本發(fā)明涉及食品安全領(lǐng)域，具體是一種全面檢測(cè)肉制品中n-亞硝胺含量的方法。

背景技術(shù)：

酒類、肉及魚類腌制品、豆制品等食品中含有n-亞硝胺類化合物，該化合物為劇毒有機(jī)化合物，具有強(qiáng)烈的致癌、致畸和致突變性，是四大食品污染物之一。新鮮的食品中，亞硝胺類化合物的含量很低，但在運(yùn)輸、加工、儲(chǔ)存等過(guò)程中很容易因缺氧、積熱、微生物、霉變等因素產(chǎn)生各種各樣的n-亞硝胺化合物；食品的來(lái)源不同、微生物種類不同、存放的時(shí)間不同，產(chǎn)生的n-亞硝胺化合物種類也會(huì)不同。

近年來(lái)，我國(guó)雖然制定了n-亞硝胺檢測(cè)方法，即gb／t5009.26-2003《食品中n-亞硝胺類的測(cè)定》。但該測(cè)定方法主要存在以下不足：（1）該方法只針對(duì)有限的4種亞硝胺化合物，而在食品中最為常見(jiàn)的n-亞硝胺有9種之多，因此現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)不能有效滿足食品安全監(jiān)測(cè)的需要。（2）該標(biāo)準(zhǔn)中樣品的提取采用水蒸氣蒸餾法，該方法作為傳統(tǒng)的前處理技術(shù)，能較好的完成目標(biāo)成分的分離，但通常要多次萃取、長(zhǎng)時(shí)間蒸餾才能保證回收率，并且需要進(jìn)一步的轉(zhuǎn)移、濃縮，操作較為繁瑣。（3）該測(cè)定方法采用的是熱能分析儀法和高分辨質(zhì)譜法，對(duì)儀器的特異性要求高，且價(jià)格較為昂貴，不便于該方法的推廣及應(yīng)用。隨著對(duì)食品安全關(guān)注度的日益提高，建立一種高效快捷、覆蓋全面、高靈敏度和高選擇性的n-亞硝胺檢測(cè)方法顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有亞硝胺檢測(cè)方法存在的問(wèn)題，提供一種耗時(shí)少、抗干擾性強(qiáng)、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、成本較低、準(zhǔn)確度高可同時(shí)檢測(cè)肉類制品中9種n-亞硝胺含量的方法。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種全面檢測(cè)肉制品中n-亞硝胺含量的方法，包括以下步驟：

（1）樣品提?。悍Q取mg粉碎好的肉制品，加入乙腈、正己烷及無(wú)水硫酸鎂，渦旋1-3min，超聲提取10-30min，離心5-10min，傾出上清液，保留乙腈層棄去正己烷層，再用乙腈重復(fù)提取肉制品1-3次，合并提取液，減壓旋蒸至近干，再用乙腈定容至vml；

（2）凈化：量取定容后的溶液至裝有c18/psa粉末的具塞離心管中，渦旋1-3min，離心3-5min，收集的上清液即為待測(cè)液樣品；

（3）定性定量分析測(cè)定：取待測(cè)液樣品進(jìn)樣，用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析檢測(cè)，掃描n-亞硝胺的特征離子，得到待測(cè)樣品的離子流色譜圖，以n-亞硝胺的特征離子的保留時(shí)間和響應(yīng)豐度比作為定性分析依據(jù)，以n-亞硝胺的特征離子響應(yīng)強(qiáng)度作為定量分析依據(jù)；

（4）配制標(biāo)準(zhǔn)溶液：配制濃度為1.0ng/ml~1000ng/ml的n-亞硝胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，取標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣到氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以外標(biāo)曲線法計(jì)算樣品中的n-亞硝胺的濃度c；

