本申請是國際申請日為2010年10月27日、國際申請?zhí)枮閜ct/jp2010/069027的pct申請于2012年6月27日進(jìn)入中國國家階段、申請?zhí)枮?01080059603.9、發(fā)明名稱為“用于測定樣本中的待測定成分的方法和試劑盒”申請的分案申請。
本發(fā)明涉及用于測定樣本中的待測成分的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
免疫測量方法正被用為測量樣本中成分的方法。免疫測量方法包括許多方法，例如ria方法(放射免疫測定法)、eia方法(酶免疫測定法)、clia方法(化學(xué)發(fā)光免疫測定法)、cleia方法(化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法)、la方法(乳膠凝集法)、tia方法(免疫透射比濁測定法)和免疫層析方法。在這些測定法中，當(dāng)通過免疫技術(shù)執(zhí)行測量時(shí)，利用了樣本中的成分(或抗體)與針對(duì)它的抗體(或抗原)之間的抗原-抗體反應(yīng)。此外，在這些免疫測定法中，通過將測量具有已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)材料所獲得的數(shù)值(吸光度)與它們的相應(yīng)測量值(濃度)之間的關(guān)系作于圖上，事先制作校準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)曲線)，并獲得樣本中目標(biāo)成分的測定值。可以大量制備并且原材料容易獲得的重組抗原，通常被用于在這些測定法中使用的標(biāo)準(zhǔn)材料。
然而，重組抗原的免疫反應(yīng)性不一定與天然抗原、即樣本中的成分匹配，并且取決于測定期間使用的緩沖液和添加劑，反應(yīng)性也可能不同。具體來說，當(dāng)抗原-抗體反應(yīng)期間的反應(yīng)溫度改變時(shí)，兩者反應(yīng)性的差異變得明顯，這引起了由于溫度而使測定值產(chǎn)生變動(dòng)的問題(參見專利文獻(xiàn)1和2)。
mxa蛋白是由i型干擾素(干擾素α/β)所誘導(dǎo)的一系列蛋白中的一種蛋白，其分子量為78kda，屬于發(fā)動(dòng)蛋白(dynamin)超家族，具有g(shù)tpase活性，并表達(dá)在白細(xì)胞、特別是單核細(xì)胞的胞質(zhì)中。關(guān)于其功能，由于抑制病毒增殖，已知它具有抗病毒效應(yīng)，并且據(jù)稱它在病毒感染的早期階段參與生物體抗病毒狀態(tài)的建立(參見非專利文獻(xiàn)1至4)。
在幾種動(dòng)物物種中發(fā)現(xiàn)的mxa蛋白在其氨基酸末端中具有特征性氨基酸序列。n-端g結(jié)構(gòu)域是抗病毒作用和作為gtpase的活性所必需的部分，c-端區(qū)域富含α-螺旋結(jié)構(gòu)并具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。已報(bào)道這兩個(gè)部分發(fā)生分子內(nèi)相互反應(yīng)，或通過分子內(nèi)相互結(jié)合引起自身聚集(參見非專利文獻(xiàn)5)。
[現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)]
[專利文獻(xiàn)]
[專利文獻(xiàn)1]特開2008-101924號(hào)公報(bào)
[專利文獻(xiàn)2]wo2006/073073
[非專利文獻(xiàn)]
[非專利文獻(xiàn)1]j.interferonres.,vol.7,p.331-343(1987).
[非專利文獻(xiàn)2]mol.cell.biol.,vol.9,p.5062-5072(1989).
[非專利文獻(xiàn)3]j.virol.,vol.64,p.1171-1181(1990).
[非專利文獻(xiàn)4]traffic,vol.3,p.710-717(2002).
[非專利文獻(xiàn)5]j.biologicalchem.,vol.273,p.28365-28370(1998).
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
[本發(fā)明待解決的問題]
本發(fā)明的目的是提供用于測量樣本中的待測成分的方法和試劑盒，由此可以不受反應(yīng)溫度等的影響準(zhǔn)確執(zhí)行樣本中的待測成分、例如抗原的測量。
[解決問題的手段]
為了解決所述問題，本發(fā)明人進(jìn)行了銳意研究，并且發(fā)現(xiàn)，在樣本中的待測成分的免疫測定中，通過在脂肪酸烷醇酰胺存在下將樣本中的待測成分與結(jié)合所述待測成分相的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)，使得有可能不受反應(yīng)溫度等的影響進(jìn)行準(zhǔn)確測量。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在樣本中的待測成分的免疫測定中，通過將樣本中的待測成分與結(jié)合所述待測成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)，然后將待測成分在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)，使得有可能不受反應(yīng)溫度等的影響進(jìn)行準(zhǔn)確測量，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上；并且本發(fā)明人完成了本發(fā)明。更具體來說，本發(fā)明涉及下列[1]至[28]：
[1]一種用于測量待測成分的方法，其中所述方法包含在脂肪酸烷醇酰胺存在下，將樣本中的待測成分與結(jié)合所述待測成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)；然后與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)以形成包含第一抗體、待測成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上；以及測量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量；
[2][1]的方法，其中將標(biāo)記的第二抗體在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下進(jìn)行反應(yīng)；
[3]一種用于測量待測成分的方法，其中所述方法包含將樣本中的待測成分與結(jié)合所述待測成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)；然后在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)，以形成包含第一抗體、待測成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上；以及測量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量；
[4][1]或[2]的方法，其中脂肪酸烷醇酰胺是脂肪酸二乙醇酰胺；
[5][2]或[3]的方法，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是選自聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物的聚氧乙烯非離子型表面活性劑；
[6][2]的方法，其中脂肪酸烷醇酰胺是脂肪酸二乙醇酰胺，并且聚氧乙烯非離子型表面活性劑是選自聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物的聚氧乙烯非離子型表面活性劑；
[7][1]至[6]任一項(xiàng)的方法，其中添加膽汁酸衍生物，并且將樣本中的待測成分與結(jié)合所述待測成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)；
[8][7]的方法，其中膽汁酸衍生物是具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物；
[9][8]的方法，其中具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物是3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]丙磺酸鹽或3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]-2-羥基丙磺酸鹽；
[10][7]的方法，其中膽汁酸衍生物是具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物；
[11][10]的方法，其中具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物是n,n-雙(3-葡萄糖酰胺丙基)膽酰胺或n,n-雙(3-d-葡萄糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺；
[12][1]至[11]任一項(xiàng)的測量方法，其中將第一抗體固定化在不溶性載體上；
[13][1]至[12]任一項(xiàng)的方法，其中樣本是全血；
[14][1]至[13]任一項(xiàng)的方法，其中待測成分是mxa蛋白；
[15]一種用于測量樣本中的待測成分的試劑盒，其中所述試劑盒包含：第一試劑，其包含與待測成分相結(jié)合的第一抗體和脂肪酸烷醇酰胺；以及包含標(biāo)記的第二抗體的第二試劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上；
[16][15]的試劑盒，其中第二試劑還包含聚氧乙烯非離子型表面活性劑；
[17]一種用于測量樣本中的待測成分的試劑盒，其中所述試劑盒包含：第一試劑，其包含與待測成分相結(jié)合的第一抗體；以及第二試劑，其包含標(biāo)記的第二抗體和聚氧乙烯非離子型表面活性劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上；
[18][15]或[16]的試劑盒，其中脂肪酸烷醇酰胺是脂肪酸二乙醇酰胺；
[19][16]或[17]的試劑盒，其中聚氧乙烯非離子型表面活性劑是選自聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物的聚氧乙烯非離子型表面活性劑；
[20][16]的試劑盒，其中脂肪酸烷醇酰胺是脂肪酸二乙醇酰胺，并且聚氧乙烯非離子型表面活性劑是選自聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物的聚氧乙烯非離子型表面活性劑；
[21][15]至[20]任一項(xiàng)的試劑盒，其中第一試劑還包含膽汁酸衍生物；
[22][21]的試劑盒，其中膽汁酸衍生物是具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物；
