本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種血液游離RNA保護(hù)劑及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

游離循環(huán)RNA是一種存在于動(dòng)植物和人的體液中的細(xì)胞外游離狀態(tài)的RNA，包括：血漿、血清、尿液、前列腺液、支氣管灌洗液、唾液、腦脊液、胃液、膽汁、淋巴液及糞便。自游離循環(huán)RNA被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，就逐漸被應(yīng)用到不同領(lǐng)域，發(fā)揮著巨大的作用。

在腫瘤應(yīng)用方面，有研究報(bào)道了在惡性腫瘤患者血液中檢測(cè)到了游離循環(huán)RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，而在良性腫瘤患者血清中則沒(méi)有檢測(cè)到，說(shuō)明游離循環(huán)RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體可以作為一種潛在的腫瘤標(biāo)記物；研究還表明在切除了腫瘤患者的腫瘤后，游離循環(huán)RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體很快消失了，證明了腫瘤的生長(zhǎng)與這種復(fù)合體相關(guān)。

在無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前應(yīng)用方面，胎兒RNA分子主要來(lái)源于胎盤，不但易于檢測(cè)，而且還具有無(wú)需依賴胎兒性別或父源性多態(tài)性位點(diǎn)的明顯的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。目前，有研究表明宮內(nèi)發(fā)育遲緩、胎兒非整倍體以及子癇前期等妊娠相關(guān)疾病與母血中游離RNA有極大關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明可以將孕婦血液中游離RNA作為一種新的胎兒遺傳信息材料，這給無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷帶來(lái)了前所未有的契機(jī)。

血液游離RNA的檢測(cè)及其在基因診斷等方面的應(yīng)用，對(duì)于惡性腫瘤、胚胎醫(yī)學(xué)、無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前等的診斷和監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義。

但在血液中的游離RNA含量少，而血液中RNA酶含量多，游離的RNA在沒(méi)有保護(hù)的狀態(tài)下很容易降解消失，所以研發(fā)一種有效可行的延長(zhǎng)血液游離RNA保存期限的保護(hù)劑是很有必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提出一種血液游離RNA保護(hù)劑，該保護(hù)劑不僅能防止血液凝固，而且能夠保護(hù)RNA分子，避免被RNA酶降解。該保護(hù)劑是由EDTA-3K、IDU、bestain、glycine、AEBSF、核糖核苷復(fù)合物按照一定的比例溶解于DEPC水配制而成。把血液與血液游離RNA保護(hù)劑以40:1 的比例緩慢充分混勻后，室溫放置半小時(shí)即可，室溫可保存3天，-20℃至-80℃可長(zhǎng)期保存。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種血液游離RNA保護(hù)劑，所述保護(hù)劑是由EDTA-3K、IDU、bestain、glycine、AEBSF、核糖核苷復(fù)合物按照一定的比例溶解于DEPC水配制而成，其中各組分在所述溶液中的濃度分別為：EDTA-3K（30g-100g/L）、IDU（200-600g/L）、bestain（0.05-0.3g/L）、glycine（10-60g/L）、AEBSF（0.05-0.4g/L）、核糖核苷復(fù)合物（0.2ml-1ml/L）。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的血液游離RNA保護(hù)劑是由EDTA-3K、IDU、bestain、glycine、AEBSF、核糖核苷復(fù)合物按照一定的比例溶解于DEPC水配制而成，其中EDTA-3K、IDU、bestain、glycine、AEBSF、核糖核苷復(fù)合物在所述溶液中的濃度分別為50g/L、550g/L、0.24g/L、30g/L、0.172g/L、0.5ml/L。

本發(fā)明所述的制備血液游離RNA保護(hù)劑的方法，具體步驟如下：

1）將各組分按配方稱（吸）取到容器中；

2）向1）中加入500ml滅菌的DEPC水，待所有組分溶解后全量轉(zhuǎn)移到1L容量瓶中，多次清洗初次溶解的容器，洗滌液全量轉(zhuǎn)移到容量瓶中，最后使用滅菌的DEPC水定容至1L，將溶液PH值調(diào)至7.2-7.8，得到血液游離RNA保護(hù)劑。

