促凝劑可以促進抗原抗體反應，有利于膠乳顆粒交聯(lián)物的形成和增大，提高檢測靈敏度和線性范圍，本發(fā)明檢測試劑盒中的促凝劑優(yōu)選為PEG-6000(PEG為聚乙二醇，PE6000)或PEG-8000(PEG8000)或NaCl等。試劑Ⅰ所述的防腐劑主要是為了防止細菌滋生導致的產(chǎn)品變質(zhì)，所以任何一種能起到防止細菌滋生作用的防腐劑均能適用于本發(fā)明；本發(fā)明試劑Ⅰ中的防腐劑優(yōu)選為Proclin-300(Proclin300)，該產(chǎn)品毒性小，使用劑量小，殺菌譜廣。試劑Ⅰ中所述的穩(wěn)定劑，主要作用是保護抗體的活性及防止膠乳顆粒的凝集、下沉，同時還可以增加試劑盒中各組分的穩(wěn)定性，延長產(chǎn)品的貨架期及開瓶后使用時間。常用的穩(wěn)定劑為糖類、醇類、蛋白類(如牛血清白蛋白，BSA)以及一些氨基酸等中的一種或者兩種以上的混合，本發(fā)明中的試劑Ⅰ中的穩(wěn)定劑優(yōu)選為蔗糖、BSA等。試劑Ⅰ中的阻斷劑可以有效避免非特異性反應對檢測結果的干擾。檢測試劑盒中常見的干擾因素有以下兩類：異嗜性抗體干擾、類風濕因子干擾。本發(fā)明優(yōu)選的阻斷劑為類風濕因子阻斷劑。部分類風濕關節(jié)炎、各種膠原結締組織病、肝病以及多種慢性疾病病人體內(nèi)會出現(xiàn)的一類自身抗體，可與自身IgG分子的Fc段抗原決定簇起反應，該類抗體被稱為類風濕因子。試劑Ⅰ中的螯合劑能夠絡合檢測樣本中的金屬離子，以減少金屬離子造成的干擾；因此，能夠絡合金屬離子的各種螯合劑均能夠適用，例如：乙二胺四乙酸二鈉，氨基三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸及其鹽等中的一種或者兩種以上，本發(fā)明試劑優(yōu)選乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)為螯合劑。試劑Ⅱ包被中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)抗體的膠乳顆粒的制備，可以采用本領域技術人員所熟知的公知方法；優(yōu)選的乳膠為表面帶有羧基基團的聚苯乙烯乳膠微球，微球大小為優(yōu)選為50～500nm，通過NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)、EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)活化微球表面羧基，進而交聯(lián)抗體。試劑Ⅱ還包括：緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、助懸劑。試劑Ⅱ中所述的緩沖劑作用與試劑Ⅰ中相同，優(yōu)選為3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)。試劑Ⅱ中所述的防腐劑作用與試劑Ⅰ中相同，優(yōu)選為Proclin-300。試劑Ⅱ中所述的穩(wěn)定劑作用與試劑Ⅰ中相同，優(yōu)選為蔗糖。試劑Ⅱ中所述的助懸劑可以幫助膠乳顆粒維持一個很好的分散狀態(tài)，防止膠乳顆粒下沉影響檢測試劑盒的品質(zhì)及開瓶穩(wěn)定性，常用的助懸劑有乙二醇、丙三醇、乳糖和麥芽糖等中的一種或者一種以上，本發(fā)明試劑Ⅱ優(yōu)選乙二醇作為助懸劑。本發(fā)明的試劑Ⅰ還包括的：促凝劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、阻斷劑、螯合劑；以及試劑Ⅱ還包括的：緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、助懸劑；以及緩沖劑等的濃度均為行業(yè)常規(guī)的濃度范圍即可，不需要做特殊的限定。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果:1.蛋白質(zhì)的聚集體狀態(tài)通過添加變性劑使之產(chǎn)生某種程度的變性，暴露出物理和(或)化學結合部位，然后巰基解離劑斷裂化學結合部位的化學結合作用，表面活性劑則分散物理結合部位的物理結合作用，使聚集體解聚；因此，合適的變性劑、巰基解離劑、表面活性劑的種類和濃度選擇就尤為重要，既要解聚聚集體，又不能干擾隨后的免疫學檢測；而本發(fā)明的變性劑、巰基解離劑、表面活性劑的種類和濃度通過特定的篩選和確定，正好解決了上述技術問題。2.本發(fā)明在試劑Ⅰ中添加兩性離子表面活性劑，對于解聚蛋白質(zhì)兩性離子表面活性劑卻具有良好的作用，同時還能提高解離速度。具體實施方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。包被中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)抗體的膠乳顆粒的制備方法：1.羧化活化聚苯乙烯膠乳溶液的制備：稱取0.1g粒徑為150nm的聚苯乙烯膠乳顆粒((該聚苯乙烯膠乳顆粒為市售常規(guī)產(chǎn)品))干燥物，加入10mL0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)分散，然后加入4mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，再加入2mg的NHS，在室溫下攪拌反應0.5小時，離心棄上清液保留沉淀，再用10mL0.1M的磷酸鹽緩沖液稀釋分散沉淀膠乳既得羧化改性聚苯乙烯膠乳；2.NGAL抗體溶液的制備：將250μgNGAL抗體用0.5mL去離子水溶解，得到NGAL抗體溶液；3.