本發(fā)明涉及到一種二十七味定坤丸中人參皂苷類成分的含量測定方法，屬中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種二十七味定坤丸中人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、擬人參皂苷F₁₁、人參皂苷Rb₁四種成分同時(shí)測定的含量測定方法。

背景技術(shù)：

二十七味定坤丸原收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑(第一冊(cè))，現(xiàn)收載于《中國藥典》2015年版一部，由西洋參、白術(shù)、茯苓、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎、黃芪、阿膠、五味子(醋炙)、鹿茸(去毛)、肉桂、艾葉(炒炭)、杜仲(炒炭)、續(xù)斷、佛手、陳皮、厚樸(姜炙)、柴胡、香附(醋炙)、延胡索(醋炙)、牡丹皮、琥珀、龜板(沙燙醋淬)、地黃、麥冬、黃芩共計(jì)二十七味藥材制成，又稱定坤丸，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血，舒郁調(diào)經(jīng)，用于沖任虛損，氣血兩虧，身體瘦弱，月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)期紊亂，行經(jīng)腹痛，崩漏不止，腰酸腿軟的功能?！吨袊幍洹?015年版中二十七味定坤丸的標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)人參皂苷Re進(jìn)行了測定，眾所周知，人參皂苷Re并非西洋參中的特有成分，因此，有必要增加二十七味定坤丸中其它人參皂苷類成分的測定，特別是西洋參的特征成分?jǐn)M人參皂苷F11，有利于控制產(chǎn)品質(zhì)量，保障藥品安全有效，質(zhì)量可控。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種二十七味定坤丸中四種人參皂苷類成分的含量測定方法，四種人參類皂苷成分為人參皂苷Re、人參皂苷Rg₁、擬人參皂苷F₁₁、人參皂苷Rb₁；

本發(fā)明測定方法采用超高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法，其色譜條件如下：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～2分鐘，流動(dòng)相A：20％→50％，流動(dòng)相B：80％→50％；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(ESI源)；監(jiān)測模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細(xì)管電壓：3.00kV；錐孔電壓：60V；監(jiān)測離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取人參皂苷Re、人參皂苷Rg₁、擬人參皂苷F₁₁、人參皂苷Rb₁標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照人參皂苷Re系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml、人參皂苷Rg₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml、擬人參皂苷F₁₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.005μg/ml～1.00μg/ml、人參皂苷Rb₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml，分別精密量取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；

供試品溶液的制備：取樣品適量，研細(xì)，取1.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，稱定重量，加熱回流60～90分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液；

測定法分別精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液各2～5μl，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，即得。

本發(fā)明含量測定方法中，供試品溶液制備中加熱回流提取時(shí)間優(yōu)選為75min；測定法中分別精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液的量優(yōu)選為5μl，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

本發(fā)明含量測定方法最優(yōu)的技術(shù)方案為：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～2分鐘，流動(dòng)相A：20％→50％，流動(dòng)相B：80％→50％；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(ESI源)；監(jiān)測模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細(xì)管電壓：3.00kV；錐孔電壓：60V；監(jiān)測離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取人參皂苷Re、人參皂苷Rg₁、擬人參皂苷F₁₁、人參皂苷Rb₁標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照人參皂苷Re系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml、人參皂苷Rg₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml、擬人參皂苷F₁₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.005μg/ml～1.00μg/ml、人參皂苷Rb₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml，分別精密量取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；

供試品溶液的制備：取樣品適量，研細(xì)，取1.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，稱定重量，加熱回流75分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液；

測定法 分別精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液各5μl，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，即得。

為了驗(yàn)證測定含量方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性，對(duì)方法進(jìn)行了以下方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以確保該含量測定方法可以用于二十七味定坤丸的質(zhì)量控制。

1儀器與試藥

1.1儀器：Waters Acquity UPLC/XEVO TQ-S超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；分析天平：Mettler AE240(感量0.0001g)；精密移液器；超純水儀：Integral 10(MILLIPORE)；色譜柱：Waters BEH C₁₈(1.7μm，2.1×100mm)。

1.2試藥與試劑

對(duì)照品：人參皂苷Re(中檢院提供，批號(hào)：110754-201525，標(biāo)示量92.3％)

人參皂苷Rg₁(中檢院提供，批號(hào)：110703-201530，標(biāo)示量91.7％)

人參皂苷Rb₁(中檢院提供，批號(hào)：110704-201424，標(biāo)示量93.7％)

擬人參皂苷F₁₁(中檢院提供，批號(hào)：110841-201406)

試劑：甲醇、乙腈均為為色譜純，水為超純水。

2方法確定

2.1色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)

色譜條件：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水，梯度洗脫程序(見表1)。

柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μL。

表1梯度洗脫程序

2.2質(zhì)譜參考條件

離子源：電噴霧離子源(ESI源)；

監(jiān)測模式：負(fù)離子，多反應(yīng)監(jiān)測模式；監(jiān)測離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定(見表2)；