權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的血液游離RNA保護(hù)劑在血液游離RNA保存中的應(yīng)用，其特征在于，在所述應(yīng)用中，將采集的血液與血液游離RNA保護(hù)劑以40:1 的比例緩慢充分混勻后，室溫至少放置半小時(shí)。

根據(jù)權(quán)利要求4所述的半小時(shí)后，其特征在于室溫可保存3天，-20℃至-80℃可長(zhǎng)期保存。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

1.第一時(shí)間保護(hù)血液中的游離RNA；

2.更好地保證標(biāo)本RNA的完整性。

附圖說(shuō)明

圖1為全血樣本置于本發(fā)明所述的血液游離RNA保護(hù)劑中保存0天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β--catenin mRNA基因?qū)崟r(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果。

圖2為全血樣本置于本發(fā)明所述的血液游離RNA保護(hù)劑中保存1天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β--catenin mRNA基因?qū)崟r(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果。

圖3為全血樣本置于本發(fā)明所述的血液游離RNA保護(hù)劑中保存2天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β--catenin mRNA基因?qū)崟r(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果。

圖4為全血樣本置于本文所述的血液游離RNA保護(hù)劑中保存3天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β--catenin mRNA基因?qū)崟r(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果。

圖5為全血樣本置于EDTA-Na₂采血管中保存0天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β--catenin mRNA基因?qū)崟r(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果。

圖6為全血樣本置于EDTA-Na₂采血管中保存1天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β--catenin mRNA基因?qū)崟r(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果。

圖7為全血樣本置于EDTA-Na₂采血管中保存2天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β--catenin mRNA基因?qū)崟r(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果。

圖8為全血樣本置于EDTA-Na₂采血管中保存3天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β--catenin mRNA基因?qū)崟r(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方法

以下實(shí)施案例僅用于解釋本發(fā)明，而并非限制本發(fā)明。

實(shí)例：

隨機(jī)抽取8個(gè)全血樣本，分別按5ml/人份分成8人份，其中4人份為1組，分成2組。其中1組置于常規(guī)EDTA-Na₂采血管中，另1組置于本發(fā)明所述的血液游離RNA保護(hù)劑中，分別常溫放置0天、1天、2天、3天后進(jìn)行核酸提?。≦iagen公司的RNeasy Mini Kit (50) -貨號(hào)74104試劑盒），以提取的核酸為樣本進(jìn)行人β--catenin mRNA基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果如表1。

表1

置于常規(guī)EDTA-Na₂采血管和本發(fā)明所述的血液游離RNA保護(hù)劑中的全血樣本，在常溫放置不同時(shí)間后，分別進(jìn)行核酸提取，提取的核酸進(jìn)行人β--catenin mRNA基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果的Ct值如表1。 由表1可知，血液游離RNA保護(hù)劑能夠在3天內(nèi)有效地保護(hù)血液中游離的RNA，只有極其輕微的降解；而常規(guī)EDTA-Na₂采血管對(duì)RNA的穩(wěn)定性維持時(shí)間不到1天且降解情況比較嚴(yán)重。

圖1~圖8為表1對(duì)應(yīng)的人β--catenin mRNA基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果圖，其中圖1~圖4為全血置于本文所述的游離核酸RNA保護(hù)劑中保存不同時(shí)間后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β--catenin mRNA基因?qū)崟r(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果圖，由圖可知，在0~3天的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，所有檢測(cè)樣本都被正確檢出，且穩(wěn)定性良好，血液中的游離核酸得到了有效的保護(hù)；圖5~圖8為全血置于常規(guī)EDTA-Na₂采血管中保存不同時(shí)間后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β--catenin mRNA基因?qū)崟r(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果圖，檢測(cè)結(jié)果顯示，常規(guī)EDTA-Na₂采血管中的游離RNA連1天的穩(wěn)定性都不能維持，降解情況十分嚴(yán)重。