(5)結(jié)果計(jì)算：按以下公式計(jì)算肉制品中n-亞硝胺的含量x，x的單位為μg/kg；

。

進(jìn)一步地，以上所述肉制品包括畜肉、禽肉、魚肉的腌制品或熏制品。

進(jìn)一步地，以上所述乙腈與正己烷的體積比0.5-2:1。

進(jìn)一步地，以上所述肉制品與無(wú)水硫酸鎂的質(zhì)量比為2-4:1。

進(jìn)一步地，以上所述c18/psa粉末中c18粉末與psa粉末的的質(zhì)量比為0.5-2:1。

進(jìn)一步地，以上步驟（1）所述減壓旋蒸的溫度為50-60℃。

進(jìn)一步地，以上步驟（1）所述超聲提取的溫度為35-40℃，超聲頻率為50-70khz。

進(jìn)一步地，以上步驟（1）所述離心的轉(zhuǎn)速為3000-5000rpm；步驟（2）所述離心的轉(zhuǎn)速為8000-12000rpm。

進(jìn)一步地，以上所述氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀為氣相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。

進(jìn)一步地，以上采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)時(shí)質(zhì)譜單元的離子源采用ei源模式，離子源的溫度為230-300℃，掃描模式采用srm模式；氣相色譜單元的進(jìn)樣口溫度為200-300℃，初始溫度設(shè)定為35-40℃，保溫3min，以10℃/min升溫至100℃，保溫5min,再以20℃/min升溫至220℃，保溫7min，10℃/min升溫至240-250℃，以氦氣作為載氣，恒流模式進(jìn)行色譜分離，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1-2μl。

進(jìn)一步地，本發(fā)明方法可同時(shí)檢測(cè)肉制品中多種n-亞硝胺含量，所述n-亞硝胺包括n-亞硝基二甲胺、n-亞硝基甲乙胺、n-亞硝基二乙胺、n-亞硝基二丙胺、n-亞硝基二丁胺、n-亞硝基二苯胺、n-亞硝基吡咯烷、n-亞硝基哌啶和n-亞硝基嗎啉。

進(jìn)一步地，以上9種n-亞硝胺的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜特征離子及碰撞電壓參數(shù)如下：

注：標(biāo)注*的離子為定量離子。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效益效果為：

1、本發(fā)明方法通過(guò)將肉類制品經(jīng)用乙腈提取樣品中的目標(biāo)亞硝胺，用正己烷除去樣品中的油脂，濃縮，濃縮液經(jīng)c18/psa分散固相萃取凈化后，采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。本方法具有耗時(shí)少、干擾性小、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、設(shè)備成本較低、準(zhǔn)確度高可全面檢測(cè)肉類制品中n-亞硝胺含量，方便推廣應(yīng)用。

2、本方法采用c18/psa粉末分散固相萃取凈化，有效的去除干擾物質(zhì)，比常見(jiàn)的蒸餾凈化時(shí)間短，且除去干擾物質(zhì)能力強(qiáng)，回收率高。

3、本發(fā)明利用超聲波的空化作用來(lái)提取肉制品的n-亞硝胺，不僅可提高提取效率，還可提高n-亞硝胺的提取率，進(jìn)而提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

4、本發(fā)明采用氣相色譜低分辨串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，串聯(lián)質(zhì)譜獨(dú)特的srm掃描方式，可以避免相同質(zhì)量數(shù)離子的干擾，增強(qiáng)了對(duì)n-亞硝胺檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性，且對(duì)儀器的要求低，成本低。

5、本發(fā)明方法中n-亞硝胺的定量限為0.06~0.5μg/kg，檢出限為0.02~0.2μg/kg，完全可以滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肉類制品中n-亞硝胺的限量要求。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中n-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖；

圖2a、2b、2c和為實(shí)施例1中n-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品的定量定性離子提取色譜圖；

圖3a-3i為實(shí)施例1中n-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖4為實(shí)施例2中空白肉制品加9種n-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖；

圖5a、5b、5c為實(shí)施例2中空白肉制品加9種n-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品的定量定性離子提取色譜圖；

圖6為實(shí)施例2中空白肉類制品的總離子流色譜圖；

圖7a、7b、7c為實(shí)施例2中空白肉類制品的定量定性離子提取色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，但不限于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

一種全面檢測(cè)肉制品中n-亞硝胺含量的方法，包括以下步驟：

（1）樣品提?。悍Q取10g粉碎好的市售臘腸，加入20ml乙腈、10ml正己烷及2g無(wú)水硫酸鎂，在轉(zhuǎn)速為1000rpm渦旋1min，在溫度為35℃、超聲頻率為60khz下超聲提取15min，5000rpm下離心5min，傾出上清液，保留乙腈層棄去正己烷層，再用乙腈重復(fù)提取肉制品2次，合并提取液，50℃下減壓旋蒸至近干，再用乙腈定容至5ml，搖勻；