包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備：取100μL第2步所制得的NGAL抗體溶液，用5mL0.1M磷酸鹽緩沖液稀釋后，加入5mL第1步制得膠乳溶液(羧化改性聚苯乙烯膠乳)，在室溫下攪拌反應2小時，加入0.2mL0.1M甘氨酸緩沖液和2mL10％BSA溶液，攪拌30分鐘，終止反應，離心棄上清液保留沉淀，用0.1M磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀2次，得到包被NGAL抗體的膠乳顆粒。實施例11、試劑Ⅰ的制備方法：按照下表配制試劑Ⅰ：試劑Ⅰ濃度三羥甲基氨基甲烷(Tris)0.1mol/L鹽酸胍0.1mmol/L用NaOH或者HCl調(diào)試劑Ⅰ的pH值為7.4。2、試劑Ⅱ的制備方法：按照下表配制試劑Ⅱ：用NaOH或者HCl調(diào)試劑Ⅱ的pH值為7.0。實施例21、試劑Ⅰ的制備方法：按照下表配制試劑Ⅰ：用NaOH或者HCl調(diào)pH值為7.4。2、試劑Ⅱ的制備方法：按照下表配制試劑Ⅱ：用NaOH或者HCl調(diào)pH值為7.0。實施例31、試劑Ⅰ的制備方法：按照下表配制試劑Ⅰ：試劑Ⅰ濃度三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES)0.1mol/LSDS0.15mmol/L曲拉通X-1000.1mmol/LPEG-60002％(w/w)CHAPS0.05％(w/w)DTT0.1mmol/L用NaOH或者HCl調(diào)pH值為7.4。2、試劑Ⅱ的制備方法：按照下表配制試劑Ⅱ：試劑濃度3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)0.05mol/L制備的包被NGAL抗體的乳膠0.2％(w/w)Proclin-3000.025％(w/w)蔗糖10％(w/w)用NaOH或者HCl調(diào)pH值為7.0。實施例41、試劑Ⅰ的制備方法：按照下表配制試劑Ⅰ：用NaOH或者HCl調(diào)pH值為7.4。2、試劑Ⅱ的制備方法：按照下表配制試劑Ⅱ：試劑Ⅱ濃度3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)0.05mol/L制備的包被NGAL抗體的乳膠0.2％(w/w)Proclin-3000.025％(w/w)蔗糖10％(w/w)乙二醇2％(w/w)用NaOH或者HCl調(diào)pH值為7.0。實施例51、試劑Ⅰ的制備方法：按照下表配制試劑Ⅰ：用NaOH或者HCl調(diào)pH值為7.4。2、試劑Ⅱ的制備方法：按照下表配制試劑Ⅱ：試劑Ⅱ濃度3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)0.05mol/L制備的包被NGAL抗體的乳膠0.2％(w/w)Proclin-3000.025％(w/w)蔗糖10％(w/w)乙二醇2％(w/w)用NaOH或者HCl調(diào)pH值為7.0。對比例1試劑Ⅰ除了不加異硫氰酸胍、SDS、Pluracare1307、半胱氨酸之外，其它組分與實施例5相同；試劑Ⅱ與實施例5的試劑Ⅱ完全一樣。實施例6將NGAL蛋白(購自R&D公司)，用生理鹽水溶解，配制為5000ng/ml。添加Proclin-300使之濃度為0.1％。放置在2-8℃條件下3天，采用Superdex-200凝膠柱層析，監(jiān)測280nm吸收，第一個峰為二聚體NGAL，第二個峰為NGAL單體。經(jīng)濃縮分別得到NGAL同源二聚體和NGAL單體高濃度溶液。采用考馬斯亮藍-G250染色法分別測定二者的蛋白濃度，配制成下表所示的濃度，分別采用實施例1-5和對比例1測試其濃度。NGAL測試方法：校準品濃度：4800ng/ml、3200ng/ml、1600ng/ml、800ng/ml、400ng/ml、0ng/ml，采用單體NGAL溶液配制；測試波長：主波長：570nm，副波長：800nm；加樣方式：R1：S：R2＝150μl：4μl：50μl；校準方式：spline；讀點方式：在150μl的R1中加入樣本4μl，37℃反應5min，讀取吸光度A1，然后加入R2，反應5min，讀取吸光度A2，計算A2-A1。結果如下(單位：ng/ml)：表1：NGAL二聚體對測試的影響從上表可以看出實施例1-5的結果相比對比例1而言，更加接近蛋白的真實濃度。受NGAL聚合形態(tài)的影響更小，避免檢測結果偏低導致的臨床誤診和誤判。實施例7從醫(yī)院取回尿液樣本，采用HumanMMP-9/NGALcompleximmunoassay(購自R&D公司)進行檢測，選取20支MMP-9/NGAL濃度較高的樣本，再采用實施例1-5和對比例1測試NGAL濃度(測試方法同實施例6)，結果如下表2所示(單位：ng/ml)：表2：MMP-9/NGAL二聚體對測試的影響表2NGAL濃度從表2中可見本發(fā)明檢測試劑盒檢測的NGAL含量要高于對比實施例1-4所制備的檢測試劑盒，說明本發(fā)明試劑盒可以避免NGAL/MMP-9復合物對檢測結果的影響，避免檢測結果偏低導致的臨床誤診和誤判。對所公開的實施例的上述說明，使本領域專業(yè)技術人員能夠實現(xiàn)或使用本發(fā)明對這些實施例的多種修改對本領域的專業(yè)技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。當前第1頁1 2 3