[23][22]的試劑盒，其中具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物是3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]丙磺酸鹽或3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]-2-羥基丙磺酸鹽；
[24][21]的試劑盒，其中膽汁酸衍生物是具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物；
[25][24]的試劑盒，其中具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物是n,n-雙(3-葡萄糖酰胺丙基)膽酰胺或n,n-雙(3-d-葡萄糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺；
[26][15]至[25]任一項(xiàng)的試劑盒，其中第一抗體被固定化在不溶性載體上；
[27][15]至[26]任一項(xiàng)的試劑盒，其中樣本是全血；并且
[28][15]至[27]任一項(xiàng)的試劑盒，其中待測成分是mxa蛋白。
[本發(fā)明的效果]
本發(fā)明提供了用于測量樣本中的待測成分的方法和試劑盒，其允許不受反應(yīng)溫度等的影響進(jìn)行準(zhǔn)確測量。
具體實(shí)施方式
(1)樣本
對(duì)于在本發(fā)明中使用的樣本沒有特別限制，只要它是允許由本發(fā)明進(jìn)行測量的樣本即可，其實(shí)例包括全血(血液)、血細(xì)胞、血清、血漿、脊髓液、尿液、組織和培養(yǎng)的細(xì)胞。全血包括將血漿與從全血獲得的血細(xì)胞級(jí)份相混合的樣本。全血可以是原樣從對(duì)象收集的血液，或者它可以是在對(duì)收集到的血液進(jìn)行處理后獲得的血液，并且處理過的血液是優(yōu)選的。處理的實(shí)例包括抗凝處理和溶血處理，并且可以將這些處理進(jìn)行組合。
當(dāng)成分(測量對(duì)象)是血細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分時(shí)，優(yōu)選將經(jīng)歷溶血處理的血液作為全血，經(jīng)歷抗凝和溶血兩種處理的血液是特別優(yōu)選的。抗凝處理的實(shí)例包括向收集到的血液加入edta、肝素等的處理。溶血處理的實(shí)例包括添加表面活性劑或皂角苷溶液、與低滲溶液混合、凍融、超聲處理等。
(2)待測成分
對(duì)本發(fā)明中的待測成分沒有特別限制，只要它是能夠由本發(fā)明進(jìn)行測量的待測成分即可，其實(shí)例包括核酸、蛋白質(zhì)、脂類、維生素和多糖。核酸的實(shí)例包括dna、rna、atp、adp、amp和環(huán)amp。蛋白質(zhì)的實(shí)例包括酶、激素和各種肽。
本發(fā)明中的適合的待測成分包括細(xì)胞中包含的物質(zhì)和代謝物，優(yōu)選為由各種細(xì)胞因子例如干擾素在細(xì)胞中誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)等。待測成分的具體實(shí)例是mxa蛋白，其由i型干擾素在胞質(zhì)中誘導(dǎo)(參見前面提到的非專利文獻(xiàn)2至3)。
(3)脂肪酸烷醇酰胺
本發(fā)明的脂肪酸烷醇酰胺的實(shí)例包括脂肪酸二乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸n-甲基乙醇酰胺、脂肪酸單異丙醇酰胺和脂肪酸二異丙醇酰胺，并且脂肪酸二乙醇酰胺是優(yōu)選的。脂肪酸二乙醇酰胺的實(shí)例包括月桂酸二乙醇酰胺、羊蠟酸二乙醇酰胺、辛酸二乙醇酰胺、癸酸二乙醇酰胺、肉豆蔻酸二乙醇酰胺、棕櫚酸二乙醇酰胺、硬脂酸二乙醇酰胺、異硬脂酸二乙醇酰胺、油酸二乙醇酰胺、亞油酸二乙醇酰胺、辛基癸酸二乙醇酰胺、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、椰子脂肪酸二乙醇酰胺、牛油脂肪酸二乙醇酰胺、烷基烷醇酰胺和棕櫚仁油脂肪酸二乙醇酰胺。其中，油酸二乙醇酰胺、椰子脂肪酸二乙醇酰胺和棕櫚仁油脂肪酸二乙醇酰胺是優(yōu)選的。油酸二乙醇酰胺的具體實(shí)例(市售品)包括stafoamdo和stafoamdos(上述產(chǎn)品由日油社制造)；椰子脂肪酸二乙醇酰胺的具體實(shí)例(市售品)包括stafoamf、stafoamdfc和stafoamdf4(上述產(chǎn)品由日油社制造)；棕櫚仁油脂肪酸二乙醇酰胺的具體實(shí)例(市售品)包括aminonpk-02s和aminonpk-03s(上述產(chǎn)品由花王社制造)。
對(duì)脂肪酸烷醇酰胺在抗原-抗體反應(yīng)中的濃度沒有特別限制，只要它是能夠執(zhí)行本發(fā)明的測量方法的濃度即可，并且為例如0.1％至1.4％。在本發(fā)明中，脂肪酸烷醇酰胺可以單獨(dú)(一種)或以兩種以上的組合使用。
(4)聚氧乙烯非離子型表面活性劑
對(duì)本發(fā)明中的聚氧乙烯非離子型表面活性劑沒有特別限制，只要它能夠使本發(fā)明的測量方法執(zhí)行即可，其實(shí)例包括聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物(在后文中寫成poe·pop共聚物)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(在后文中寫成poe·pop烷基醚)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基苯基醚(在后文中寫成poe·pop烷基苯基醚)、聚氧乙烯聚環(huán)苯基醚(在后文中寫成poe聚環(huán)苯基醚)、聚氧乙烯聚氧丙烯聚環(huán)苯基醚(在后文中寫成poe·pop聚環(huán)苯基醚)或乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物(在后文中寫成乙二胺poe·pop縮合物)。poe·pop共聚物、poe·pop烷基醚和乙二胺poe·pop縮合物是優(yōu)選的，poe·pop共聚物是特別優(yōu)選的。
poe·pop共聚物可以是嵌段共聚物或無規(guī)共聚物。poe·pop共聚物的具體實(shí)例(市售品)包括pronon102、pronon104、pronon201、pronon202b、pronon204、pronon208、pronon403(上述產(chǎn)品由日油社制造)、emulgenpp-230、emulgenpp-250、emulgenpp-290(上述產(chǎn)品由花王社制造)、pluronicl-101、pluronicl-103、pluronicl-121、pluronicl-122和pluronicf-108(上述產(chǎn)品由旭電化工業(yè)社制造)。
poe·pop烷基醚的具體實(shí)例(市售品)包括unilube50mb-168、unilube75de-25、unilube75de-3800、unilubemt-0620b(上述產(chǎn)品由日油社制造)、unisafepka-5015、unisafepka-5016(上述產(chǎn)品由日油社制造)、emalexdape-220、emalexdape-230(上述產(chǎn)品由nihonemulsionco.,ltd.制造)、noigenxl-400和noigenxl-1000f(上述產(chǎn)品由第一工業(yè)制藥社制造)。
poe·pop烷基苯基醚的具體實(shí)例(市售品)包括emulgenl40(由花王社制造)、dispanolkp189-40和dispanolkp189r-40(上述產(chǎn)品由日油社制造)。
poe聚環(huán)苯基醚的具體實(shí)例(市售品)包括newcol714、newcol707、newcol2609、newcol2614(上述產(chǎn)品由日本乳化劑社制造)、emulgena-60、emulgena-90、emulgenb-66(上述產(chǎn)品由花王社制造)、blaunondsp-9、blaunondsp-12.5、blaunontsp-5和blaunontsp-16(上述產(chǎn)品由青木油脂社制造)。
poe·pop聚環(huán)苯基醚的具體實(shí)例(市售品)包括newcol2616f、newcol710-f、newcol2608f、newcol707-f(上述產(chǎn)品由日本乳化劑社制造)、newkalgencp-160和newkalgengp-120(上述產(chǎn)品由竹本油脂社制造)。
乙二胺poe·pop縮合物的具體實(shí)例(市售品)包括乙二胺po40eo40(由日油社制造)和pluronictr-704(由旭電化工業(yè)社制造)。
對(duì)聚氧乙烯非離子型表面活性劑在本發(fā)明的測量方法中的濃度沒有特別限制，只要它是能夠執(zhí)行本發(fā)明的測量方法的濃度即可，并且它是例如0.01％至1％，優(yōu)選為0.05％至0.2％。在本發(fā)明中，聚氧乙烯非離子型表面活性劑可以單獨(dú)(一種)或以兩種以上的組合使用。
(5)膽汁酸衍生物
對(duì)本發(fā)明中的膽汁酸衍生物沒有特別限制，只要它能夠執(zhí)行本發(fā)明的測量即可，其實(shí)例包括具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物和具有非離子型表面活性劑作用的膽汁酸衍生物。具有兩性離子表面活性劑作用的膽汁酸衍生物的實(shí)例包括3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]丙磺酸(在后文中縮寫為chaps)和3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]-2-羥基丙磺酸(在后文中縮寫為chapso)。
具有非離子型表面活性劑功能的膽汁酸衍生物的實(shí)例包括n,n-雙(3-d-葡萄糖酰胺丙基)膽酰胺(在后文中縮寫為bigchap)和n,n-雙(3-d-葡萄糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺(在后文中縮寫為脫氧-bigchap)。
膽汁酸衍生物在本發(fā)明的測量方法中的使用濃度在1至50倍臨界膠束濃度(cmc)的范圍內(nèi)，具體來說，1至10倍cmc濃度是優(yōu)選的。在本發(fā)明中，膽汁酸衍生物可以單獨(dú)(一種)或以兩種以上的組合使用。
(6)抗體和標(biāo)記的抗體
對(duì)本發(fā)明中的抗體沒有特別限制，只要它們是與待測成分特異性結(jié)合的抗體即可，并且盡管多克隆抗體和單克隆抗體兩者都可以使用，但優(yōu)選為單克隆抗體。此外，在本發(fā)明中使用的抗體可以是fc部分被移除的抗體片段，例如通過抗體的木瓜蛋白酶處理而獲得的fab、通過抗體的胃蛋白酶處理而獲得的f(ab’)2以及通過抗體的胃蛋白酶處理和還原處理而獲得的fab’。作為抗體片段，f(ab’)2是優(yōu)選的。
本發(fā)明中的抗體可以使用待測成分或與其表位相對(duì)應(yīng)的肽作為抗原，通過標(biāo)準(zhǔn)方法來獲得，并且它也可以商購。