脫溶劑氣溫度：500℃；

毛細(xì)管電壓：3.00kV；

錐孔電壓：60V；

表2西洋參中4種成分定性和定量離子及質(zhì)譜條件

2.3流動(dòng)相的優(yōu)化

經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終選定正文方法，能夠在2分鐘內(nèi)完成測定，建立的方法能夠快速、準(zhǔn)確、高效的完成目標(biāo)成分的檢測。

2.4對(duì)照品溶液的配制：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精密量取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.5供試品溶液的制備

取樣品適量，研細(xì)，取1.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流75分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過濾，濾液作為待測液，備用。

3方法學(xué)考察

3.1專屬性考察

分別取混合對(duì)照品溶液、二十七味定坤丸樣品，按“2.5”方法項(xiàng)下處理，進(jìn)樣分析。4種成分峰形良好，無干擾物質(zhì)，色譜峰依次為人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb1，見圖1-2。

3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸取不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液5μl，分別注入超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，進(jìn)行分析，以各成分進(jìn)樣濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，各成分峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3，圖3-6。

表3各成分線性關(guān)系考察結(jié)果

3.4重復(fù)性

同一批樣品，研細(xì)，取低、中、高稱樣量各3份，取樣量分別為0.9、1.2、1.5g，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，計(jì)算含量與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果各成分RSD值均小于6％，表明方法重復(fù)性良好。

3.5回收率

取重復(fù)性項(xiàng)下樣品粉末，取9份，取樣量為0.6g，精密稱定，每3份為1組，分別加入用80％甲醇溶液配制的低、中、高3個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液25ml，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析。結(jié)果4種成分的3個(gè)濃度水平的9份溶液平均回收率在95-100％，并且RSD小于5％。表明方法回收率良好，結(jié)果見表4。

表4各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

3.6穩(wěn)定性

取同一份供試品溶液，于0小時(shí)開始測定，在0、0.5、1、4、8、24小時(shí)進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁、人參皂苷F₁₁峰面積RSD分別為3.9％、2.6％、3.3％、4.2％，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

4樣品測定

用超高效液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)5批樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。

表5樣品測定結(jié)果

附圖說明

圖1混合對(duì)照色譜圖；

圖2二十七味定坤丸樣品色譜圖；

圖3人參皂苷Rg₁標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖4人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5人參皂苷Rb₁標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖6擬人參皂苷F₁₁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～2分鐘，流動(dòng)相A：20％→50％，流動(dòng)相B：80％→50％；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(ESI源)；監(jiān)測模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細(xì)管電壓：3.00kV；錐孔電壓：60V；監(jiān)測離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取人參皂苷Re、人參皂苷Rg₁、擬人參皂苷F₁₁、人參皂苷Rb₁標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照人參皂苷Re系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml、人參皂苷Rg₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml、擬人參皂苷F₁₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.005μg/ml～1.00μg/ml、人參皂苷Rb₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml，分別精密量取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；

供試品溶液的制備：取樣品適量，研細(xì)，取1.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，稱定重量，加熱回流75分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液；

測定法 分別精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液各5μl，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，即得。

實(shí)施例2

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～2分鐘，流動(dòng)相A：20％→50％，流動(dòng)相B：80％→50％；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(ESI源)；監(jiān)測模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細(xì)管電壓：3.00kV；錐孔電壓：60V；監(jiān)測離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取人參皂苷Re、人參皂苷Rg₁、擬人參皂苷F₁₁、人參皂苷Rb₁標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照人參皂苷Re系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml、人參皂苷Rg₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml、擬人參皂苷F₁₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.005μg/ml～1.00μg/ml、人參皂苷Rb₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml，分別精密量取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；

供試品溶液的制備：取樣品適量，研細(xì)，取1.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，稱定重量，加熱回流60分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液；

測定法 分別精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液各5μl，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，即得。

實(shí)施例3

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～2分鐘，流動(dòng)相A：20％→50％，流動(dòng)相B：80％→50％；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(ESI源)；監(jiān)測模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細(xì)管電壓：3.00kV；錐孔電壓：60V；監(jiān)測離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取人參皂苷Re、人參皂苷Rg₁、擬人參皂苷F₁₁、人參皂苷Rb₁標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照人參皂苷Re系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml、人參皂苷Rg₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml、擬人參皂苷F₁₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.005μg/ml～1.00μg/ml、人參皂苷Rb₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml，分別精密量取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置10mL量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；

供試品溶液的制備：取樣品適量，研細(xì)，取1.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，稱定重量，加熱回流90分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液；

測定法 分別精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液各2μl，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，即得。

上述實(shí)施例均按照藥典進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示方法準(zhǔn)確可靠、靈敏、專屬，各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量控制的要求。