在待測成分時(shí)mxa蛋白的情況下，與mxa蛋白特異性結(jié)合的抗體的實(shí)例包括分別由雜交瘤細(xì)胞系km1122、km1123、km1124(fermbp-4729)、km1125、km1126、km1127、km1128、km1129、km1130、km1131、km1132(fermbp-4730)、km1133、km1134和km1135(fermbp-4731)產(chǎn)生的抗人類mxa蛋白單克隆抗體km1122、km1123、km1124、km1125、km1126、km1127、km1128、km1129、km1130、km1131、km1132、km1133、km1134和km1135，其描述在國際公布wo96/05230號(hào)中。
本發(fā)明中的標(biāo)記的抗體是可在本發(fā)明的測量方法中使用，并且可以通過后面描述的方法，使用前面提到的抗體和下面描述的標(biāo)記物質(zhì)產(chǎn)生的抗體。
(7)測量方法
本發(fā)明的測量方法是用于測量待測成分的方法，所述方法包含在脂肪酸烷醇酰胺存在下，將樣本中的待測成分與結(jié)合所述待測成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)；然后與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)以形成包含第一抗體、待測成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上；并且測量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量。此外，本發(fā)明的測量方法是用于測量待測成分的方法，所述方法包含將樣本中的待測成分與結(jié)合所述待測成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)；然后在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)，以形成包含第一抗體、待測成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上；并且測量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量。本發(fā)明的測量方法的具體實(shí)施方案如下所述。
(1)一種方法，其包含：在脂肪酸烷醇酰胺存在下，將待測成分與結(jié)合所述待測成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)(第一反應(yīng)步驟)；然后與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)(第二反應(yīng)步驟)，以形成包含第一抗體、待測成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上；以及測量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量(檢測步驟)。
(2)一種方法，其包含：將待測成分與結(jié)合所述待測成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)(第一反應(yīng)步驟)；然后在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下，與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)(第二反應(yīng)步驟)，以形成包含第一抗體、待測成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上；以及測量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量(檢測步驟)。
(3)一種方法，其包含：在脂肪酸烷醇酰胺存在下將待測成分與結(jié)合所述待測成分的第一抗體進(jìn)行反應(yīng)(第一反應(yīng)步驟)；然后在聚氧乙烯非離子型表面活性劑存在下與標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)(第二反應(yīng)步驟)，以形成包含第一抗體、待測成分和標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上；以及測量形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量(檢測步驟)。
在上面提到的(1)至(3)中，第一反應(yīng)步驟可以在添加膽汁酸衍生物下執(zhí)行。
在上面提到的(1)至(3)中，在第一反應(yīng)步驟中形成待測成分與第一抗體的免疫復(fù)合物。在第二反應(yīng)步驟中，標(biāo)記的第二抗體與第一反應(yīng)步驟中形成的第一抗體與待測成分的免疫復(fù)合物反應(yīng)，并形成第一抗體、待測成分與標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物。在檢測步驟中，測量在第二反應(yīng)步驟中形成的第一抗體、待測成分與標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量?？梢酝ㄟ^使用作為具有已知濃度的待測成分的標(biāo)準(zhǔn)材料來執(zhí)行類似測量，產(chǎn)生顯示出濃度與源自于標(biāo)記物的信息的量之間的關(guān)系的校準(zhǔn)曲線，并將檢測步驟中測定的標(biāo)記物的量與產(chǎn)生的校準(zhǔn)曲線相關(guān)聯(lián)，來確定所用樣本中待測成分的濃度。
標(biāo)準(zhǔn)材料可以從生物樣品制備，它也可以使用通過遺傳重組方法生產(chǎn)的重組抗原來制備。標(biāo)準(zhǔn)材料可以采取任何形式，例如溶液形式或冷凍干燥形式，并且取決于形式，它可以在使用時(shí)將其溶解在下面所述的水性介質(zhì)等中之后使用。此外，當(dāng)制備標(biāo)準(zhǔn)材料時(shí)，可以使用下面描述的水性介質(zhì)、金屬離子、鹽、糖、表面活性劑、蛋白、蛋白穩(wěn)定劑等。
在上面提到的(1)和(3)的測量方法中，可以通過預(yù)先將樣本與脂肪酸烷醇酰胺混合、或?qū)颖九c脂肪酸烷醇酰胺和膽汁酸衍生物混合，對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，然后將預(yù)處理的樣本與第一抗體進(jìn)行反應(yīng)。在上面提到的(2)的測量方法中，可以通過預(yù)先將樣本與膽汁酸衍生物混合，對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，然后將預(yù)處理的樣本與第一抗體進(jìn)行反應(yīng)。
本發(fā)明的測量方法可以適用于干化學(xué)或溶液中的反應(yīng)。對(duì)第一反應(yīng)步驟和第二反應(yīng)步驟中的反應(yīng)溫度沒有特別限制，只要它是能夠執(zhí)行本發(fā)明的測量方法的反應(yīng)溫度即可，并且是例如0℃至50℃，優(yōu)選為4℃至40℃。對(duì)反應(yīng)時(shí)間沒有特別限制，只要它是能夠執(zhí)行本發(fā)明的測量方法的反應(yīng)時(shí)間即可，并可以是例如1分鐘至72小時(shí)，優(yōu)選為5分鐘至20小時(shí)。
在第一反應(yīng)步驟與第二反應(yīng)步驟之間可以設(shè)置或可以不設(shè)置清洗步驟，并優(yōu)選設(shè)置清洗步驟。此外，在第二反應(yīng)步驟與檢測步驟之間可以設(shè)置或可以不設(shè)置清洗步驟，并優(yōu)選設(shè)置清洗步驟。第一抗體可以被固定化不動(dòng)化)或可以不被固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上，并且它優(yōu)選被固定化(不動(dòng)化)。如果第一抗體被固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上，在第一反應(yīng)步驟后清洗不溶性載體，能夠?qū)⒌谝环磻?yīng)步驟中形成的第一抗體與待測成分的免疫復(fù)合物與未反應(yīng)的成分(源自于樣本的成分、過量的第一抗體等)分離開。同樣地，在第二反應(yīng)步驟后清洗不溶性載體，能夠?qū)⒌诙磻?yīng)步驟中形成的第一抗體、待測成分與標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物與未反應(yīng)成分(過量的標(biāo)記的第二抗體等)分離開。清洗溶液的實(shí)例包括磷酸鹽緩沖鹽水[含有0.15mol/l氯化鈉的10mmol/l磷酸鹽緩沖液，ph7.2(在后文中標(biāo)為pbs)]、含有表面活性劑的pbs以及下面描述的水性介質(zhì)。表面活性劑的實(shí)例包括非離子型表面活性劑例如tween20。
對(duì)不溶性載體沒有特別限制，只要它能夠固定化(不動(dòng)化)第一抗體并能夠執(zhí)行抗原-抗體反應(yīng)和檢測反應(yīng)即可。用于不溶性載體的優(yōu)選材料的實(shí)例包括聚合物材料例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯、明膠、瓊脂糖、纖維素、硝酸纖維素、醋酸纖維素、乙酰纖維素和聚對(duì)苯二甲酸乙二酯；玻璃；陶瓷；磁性粒子和金屬。不溶性載體的優(yōu)選形狀的實(shí)例包括管、珠子、板、微粒例如膠乳、棒等，優(yōu)選的是每塊板具有96個(gè)孔的聚苯乙烯微量滴定板等。
將第一抗體固定化(不動(dòng)化)于不溶性載體的方法包括已知方法，例如使用物理鍵的方法、使用化學(xué)鍵的方法或其組合。物理鍵的實(shí)例包括靜電鍵、氫鍵和疏水鍵。化學(xué)鍵的實(shí)例包括共價(jià)鍵和配位鍵。當(dāng)使用聚苯乙烯微量滴定板作為不溶性載體時(shí)，實(shí)例包括向板的孔加入第一抗體的溶液、然后在4℃至30℃下溫育1小時(shí)至1天以進(jìn)行物理吸附的固定方法。
第一抗體可以被直接或間接固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上。間接固定化(不動(dòng)化)的實(shí)例包括向固定有親和素的不溶性載體添加生物素化第一抗體的溶液、并將第一抗體通過生物素與親和素之間的特異性結(jié)合固定在不溶性載體上的方法。此外，可以將與第一抗體特異性結(jié)合的抗體固定在不溶性載體上，并可以通過該抗體將第一抗體固定在不溶性載體上。或者，可以將第一抗體經(jīng)接頭通過共價(jià)鍵固定在不溶性載體上。接頭是例如能夠與第一抗體上的官能團(tuán)和不溶性載體表面上的官能團(tuán)兩者共價(jià)結(jié)合的分子。優(yōu)選的是在同一分子內(nèi)帶有能夠與第一抗體的官能團(tuán)反應(yīng)的第一反應(yīng)性基團(tuán)和能夠與不溶性載體表面上的官能團(tuán)反應(yīng)的第二反應(yīng)性基團(tuán)的分子，其中特別優(yōu)選的是第一反應(yīng)性基團(tuán)和第二反應(yīng)性基團(tuán)是不同基團(tuán)的分子。第一抗體的官能團(tuán)和不溶性載體表面上的官能團(tuán)的實(shí)例包括羧基、氨基、縮水甘油基、巰基、羥基、酰胺基、亞氨基、n-羥基琥珀?；婉R來酰亞胺基。接頭上的反應(yīng)性基團(tuán)的實(shí)例包括基團(tuán)例如芳基疊氮化物、碳二亞胺、酰肼、醛、羥甲基膦、酰亞胺酯、異氰酸酯、馬來酰亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)酯、五氟苯基(pfp)酯、補(bǔ)骨脂、吡啶基二硫化物和乙烯砜。
當(dāng)?shù)谝豢贵w不被固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上時(shí)，可以將第一反應(yīng)步驟后的反應(yīng)溶液流過其上固定化(不動(dòng)化)有能夠與第一抗體反應(yīng)的物質(zhì)的不溶性載體，然后可以通過清洗不溶性載體將包含第一抗體和待測成分的免疫復(fù)合物與未反應(yīng)的成分(源自于樣本的成分、過量的第一抗體等)分離開?？梢酝ㄟ^與前面提到的用于將第一抗體固定化(不動(dòng)化)于不溶性載體的方法類似的方法，將能夠與第一抗體反應(yīng)的物質(zhì)固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上。
用于標(biāo)記第二抗體的標(biāo)記物質(zhì)的實(shí)例包括酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素、生物素、洋地黃毒甙、含有標(biāo)簽序列的多肽、金屬膠體粒子和著色乳膠粒子。酶的實(shí)例包括堿性磷酸酶、過氧化物酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酸酶和螢光素酶。熒光物質(zhì)的實(shí)例包括熒光素異硫氰酸酯(fitc)和羅丹明b-異硫氰酸酯(ritc)。其他熒光物質(zhì)的實(shí)例包括量子點(diǎn)(science,281,2016-2018,1998)、藻膽蛋白類例如藻紅蛋白，以及發(fā)射熒光的蛋白例如綠色熒光蛋白(gfp)、紅色熒光蛋白(rfp)、黃色熒光蛋白(yfp)和藍(lán)色熒光蛋白(bfp)。發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括吖啶及其衍生物、釕絡(luò)合化合物和洛粉堿。對(duì)于釕絡(luò)合化合物來說，優(yōu)選的是在clin.chem.37,9,1534-1539,1991中描述的與電子供體一起電化學(xué)發(fā)光的化合物。放射性同位素的實(shí)例包括3h、14c、35s、32p、125i和131i。
含有標(biāo)簽序列的多肽的實(shí)例包括flag肽(flag標(biāo)簽，asptyrlysaspaspaspasplys)、聚組氨酸(his標(biāo)簽，hishishishishishis)、myc表位肽(myc標(biāo)簽，gluglnlysleuileserglugluaspleu)和凝血素表位肽(ha標(biāo)簽，tyrprotyraspvalproasptyrala)。
可以通過在第二抗體的官能團(tuán)與標(biāo)記物質(zhì)的官能團(tuán)之間使用或不使用接頭進(jìn)行形成共價(jià)鍵的反應(yīng)，來執(zhí)行第二抗體的標(biāo)記。官能團(tuán)的實(shí)例包括羧基、氨基、縮水甘油基、巰基、羥基、酰胺基、亞氨基、羥基琥珀酰酯基、馬來酰亞胺基和異硫氰酸酯基。可以在這些官能團(tuán)之間執(zhí)行縮合反應(yīng)。
不使用接頭的連接方法的實(shí)例包括使用碳二亞胺化合物例如edc的方法。在這種情形中，可以使用活性酯例如nhs或其衍生物。優(yōu)選的是異硫氰酸酯基團(tuán)與氨基之間的縮合反應(yīng)，因?yàn)樗恍杵渌噭?，并且通過在中性至弱堿性條件下進(jìn)行混合而簡單進(jìn)行。
接頭的實(shí)例包括具有與第二抗體的官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)和與標(biāo)記物質(zhì)的官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)兩者的分子。接頭優(yōu)選為在同一分子內(nèi)具有與第二抗體的氨基酸殘基反應(yīng)的第一官能團(tuán)和與標(biāo)記物質(zhì)的官能團(tuán)反應(yīng)的第二官能團(tuán)的分子。其中特別優(yōu)選的是第一官能團(tuán)是與第二官能團(tuán)不同的基團(tuán)的分子。接頭的官能團(tuán)的實(shí)例包括上面描述的官能團(tuán)。
用于化學(xué)連接放射性同位素的方法的實(shí)例，包括在文獻(xiàn)(antibodyimmunoconj.radiopharm.,3,60,1990)中描述的方法。
在標(biāo)記物質(zhì)是多肽例如酶、親和素、發(fā)射熒光的蛋白、藻膽蛋白和含有標(biāo)簽序列的多肽的情形中，可以按照已知的遺傳重組技術(shù)(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(molecularcloning:alaboratorymanual)，第三版，coldspringharborlaboratorypress，2001)，通過產(chǎn)生含有標(biāo)記物質(zhì)與抗體的融合蛋白的編碼dna的表達(dá)載體，將表達(dá)載體導(dǎo)入適合的宿主并對(duì)宿主進(jìn)行培養(yǎng)，來進(jìn)行生產(chǎn)?？梢酝ㄟ^使用pcr等克隆各種編碼抗體的dna和編碼標(biāo)記物質(zhì)的dna，并通過連接酶反應(yīng)將每個(gè)dna連接，來獲得編碼融合蛋白的dna。
在檢測步驟中，測量在第二反應(yīng)步驟中形成的第一抗體、待測成分與標(biāo)記的第二抗體的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量?？梢愿鶕?jù)用于測量標(biāo)記物量的標(biāo)記物質(zhì)來選擇適合的方法。在標(biāo)記物質(zhì)是著色物質(zhì)、即吸收某種波長的光的物質(zhì)的情形中，可以使用分光光度計(jì)、多孔板讀板器等。在標(biāo)記物質(zhì)是熒光物質(zhì)的情形中，可以使用熒光分光光度計(jì)、熒光多孔板讀板器等。當(dāng)標(biāo)記物質(zhì)是發(fā)光物質(zhì)時(shí)，可以使用發(fā)光光度計(jì)、發(fā)光多孔板讀板器等。在標(biāo)記物質(zhì)是放射性同位素的情形中，，可以通過使用閃爍計(jì)數(shù)器、γ-孔計(jì)數(shù)器等測量放射活性來測定放射性同位素的量。
在標(biāo)記物是酶的情形中，測量標(biāo)記物的量意味著測量酶活性。可以通過將酶的底物與酶進(jìn)行反應(yīng)并測量形成的產(chǎn)物，來測量標(biāo)記物的量。在酶是過氧化物酶的情形中，可以通過例如吸光度方法、熒光方法、發(fā)光方法等來測量過氧化物酶活性。通過吸光度方法測量過氧化物酶活性的方法的實(shí)例，包括將過氧化物酶與過氧化物酶底物組合過氧化氫和氧化性著色發(fā)色團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)并使用分光光度計(jì)、多孔板讀板器等來測量反應(yīng)溶液的吸光度的方法。氧化性著色發(fā)色團(tuán)的實(shí)例包括隱色體類型的發(fā)色團(tuán)和氧化偶聯(lián)產(chǎn)色的發(fā)色團(tuán)。
隱色體類型的發(fā)色團(tuán)是在過氧化氫和過氧化物質(zhì)例如過氧化物酶存在下自身轉(zhuǎn)變成染料的物質(zhì)。其具體實(shí)例包括四甲基聯(lián)苯胺、鄰苯二胺、10-n-羧甲基氨甲?；?3,7-雙(二甲基氨基)-10h-吩噻嗪(ccap)、10-n-甲基氨甲?；?3,7-雙(二甲基氨基)-10h-吩噻嗪(mcdp)、n-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-雙(二甲基氨基)二苯胺鈉鹽(da-64)、4,4’-雙(二甲基氨基)二苯胺和雙[3-雙(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(bcma)。
氧化偶聯(lián)產(chǎn)色的發(fā)色團(tuán)是在過氧化氫和過氧化物質(zhì)例如過氧化物酶存在下通過兩種化合物的氧化偶聯(lián)形成染料的物質(zhì)。兩種化合物的組合的實(shí)例包括成色劑與苯胺化合物的組合(trinder試劑)、以及成色劑與苯酚化合物的組合。成色劑的實(shí)例包括4-氨基安替比林(4-aa)和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙。苯胺化合物的實(shí)例包括n-(3-磺丙基)苯胺、n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(toos)、n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(maos)、n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(daos)、n-乙基-n-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(tops)、n-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(hdaos)、n,n-二甲基-3-甲基苯胺、n,n-二(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、n-乙基-n-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、n-乙基-n-(3-磺丙基)苯胺、n-乙基-n-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、n-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、n-乙基-n-(3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺、n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、n-乙基-n-(3-甲基苯基)-n’-琥珀酰基乙二胺(emse)、n-乙基-n-(3-甲基苯基)-n’-乙?；叶泛蚽-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺(f-daos)。苯酚化合物的實(shí)例包括苯酚、4-氯苯酚、3-甲酚和3-羥基-2,4,6-三碘苯甲酸(htib)。
通過熒光方法測量過氧化物酶活性的方法的實(shí)例，包括將過氧化物酶與過氧化物酶底物組合過氧化氫和熒光物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)并使用熒光分光光度計(jì)、熒光多孔板讀板器等來測量產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的方法。熒光物質(zhì)的實(shí)例包括4-羥基苯基乙酸、3-(4-羥基苯基)丙酸和香豆素。
通過發(fā)光方法測量過氧化物酶活性的方法的實(shí)例，包括將過氧化物酶與過氧化物酶的底物組合過氧化氫和發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)并使用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)、發(fā)光多孔板讀板器等來測量產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度的方法。發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括魯米諾化合物和光澤精化合物。
在酶是堿性磷酸酶的情形中，可以通過例如發(fā)光方法來測量堿性磷酸酶活性。通過發(fā)光方法測量堿性磷酸酶活性的方法的實(shí)例，包括將堿性磷酸酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)，并使用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)、發(fā)光多孔板讀板器等來測量產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度的方法。堿性磷酸酶的底物的實(shí)例包括3-(2’-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧雜環(huán)丁烷二鈉鹽(amppd)、2-氯-5-{4-甲氧基螺[1,2-二氧雜環(huán)丁烷-3,2’-(5’-氯)三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基}苯基磷酸二鈉鹽(cdp-startm)、3-{4-甲氧基螺[1,2-二氧雜環(huán)丁烷-3,2’-(5’-氯)三環(huán)[3.3.1.13,7]癸]-4-基}苯基磷酸二鈉鹽(cspdtm)和[10-甲基-9(10h)-亞吖啶基]苯氧基甲基磷酸二鈉鹽(lumigentmaps-5)。
在酶是β-d-半乳糖苷酶的情形中，可以通過例如吸光度方法(比色方法)、發(fā)光方法或熒光方法來測量β-d-半乳糖苷酶活性。通過吸光度方法(比色方法)測量β-d-半乳糖苷酶活性的方法的實(shí)例，包括使用鄰硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷的方法。通過發(fā)光方法測量β-d-半乳糖苷酶活性的方法的實(shí)例，包括將β-d-半乳糖苷酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)并使用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)、發(fā)光多孔板讀板器等來測量反應(yīng)溶液的發(fā)光的方法。β-d-半乳糖苷酶的底物的實(shí)例包括galacton-plus(由appliedbiosystems制造)及其類似物。通過熒光方法測量β-d-半乳糖苷酶的方法的實(shí)例，包括將β-d-半乳糖苷酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)并使用熒光分光光度計(jì)、熒光多孔板讀板器等來測量反應(yīng)溶液的熒光的方法。β-d-半乳糖苷酶的底物的實(shí)例包括4-甲基傘形酮基-β-d-吡喃半乳糖苷。
在酶是螢光素酶的情形中，可以通過例如發(fā)光方法來測量螢光素酶活性。通過發(fā)光方法測量螢光素酶活性的方法的實(shí)例，包括將螢光素酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)并使用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)、發(fā)光多孔板讀板器等來測量反應(yīng)溶液的發(fā)光的方法。螢光素酶底物的實(shí)例包括螢光素和腔腸素。
當(dāng)標(biāo)記物質(zhì)是熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素或酶之外的物質(zhì)(被稱為物質(zhì)a)時(shí)，標(biāo)記的物質(zhì)b是與物質(zhì)a特異性結(jié)合并用熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素、酶等標(biāo)記的物質(zhì)(物質(zhì)b)，將其與在第二反應(yīng)步驟中形成的第一抗體、待測成分與標(biāo)記的第二抗體(即用物質(zhì)a標(biāo)記的第二抗體)的免疫復(fù)合物進(jìn)行反應(yīng)，以形成第一抗體、待測成分、標(biāo)記的第二抗體(即用物質(zhì)a標(biāo)記的第二抗體)與標(biāo)記的物質(zhì)b的免疫復(fù)合物；然后可以通過用上面提到的方法測量該形成的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量，來測量樣本中的待測成分。物質(zhì)b的實(shí)例包括針對(duì)物質(zhì)a的抗體、親和素(當(dāng)物質(zhì)a是生物素時(shí))、鏈親合素(當(dāng)物質(zhì)a是生物素時(shí))和生物素(當(dāng)物質(zhì)a是親和素或鏈親合素時(shí))。針對(duì)物質(zhì)a的抗體可以是抗體片段，抗體片段的實(shí)例包括上面提到的fab、f(ab’)2和fab’。
同時(shí)，本發(fā)明的測量方法(1)和(2)的第一反應(yīng)步驟也可應(yīng)用于競爭方法。具體來說，可以提出下面的實(shí)施方案作為競爭方法的實(shí)例：
(4)一種方法，其包含：在脂肪酸烷醇酰胺存在下，將待測成分與標(biāo)記物結(jié)合于競爭性物質(zhì)上的標(biāo)記的競爭性物質(zhì)和結(jié)合待測成分和標(biāo)記的競爭性物質(zhì)兩者的抗體進(jìn)行反應(yīng)(競爭性反應(yīng)步驟)；并測量形成的標(biāo)記的競爭性物質(zhì)與抗體的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量(檢測步驟)。
(5)一種方法，其包含：在脂肪酸烷醇酰胺存在下，將待測成分與競爭性物質(zhì)和標(biāo)記的抗體進(jìn)行反應(yīng)，其中標(biāo)記物被結(jié)合于與待測成分和競爭性物質(zhì)兩者相結(jié)合的抗體(競爭性反應(yīng)步驟)；并測量形成的競爭性物質(zhì)與標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物中標(biāo)記物的量(檢測步驟)。
競爭性反應(yīng)步驟可以在添加膽汁酸衍生物下執(zhí)行。在競爭性反應(yīng)步驟與檢測步驟之間可以設(shè)置或可以不設(shè)置清洗步驟，并優(yōu)選設(shè)置清洗步驟。清洗步驟的實(shí)例包括在上面提到的測定方法(1)至(3)中的清洗步驟。
在上面提到的(4)的方法中，與待測成分和標(biāo)記的競爭性物質(zhì)兩者相結(jié)合的抗體可以被或可以不被固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上，并且它優(yōu)選被固定化(不動(dòng)化)。此外，在上面提到的(5)的方法中，競爭性物質(zhì)可以被或可以不被固定化(不動(dòng)化)在不溶性載體上，并且它優(yōu)選被固定化(不動(dòng)化)。
競爭性反應(yīng)步驟可以在存在或不存在水性介質(zhì)下執(zhí)行，并優(yōu)選在存在水性介質(zhì)下執(zhí)行。水性介質(zhì)的實(shí)例包括下面描述的水性介質(zhì)等。在這里，競爭性物質(zhì)是指能夠與“結(jié)合待測成分的抗體”結(jié)合并且其結(jié)合與待測成分是競爭性的物質(zhì)，包括待測成分本身。當(dāng)通過競爭方法測量樣本中的待測成分時(shí)，使用競爭性物質(zhì)。因此，在競爭方法中使用的與待測成分結(jié)合的抗體，是與待測成分和競爭性物質(zhì)結(jié)合的抗體，并且盡管它通過與待測成分結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，但它也通過與競爭性物質(zhì)結(jié)合而形成免疫復(fù)合物。
競爭性物質(zhì)優(yōu)選為具有與結(jié)合于所述成分的抗體所識(shí)別的表位一致的結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。此外，優(yōu)選競爭性物質(zhì)對(duì)結(jié)合于待測成分的抗體的結(jié)合強(qiáng)度，與所述成分對(duì)抗體的結(jié)合強(qiáng)度相當(dāng)。待測成分自身優(yōu)選作為競爭性物質(zhì)?？梢允褂酶偁幮晕镔|(zhì)和前面提到的標(biāo)記物質(zhì)，通過與用于前面提到的標(biāo)記的第二抗體相似的方法來制備標(biāo)記的競爭性物質(zhì)。
在本發(fā)明中使用的水性介質(zhì)的實(shí)例包括去離子水、蒸餾水和緩沖液，優(yōu)選為緩沖液。對(duì)用于制備緩沖液的緩沖劑沒有特別限制，只要它具有緩沖能力即可。緩沖劑的實(shí)例包括具有ph1至11的緩沖劑，例如乳酸緩沖劑、檸檬酸緩沖劑、乙酸緩沖劑、琥珀酸緩沖劑、鄰苯二甲酸緩沖劑、磷酸緩沖劑、三乙醇胺緩沖劑、二乙醇胺緩沖劑、賴氨酸緩沖劑、巴比妥酸緩沖劑、咪唑緩沖劑、蘋果酸緩沖劑、草酸緩沖劑、甘氨酸緩沖劑、硼酸緩沖劑、碳酸緩沖劑、甘氨酸緩沖劑或good’s緩沖劑。
good’s緩沖劑的實(shí)例包括2-嗎啉乙磺酸(mes)緩沖劑、雙(2-羥基乙基)亞氨基三(羥基甲基)甲烷(bis-tris)緩沖劑、三(羥基甲基)氨基甲烷(tris)緩沖劑、n-(2-乙酰胺基)亞氨基二乙酸(ada)緩沖劑、哌嗪-n,n’-雙(2-乙磺酸)(pipes)緩沖劑、2-[n-(2-乙酰胺基)氨基]乙磺酸(aces)緩沖劑、3-嗎啉-2-羥基丙磺酸(mopso)緩沖劑、2-[n,n-雙(2-羥基乙基)氨基]乙磺酸(bes)緩沖劑、3-嗎啉丙磺酸(mops)緩沖劑、2-{n-[三(羥基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(tes)緩沖劑、n-(2-羥基乙基)-n’-(2-磺乙基)哌嗪(hepes)緩沖劑、3-[n,n-雙(2-羥基乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(dipso)緩沖劑、2-羥基-3-{[n-三(羥基甲基)甲基]氨基}丙磺酸(tapso)緩沖劑、哌嗪-n,n’-雙(2-羥基丙-3-磺酸)(popso)緩沖劑、n-(2-羥基乙基)-n’-(2-羥基-3-磺丙基)哌嗪(heppso)緩沖劑、n-(2-羥基乙基)-n’-(3-磺丙基)哌嗪(epps)緩沖劑、tricine[n-三(羥基甲基)甲基甘氨酸]緩沖劑、vicine[n,n-雙(2-羥基乙基)甘氨酸]緩沖劑、3-[n-三(羥基甲基)甲基]氨基丙磺酸(taps)緩沖劑、2-(n-環(huán)己基氨基)乙磺酸(ches)緩沖劑、3-(n-環(huán)己基氨基)-2-羥基丙磺酸(capso)緩沖劑和3-(n-環(huán)己基氨基)丙磺酸(caps)緩沖劑。
對(duì)緩沖液的濃度沒有特別限制，只要它是適合于測量的濃度即可，并優(yōu)選為0.001至2.0mol/l，更優(yōu)選為0.005至1.0mol/l，特別優(yōu)選為0.01至0.1mol/l。
在本發(fā)明的測量方法中，可以共同存在金屬離子、鹽、糖、防腐劑、蛋白質(zhì)、蛋白穩(wěn)定劑等。金屬離子的實(shí)例包括鎂離子、錳離子和鋅離子。鹽的實(shí)例包括氯化鈉和氯化鉀。糖的實(shí)例包括甘露糖醇和山梨糖醇。防腐劑的實(shí)例包括疊氮化鈉、抗生素(鏈霉素、青霉素、慶大霉素等)、bioace、proclin300和proxelgxl。蛋白質(zhì)的實(shí)例包括牛血清白蛋白(bsa)、胎牛血清(fbs)、酪蛋白和blockace(由dainipponpharmaceuticalco.,ltd.制造)。蛋白穩(wěn)定劑的實(shí)例包括過氧化物酶穩(wěn)定化緩沖液(peroxidasestabilizingbuffer，由dakocytomation制造)。
(8)用于測量的試劑盒
本發(fā)明的用于測量的試劑盒是用于免疫測量樣本中的待測成分的試劑盒，并且可用于本發(fā)明的測量方法。
本發(fā)明的測量用試劑盒是包含如下物質(zhì)的測量用試劑盒：包含與待測成分相結(jié)合的第一抗體和脂肪酸烷醇酰胺的第一試劑；以及包含標(biāo)記的第二抗體的第二試劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上。此外，本發(fā)明的測量用試劑盒是包含如下物質(zhì)的測量用試劑盒：包含與待測成分相結(jié)合的第一抗體的第一試劑；以及包含標(biāo)記的第二抗體和聚氧乙烯非離子型表面活性劑的第二試劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上。本發(fā)明的測量用試劑盒的具體實(shí)施方案如下所示。
(1)一種用于測量樣本中的待測成分的試劑盒，其包含：包含與待測成分相結(jié)合的第一抗體和脂肪酸烷醇酰胺的第一試劑；以及包含標(biāo)記的第二抗體的第二試劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上。
(2)一種用于測量樣本中的待測成分的試劑盒，其包含：包含與待測成分相結(jié)合的第一抗體的第一試劑；以及包含標(biāo)記的第二抗體和聚氧乙烯非離子型表面活性劑的第二試劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上。
(3一種用于測量樣本中的待測成分的試劑盒，其包含：包含與待測成分相結(jié)合的第一抗體和脂肪酸烷醇酰胺的第一試劑；以及包含標(biāo)記的第二抗體和聚氧乙烯非離子型表面活性劑的第二試劑，其中標(biāo)記物被結(jié)合到與所述待測成分相結(jié)合的第二抗體上。
第一試劑可以含有膽汁酸衍生物。
在上面提到的(1)和(3)的試劑盒中，第一試劑可以采取將包含脂肪酸烷醇酰胺的試劑[第一試劑(a)]與包含與待測成分相結(jié)合的第一抗體的試劑[第一試劑(b)]分開儲(chǔ)存的形式。在上面提到的(1)和(3)的試劑盒中，當(dāng)?shù)谝辉噭┲邪懼嵫苌飼r(shí)，第一試劑可以采取將包含脂肪酸烷醇酰胺和膽汁酸衍生物的試劑[第一試劑(a)]與包含與待測成分相結(jié)合的第一抗體的試劑[第一試劑(b)]分開儲(chǔ)存的形式。在上面提到的(2)的試劑盒中，當(dāng)?shù)谝辉噭┲邪懼嵫苌飼r(shí)，第一試劑可以采取將包含膽汁酸衍生物的試劑[第一試劑(a)]與包含與待測成分相結(jié)合的第一抗體的試劑[第一試劑(b)]分開儲(chǔ)存的形式。在這里，第一試劑(a)可以用作樣本預(yù)處理溶液。
本發(fā)明的試劑盒的形式可以是任何形式，例如溶液形式或冷凍干燥形式。本發(fā)明的試劑盒的各第一抗體、標(biāo)記的第二抗體、脂肪酸烷醇酰胺、聚氧乙烯非離子型表面活性劑和膽汁酸衍生物的實(shí)例，包括上文提到的那些。此外，如果需要，本發(fā)明的試劑盒可以包括前面提到的水性介質(zhì)、金屬離子、鹽、糖、防腐劑、蛋白質(zhì)、蛋白穩(wěn)定劑等。
在下文中，將參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，所述實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
[實(shí)施例1]
[1]抗mxa蛋白單克隆抗體的制備
如下所述，制備了兩種類型的具有不同表位的抗人類mxa蛋白單克隆抗體km1124(wo96/05230)和km1135(wo96/05230)。km1124是與人類mxa蛋白從氨基端算起220至297位殘基中存在的表位相結(jié)合的小鼠單克隆抗體，km1135是與人類mxa蛋白從氨基端算起10至220位殘基中存在的表位相結(jié)合的小鼠單克隆抗體。
將產(chǎn)生單克隆抗體km1124的雜交瘤細(xì)胞系km1124(fermbp-4729)和產(chǎn)生單克隆抗體km1135的雜交瘤細(xì)胞系km1135(fermbp-4731)，以5至20x106個(gè)細(xì)胞/動(dòng)物的量分別腹膜內(nèi)注射到降植烷處理過的8周齡雌性裸小鼠(balb/c)中。在10至21天后，雜交瘤細(xì)胞系在腹水中成癌，并從蓄積腹水液的小鼠收集腹水液。將收集的腹水液以3000rpm離心5分鐘以除去固形物，并收集上清液。將從這些上清液通過辛酸沉淀方法(《抗體實(shí)驗(yàn)指南》(antibodies-alaboratorymanual)，coldspringharborlaboratory，1988)純化的單克隆抗體，用于免疫測量mxa蛋白的方法中。
[2]重組mxa蛋白的制備
使用通過在pet-14b載體(由novagen,emdbiosciences制造)的ndei和bamhi之間插入含有編碼人類mxa蛋白的cdna(基于genbank中登記為bc032602的核苷酸序列制備)的ndei-bamhi片段而產(chǎn)生的人類mxa蛋白表達(dá)載體pet14b-mxa，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(escherichiacoli)bl21(de3)plyss株。該轉(zhuǎn)化體表達(dá)n-端添加有his標(biāo)簽的mxa蛋白。
將獲得的轉(zhuǎn)化體接種在5ml含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中，在37℃下執(zhí)行振搖培養(yǎng)，直到600nm處的光密度(od600)達(dá)到0.5。將該培養(yǎng)液接種到250ml含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中，并在37℃下執(zhí)行振搖培養(yǎng)，直到600nm處的光密度達(dá)到0.3至0.5。向該培養(yǎng)液加入終濃度為0.4mmol/l的異丙基硫代半乳糖苷(iptg)，并將培養(yǎng)在37℃振搖下繼續(xù)執(zhí)行2小時(shí)。將獲得的培養(yǎng)液在4℃以3000rpm離心10分鐘，以收集細(xì)菌細(xì)胞。在mxa蛋白制備之前將細(xì)菌細(xì)胞儲(chǔ)存在-80℃。
由于mxa蛋白以包含體形式存在于細(xì)菌細(xì)胞中，因此將細(xì)菌細(xì)胞在冰上融化，并加入20ml冰冷的結(jié)合緩沖液(5mmol/l咪唑，0.5mol/l氯化鈉，20mmol/ltris-hcl，ph7.9)以得到懸液。對(duì)細(xì)菌細(xì)胞懸液進(jìn)行5次30秒的超聲處理以破碎細(xì)胞，然后在4℃以4000rpm離心10分鐘。除去上清液，并將沉淀懸浮在20ml添加的冰冷的結(jié)合緩沖液中。同樣地再次執(zhí)行超聲處理和離心。除去上清液，向沉淀加入20ml含有6mol/l尿素的結(jié)合緩沖液，以得到懸液。在同樣的超聲處理后，將混合物留置冰上30分鐘以溶解包含體，然后在4℃以10,000rpm離心30分鐘。收集上清液，然后通過0.45-nmmillipore濾器過濾。
向獲得的溶液加入0.5mlni-ntahis·bind樹脂(由novagen,emdbiosciences制造)，然后在4℃旋轉(zhuǎn)2小時(shí)下整體混合，使mxa蛋白通過his標(biāo)簽與樹脂結(jié)合。將該混合物在4℃以3000rpm離心2分鐘以回收樹脂。在向樹脂添加10ml冰冷的含6mol/l尿素的結(jié)合緩沖液后，整體在4℃以3000rpm離心2分鐘以回收樹脂。在重復(fù)該清洗操作后，進(jìn)一步向樹脂添加10ml冰冷的清洗緩沖液(6mol/l尿素，60mmol/l咪唑，0.5mol/l氯化鈉，20mmol/ltris-hcl，ph7.9)，并整體在4℃以3000rpm離心2分鐘以回收樹脂。
向樹脂添加10ml冰冷的洗脫緩沖液(6mol/l尿素，1mol/l咪唑，0.5mol/l氯化鈉，20mmol/ltris-hcl，ph7.9)，在4℃旋轉(zhuǎn)2小時(shí)下整體混合，以從樹脂洗脫mxa蛋白。將該含有樹脂的混合物在4℃以3000rpm離心2分鐘，并收集上清mxa蛋白溶液。使用收集到的mxa蛋白溶液來制備測量mxa蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[3]天然mxa蛋白的制備
將黏附性人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤來源的細(xì)胞系t98g(購自dspharmabiomedicalco.,ltd.,j.cell.physiol.,99,43-54,1979)，在添加了用10％胎牛血清(fbs)、1％非必需氨基酸(由invitrogen制造)和1mmol/l丙酮酸鈉(由invitrogen制造)增補(bǔ)的10mle-mem培養(yǎng)基(由wakopurechemicalindustries,ltd.制造)的10-ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使用二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)箱(5％co2，37℃)培養(yǎng)2至3天，直到達(dá)到合生。當(dāng)細(xì)胞變得合生時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到150-cm2培養(yǎng)瓶并進(jìn)行同樣的培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞在150-cm2培養(yǎng)瓶中變得合生時(shí)，通過吸取除去培養(yǎng)基，并使用pbs(-)(既不含鈣也不含鎂的磷酸緩沖液)清洗細(xì)胞，然后通過添加0.02％edta進(jìn)行清洗。接下來，在通過添加0.25％胰蛋白酶溶液除去細(xì)胞后，通過添加等量培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用。收集細(xì)胞并在25℃下離心(1,400rpm)三次。對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以約1x105個(gè)細(xì)胞/ml懸浮在含有新鮮培養(yǎng)基的150-cm2培養(yǎng)瓶中，并加入干擾素αa蛋白(funakoshi)以獲得2,000u/ml的干擾素αa蛋白溶液。使用二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)箱將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，通過吸取除去培養(yǎng)基，使用pbs(-)清洗細(xì)胞，然后通過添加0.02％edta進(jìn)行清洗。接下來，在通過添加0.25％胰蛋白酶溶液除去細(xì)胞后，通過添加等量培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用。收集細(xì)胞并在25℃下離心(1,400rpm)三次。。除去上清液，加入0.5ml低滲緩沖液(10mmol/lhepes，1.5mmol/lmgcl2，10mmol/lkcl)并將細(xì)胞懸浮，收集溶液并將其儲(chǔ)存在-80℃直至使用。
[4]抗mxa蛋白抗體固定化板的制備
將[1]中制備的抗mxa蛋白單克隆抗體km1135用含有100mmol/l氯化鈉的100mmol/l磷酸緩沖液(ph7.5)稀釋至5μg/ml的濃度，并將混合物以100μl/孔分配到96孔微量滴定板(由nalgenuncinternational制造)中。在將板放置3天后，通過吸取除去上清液，在每個(gè)孔中分配300μl含有1％blockace(由大日本制藥社制造)和50mmol/l氯化鈉的ph7.2的磷酸緩沖液，并通過將板放置過夜在室溫下進(jìn)行阻斷。在除去阻斷溶液后，使用pbs進(jìn)行清洗。在使用真空干燥器干燥三天后，將板用作抗mxa蛋白單克隆抗體固定化板。
[5]過氧化物酶標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體的制備
通過如下所述的馬來酰亞胺方法，使[1]中制備的抗mxa蛋白單克隆抗體km1124與過氧化物酶(在后文中縮寫為pod)結(jié)合，以得到pod標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體。
首先，將含有2mg[1]中制備的km1124的磷酸緩沖液用0.1mol/l硼酸緩沖液(ph8.0)替換，并使用amicon攪拌式超濾裝置(由millipore制造)將其濃縮至1ml體積。向濃縮溶液加入40μl含有2.15mg/ml2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(由pierce制造)的0.1mol/l硼酸緩沖液(ph8.0)，并在攪拌后在30℃執(zhí)行30分鐘溫育。在上面提到的反應(yīng)中，2-亞氨基硫烷鹽酸鹽以相對(duì)于km112450倍的摩爾比率使用。使用以增補(bǔ)了5mmol/l乙二胺四乙酸二鈉(edta·2na)的0.1mol/l磷酸緩沖液(ph6.0)平衡的sephadexg25(由amershambioscience制造)柱(1.5-cm直徑x30cm)，對(duì)反應(yīng)過的溶液進(jìn)行凝膠過濾，以除去未反應(yīng)的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽，并收集巰基化的km1124。使用amicon攪拌式超濾裝置將收集到的溶液濃縮至5ml體積。
另一方面，將相當(dāng)于km1124的5倍摩爾比率的2.5mgpod(由東洋紡織社制造，過氧化物酶i-c)溶解在250μl0.1mol/l磷酸緩沖液(ph7.0)中。在將該溶液在30℃加溫5分鐘后，加入36μl的20mg/mln-(6-馬來酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺(emcs，由同仁化學(xué)研究所社制造)在n,n-二甲基甲酰胺(由nacalaitesque制造)中的溶液并攪拌，在30℃進(jìn)行30分鐘溫育。在上面提到的反應(yīng)中，emcs以相對(duì)于pod40倍的摩爾比率使用。使用以0.1mol/l磷酸緩沖液(ph6.0)平衡的sephadexg25柱(1.5-cm直徑x30cm)對(duì)反應(yīng)過的溶液進(jìn)行凝膠過濾，以除去未反應(yīng)的emcs，并收集馬來酰亞胺化的pod。使用amicon攪拌式超濾裝置將收集到的溶液濃縮。
將如上所述獲得的巰基化的km1124的溶液和馬來酰亞胺化的pod的溶液混合，使用amicon攪拌式超濾裝置將其濃縮至2ml體積，然后在30℃執(zhí)行1小時(shí)溫育。將獲得的標(biāo)記的抗體儲(chǔ)存在-80℃直至使用。
[6]樣本稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
制備了具有下列組成的樣本稀釋液。
將在上述[2]中制備的重組mxa蛋白溶液用上述樣本稀釋液稀釋，以制備0(只含樣本稀釋液)、0.375、0.75、1.5、3、6、12和24ng/ml每種濃度的mxa蛋白溶液，并將這些溶液用作標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[7]校準(zhǔn)曲線的產(chǎn)生
向在上述[4]中產(chǎn)生的抗mxa蛋白抗體(km1135)固定化板加入100μl在[6]中產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)溶液并溫育1小時(shí)，使mxa蛋白與抗體結(jié)合。在除去反應(yīng)溶液后，將添加400μl清洗溶液[含0.05％tween20(由關(guān)東化學(xué)社制造)的pbs]然后除去它的清洗操作執(zhí)行5次。接下來，將在[5]中產(chǎn)生的pod標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體(km1124)用pod標(biāo)記的抗體稀釋液(液體組合物)緩沖液[50mmol/lbis-tris(由同仁化學(xué)研究所社制造)，0.1％bsa(由intergen制造)，0.01％4-氨基安替比林(4-aa；由埼京化成社制造)，0.035％proclin300(由sigma制造)和0.1％nonidetp40]稀釋800倍，加入100μl該溶液并執(zhí)行30分鐘的溫育。除去反應(yīng)溶液，將添加400μl上面提到的清洗溶液清洗板然后除去清洗溶液的清洗操作執(zhí)行5次。在暗處加入100μl含0.05％四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫的pod產(chǎn)色底物tmblue(由serological制造)，并在室溫執(zhí)行10分鐘的溫育。通過加入100μl0.5mol/l硫酸并在室溫溫育10分鐘來終止反應(yīng)。使用讀板器在450nm波長處測量吸光度。通過一系列這樣的操作，產(chǎn)生了顯示出mxa蛋白濃度與吸光度之間的關(guān)系的校準(zhǔn)曲線。
接下來，使用培養(yǎng)的細(xì)胞或全血樣品代替上面提到的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣本執(zhí)行類似操作。獲得每個(gè)樣本的測量值，并將獲得的測定值與事先產(chǎn)生的校準(zhǔn)曲線相關(guān)聯(lián)，以確定每個(gè)樣本中的mxa蛋白濃度。
[8]檢測mxa蛋白測量中測定值的變動(dòng)-1(一次反應(yīng))
將在上述[3]中使用的黏附性人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤來源的細(xì)胞系t98g用干擾素刺激以誘導(dǎo)mxa蛋白，并獲得天然mxa蛋白。通過將獲得的天然mxa蛋白的反應(yīng)性與重組mxa蛋白的反應(yīng)性進(jìn)行比較，檢測了抗體針對(duì)重組mxa蛋白的反應(yīng)性與抗體針對(duì)天然mxa蛋白的反應(yīng)性的差異。
使用[6]的樣本稀釋液將上述[3]中產(chǎn)生的天然mxa蛋白稀釋20倍，將其靜置30分鐘以溶解細(xì)胞，然后用樣本稀釋液將其進(jìn)一步稀釋8倍，得到測量用樣品。
使用該樣品和實(shí)施例的[6]中制備的各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣本，遵照[7]中描述的操作執(zhí)行測量。具體來說，一次反應(yīng)在25℃和37℃兩種溫度下執(zhí)行，二次反應(yīng)和產(chǎn)色反應(yīng)在25℃執(zhí)行。在這里，通過下列方程(i)來計(jì)算天然mxa蛋白在25℃反應(yīng)時(shí)和在37℃反應(yīng)時(shí)的測量變動(dòng)率。結(jié)果顯示在表1中。
[方程1]
變動(dòng)率(％)＝[(在37℃下反應(yīng)時(shí)的天然mxa蛋白濃度)/(在25℃下反應(yīng)時(shí)的天然mxa蛋白濃度)-1]*100(i)
[比較例1]
使用與實(shí)施例1中[6]的樣本稀釋液具有相同組成的樣本稀釋液，區(qū)別在于在組成中使用1.2％nonidetp40(聚氧乙烯烷基苯基醚)作為表面活性劑，通過與實(shí)施例1中相似的方法來計(jì)算由反應(yīng)溫度引起的測量變動(dòng)率。結(jié)果顯示在表1中。
表1
mxa蛋白濃度*(ng/ml)
如表1中所示，根據(jù)不使用表面活性劑時(shí)(+49.9％)和使用了已知用于mxa蛋白測量的nonidetp40(參見國際公布2008/053973號(hào)小冊子)時(shí)(+45.8％)的比較，證實(shí)了使用脂肪酸烷醇酰胺時(shí)測量變動(dòng)率顯著降低，并且溫度對(duì)測定值的影響受到顯著抑制。
[實(shí)施例2]
考查mxa蛋白測量中測定值的變動(dòng)-2(一次反應(yīng))
將使用edta·2na血液收集管從被發(fā)現(xiàn)有病毒感染的5位mxa蛋白陽性患者收集的血液用作樣本。使用樣品稀釋液將全血樣本稀釋10倍，得到測量用樣品。
與實(shí)施例1中相似地在25℃和37℃下執(zhí)行一次反應(yīng)，區(qū)別在于使用含有1.2％stafoamdo的樣本稀釋液和含有1.2％nonidetp40的樣本稀釋液作為樣本稀釋液，并考查由反應(yīng)溫度引起的測量變動(dòng)。結(jié)果顯示在表2中。
表2
mxa蛋白濃度*(ng/ml)
如表2中所示，即使在使用全血樣本時(shí)，使用1.2％stafoamdo時(shí)測量變動(dòng)率為0％至+12％或更低，與此相比使用1.2％nonidetp40時(shí)為+8％至23％，證實(shí)了反應(yīng)溫度對(duì)測定值的影響受到顯著抑制。
[實(shí)施例3]
考查mxa蛋白測量中測定值的變動(dòng)-3(二次反應(yīng))
制備了具有下列組成的pod標(biāo)記的抗體稀釋緩沖液。
使用實(shí)施例1的[6]中的樣本稀釋液(具體使用nonidetp40作為“表面活性劑”)將實(shí)施例1的[3]中產(chǎn)生的天然mxa蛋白稀釋20倍，將其靜置30分鐘以溶解細(xì)胞，然后將其進(jìn)一步稀釋8倍，得到測量用樣品。
將該樣品和實(shí)施例1的[6]中制備的各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液用作樣本，將用上面提到的pod標(biāo)記的抗體稀釋緩沖液稀釋800倍的實(shí)施例1的[5]中制備的pod標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體用作pod標(biāo)記的抗體，遵照實(shí)施例1的[7]中描述的操作執(zhí)行測量。具體來說，一次反應(yīng)在25℃下執(zhí)行，二次反應(yīng)在25℃和37℃兩種溫度下執(zhí)行。通過下列方程(i)來計(jì)算天然mxa蛋白在25℃反應(yīng)時(shí)和在37℃反應(yīng)時(shí)的測量變動(dòng)率。結(jié)果顯示在表3中。
[方程2]
變動(dòng)率(％)＝[(在37℃下反應(yīng)時(shí)的天然mxa蛋白濃度)/(在25℃下反應(yīng)時(shí)的天然mxa蛋白濃度)-1]*100(i)
[比較例2]
通過與實(shí)施例3中相似的方法來計(jì)算由二次反應(yīng)溫度引起的測量變動(dòng)率，區(qū)別在于在實(shí)施例3的pod標(biāo)記的抗體稀釋緩沖液中使用0.1％nonidetp40作為表面活性劑。結(jié)果顯示在表3中。
表3
mxa蛋白濃度*(ng/ml)
如表3中所示，證實(shí)了當(dāng)使用poe·pop共聚物、poe·pop烷基醚、poe·pop烷基苯基醚、poe聚環(huán)苯基醚、poe·pop聚環(huán)苯基醚或乙二胺poe·pop縮合物時(shí)，與使用nonidetp40作為表面活性劑(-28.4％)時(shí)相比，測量變動(dòng)率顯著降低，并且反應(yīng)溫度對(duì)測定值的影響受到顯著抑制。
[實(shí)施例4]
考查mxa蛋白測量中測定值的變動(dòng)-4(二次反應(yīng))
將使用edta·2na血液收集管從被發(fā)現(xiàn)有病毒感染的4位mxa蛋白陽性患者收集的血液用作樣本。使用實(shí)施例1的[6]的樣品稀釋液(具體使用nonidetp40(1.2％)作為“表面活性劑”)將全血樣本稀釋10倍，得到測量用樣品。
通過以與實(shí)施例3中相似的方式(具體來說，一次反應(yīng)在25℃執(zhí)行，二次反應(yīng)在25℃和37℃兩種溫度下執(zhí)行)，使用在實(shí)施例3的pod標(biāo)記的抗體稀釋緩沖液中含有0.1％pronon403、0.1％pronon102或0.1％nonidetp40作為表面活性劑的pod標(biāo)記的抗體稀釋緩沖液執(zhí)行測量，來考查由反應(yīng)溫度引起的測量變動(dòng)。結(jié)果顯示在表4中。
表4
如表4中所示，即使在使用全血樣本時(shí)，對(duì)于pronon403來說測量變動(dòng)率為-4.5％至+0.6％，對(duì)于pronon102來說為-3.0％至+2.0％，與此相比，對(duì)于nonidetp40來說為-40.1％至-23.6％，這證明反應(yīng)溫度對(duì)測定值的影響受到顯著抑制。
[實(shí)施例5]
考查mxa蛋白測量中測定值的變動(dòng)-5(二次反應(yīng))
將使用edta·2na血液收集管從被發(fā)現(xiàn)有病毒感染的5位mxa蛋白陽性患者收集的血液用作樣本。使用實(shí)施例1的[6]的樣品稀釋液(具體來說使用nonidetp40(1.2％)作為“表面活性劑”)將全血樣本稀釋10倍，得到測量用樣品。
通過以與實(shí)施例3中相似的方式(具體來說，一次反應(yīng)在25℃執(zhí)行，二次反應(yīng)在25℃和37℃兩種溫度下執(zhí)行)，使用在實(shí)施例3的pod標(biāo)記的抗體稀釋緩沖液中含有0.1％emulgenpp-250、0.1％unilube50mb-168、0.1％dispanolkp189r-40、0.1％newcol2616f或0.1％乙二胺po40eo40作為表面活性劑的pod標(biāo)記的抗體稀釋緩沖液執(zhí)行測量，來考查由反應(yīng)溫度引起的測量變動(dòng)。結(jié)果顯示在表5中。
表5
如表5中所示，即使在使用全血樣本時(shí)，對(duì)于emulgenpp-250來說測量變動(dòng)率為-1％至-11％，對(duì)于unilube50mb-168來說為0％至-8％，對(duì)于dispanolkp189r-40來說為-5％至-15％，對(duì)于newcol2616f來說為-7％至-15％，對(duì)于乙二胺po40eo40來說為-1％至-12％，與此相比，對(duì)于nonidetp40來說為-33％至-20％。這證明反應(yīng)溫度對(duì)測定值的影響受到顯著抑制。
[實(shí)施例6]
制備了具有下列成分(a)至(g)的用于測量mxa蛋白的試劑盒。
(a)抗mxa蛋白抗體固定化板
按照實(shí)施例1[4]的方法，通過下面的方法制備了抗mxa蛋白抗體固定化板。首先，將抗mxa蛋白單克隆抗體km1135在含有100mmol/l氯化鈉的100mmol/l磷酸緩沖液(ph7.5)中的5μg/ml溶液，以100μl/孔分配到96孔微量滴定板(由nalgenuncinternational制造)中，然后將板放置3天，通過吸取除去上清液。接下來，以300μl/孔分配1％blockace(由大日本制藥社制造)在含有100mmol/l氯化鈉的100mmol/l磷酸緩沖液(ph7.5)中的溶液，并通過將板在室溫下放置過夜來進(jìn)行阻斷。在除去阻斷溶液后，將板用pbs清洗，并使用真空干燥器干燥3天，以制備固定化有抗mxa蛋白單克隆抗體的板。
(b)樣本稀釋液
制備了具有下列組成的樣本稀釋液。
(c)pod標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體溶液
使用具有下列組成的pod標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體稀釋液，將通過實(shí)施例1[5]的方法制備的pod標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體km1124稀釋800倍，以制備pod標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體溶液。
(d)著色溶液
tmblue(由serological制造)
(e)淬滅溶液
0.5mol/l硫酸水溶液
(f)清洗溶液
制備了下列清洗溶液。
磷酸緩沖液(ph7.2)10mmol/l
tween200.05％
氯化鈉0.15mol/l
(g)標(biāo)準(zhǔn)材料和標(biāo)準(zhǔn)溶液
將實(shí)施例1[2]中制備的重組mxa蛋白用磷酸緩沖液稀釋然后冷凍干燥，以制備mxa蛋白的標(biāo)準(zhǔn)材料。
使用上述(b)的樣本稀釋液對(duì)制備的冷凍干燥狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)材料進(jìn)行稀釋，以制備0(只含樣本稀釋液)、0.375、0.75、1.5、3、6、12和24ng/ml各種濃度的mxa蛋白溶液，并將這些溶液用作標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[比較例3]
制備了具有下列組分(a)至(g)的用于測量mxa蛋白的試劑盒。
(a)抗mxa蛋白抗體固定化板
與實(shí)施例6的(a)中相同的抗mxa蛋白抗體固定化板。
(b)樣本稀釋液
制備了具有下列組成的樣本稀釋液。
(c)pod標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體溶液
使用具有下列組成的pod標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體稀釋液，將通過實(shí)施例1[5]的方法制備的pod標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體km1124稀釋800倍，以制備pod標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體溶液。
(d)著色溶液
tmblue(由serological制造)
(e)淬滅溶液
0.5mol/l硫酸水溶液
(f)清洗溶液
制備了下列清洗溶液。
磷酸緩沖液(ph7.2)10mmol/l
tween200.05％
氯化鈉0.15mol/l
(g)標(biāo)準(zhǔn)材料和標(biāo)準(zhǔn)溶液
將實(shí)施例1[2]中制備的重組mxa蛋白用磷酸緩沖液稀釋然后冷凍干燥，以制備mxa蛋白的標(biāo)準(zhǔn)材料。
使用上述(b)的樣本稀釋液對(duì)制備的冷凍干燥狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)材料進(jìn)行稀釋，以制備0(只含樣本稀釋液)、0.375、0.75、1.5、3、6、12和24ng/ml各種濃度的mxa蛋白溶液，并將這些溶液用作標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[實(shí)施例7]
使用實(shí)施例6的樣本稀釋液，將實(shí)施例1[3]中制備的細(xì)胞稀釋20倍，并靜置30分鐘，然后用樣本稀釋液進(jìn)一步稀釋8倍，得到測量用樣品；將實(shí)施例6的試劑盒用作試劑盒；通過下列程序執(zhí)行測量。
向?qū)嵤├?(a)的抗mxa蛋白抗體固定化板加入100μl在(g)中制備的各種標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在給定溫度(22℃、25℃、28℃、30℃或32℃的溫度)下執(zhí)行1小時(shí)的溫育以使mxa蛋白與抗體結(jié)合。在除去反應(yīng)溶液后，將板用400μl(f)的清洗溶液清洗5次。接下來，加入100μl在(c)中產(chǎn)生的pod標(biāo)記的抗mxa蛋白抗體溶液，并在給定溫度(22℃、25℃、28℃、30℃或32℃的溫度)下執(zhí)行0.5小時(shí)的溫育。在反應(yīng)后，除去反應(yīng)溶液，并將板用400μl(f)的清洗溶液清洗5次。接下來，在暗處加入100μl含有0.05％四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫的(d)的著色溶液，并在室溫下執(zhí)行10分鐘的溫育，然后加入100μl(e)的淬滅溶液，并在室溫下溫育10分鐘以淬滅反應(yīng)。使用讀板器測量反應(yīng)溶液在450nm處的吸光度，并產(chǎn)生顯示出mxa蛋白濃度與吸光度之間的關(guān)系的校準(zhǔn)曲線。
[比較例4]
通過與實(shí)施例7中類似的方法執(zhí)行測量，制備了顯示出mxa蛋白濃度與吸光度之間的關(guān)系的校準(zhǔn)曲線，區(qū)別在于使用比較例3的試劑盒代替實(shí)施例6的試劑盒。
實(shí)施例7和比較例4的測量結(jié)果顯示在表6中。
表6
來自于每種反應(yīng)溫度下的反應(yīng)的測定值，以及通過將來自于22℃下的反應(yīng)的測定值視為100而獲得的每種溫度下測定值的相對(duì)值，兩者顯示在表6中。相對(duì)值越接近100，意味著測量越不可能受反應(yīng)溫度影響。正如從表6清楚看到的，與使用比較例3的含有nonidetp-40(poe烷基苯基醚)的比較例4測量方法相比，在使用實(shí)施例6的含有stafoamdo(脂肪酸烷醇酰胺)和pronon202b(poe·pop共聚物)的試劑盒的實(shí)施例7測量方法中，測定值明顯穩(wěn)定。因此，證明了本發(fā)明的測量方法較少可能受反應(yīng)溫度影響的方法。
工業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明提供了用于測量樣本中的待測成分的方法和試劑盒，其可用于診斷感染等。