（2）凈化：量取定容后的溶液1.5ml至裝有c18/psa粉末的2ml具塞離心管中，其中c18粉末為100mg、psa粉末為50mg，渦旋1min，12000離心3min，收集的上清液即為待測(cè)液樣品；

（3）定性定量分析測(cè)定：取1.0μl待測(cè)液樣品進(jìn)樣，用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析檢測(cè)，掃描n-亞硝胺的特征離子，得到待測(cè)樣品的離子流色譜圖，以n-亞硝胺的特征離子的的保留時(shí)間和響應(yīng)豐度比作為定性分析依據(jù)，以n-亞硝胺的特征離子響應(yīng)強(qiáng)度作為定量分析依據(jù)。

檢測(cè)時(shí)質(zhì)譜型號(hào)為thermofishertrace1300/tsq8000evo，離子源采用ei源模式，離子源的溫度為250℃，掃描模式采用srm模式。9種目標(biāo)n-亞硝胺的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜特征離子及碰撞電壓參數(shù)如下：

注：標(biāo)注*的離子為定量離子。

氣相色譜單元中采用的氣相色譜柱為db-wax毛細(xì)管色譜柱，規(guī)格為30m柱長(zhǎng)×0.25mm內(nèi)徑×0.25μm膜厚；進(jìn)樣口溫度250℃；初始溫度35℃，保持3min，10℃/min升溫至100℃，保持5min，20℃/min升溫至220℃，保持7min，10℃/min升溫至240℃，保持5min；氦氣作載氣，恒流模式進(jìn)行色譜分離；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1μl。

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別取10μl、50μl、100μl、200μl、400μl、800μl、1000μl、2000μl、4000μl、8000μl、10000μl濃度為1μg/ml的9種n-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)使用液至11個(gè)10ml量瓶中，再用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml的9種n-亞硝胺混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品分別取1.0μl進(jìn)樣至氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法與檢測(cè)條件與步驟（3）相同。經(jīng)過(guò)檢測(cè)分析，9種n-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖、定量定性離子提取色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別如圖1、圖2a-2c、圖3a-3i所示。從圖2a-2c可以看出各目標(biāo)物的分離度高、峰形好、定量定性離子響應(yīng)良好。從圖3a-3i可以看出：9種亞硝胺在1ng/ml-1000ng/ml濃度范圍內(nèi)線性良好，。各標(biāo)準(zhǔn)曲線的曲線方程如下表所示：

注：上表中x代表濃度，ng/ml，y代表定量離子峰面積。

（5）根據(jù)步驟（4）所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線以外標(biāo)法計(jì)算步驟（2）待測(cè)樣品中n-亞硝胺的濃度c，根據(jù)公式計(jì)算待測(cè)樣品中的9種n-亞硝胺的含量x，x的單位為μg/kg；然后再根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)x=c×5ml/10g=c/2計(jì)算出肉質(zhì)品中n-亞硝胺含量。

經(jīng)過(guò)計(jì)算實(shí)施例1肉質(zhì)樣品中9種n-亞硝胺的含量如下表所示：

注：n.d.表示未檢出。

實(shí)施例2

取空白肉制品10g，加入20μl濃度為1μg/ml的9種n-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，得到肉制品加標(biāo)樣。再按照實(shí)施例1的步驟（1）-（3）操作?？瞻兹庵破芳?種n-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜和定量定性離子提取色譜圖分別如圖4、圖5a、圖5b、圖5c所示?？瞻兹庵破凡患觧-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖、定量定性離子提取色譜圖如圖6、圖7a、圖7b和圖7c所示。從圖中可以看出，綜合圖5a-5c和圖7a-7c，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰的分離度高、不受雜質(zhì)峰干擾，說(shuō)明本方法可靠、有效。

質(zhì)量控制:a.肉制品加標(biāo)樣的n-亞硝胺定性離子與定量離子的響應(yīng)豐度比，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)豐度比為參考，偏差在歐盟(2002/657/ec)要求范圍內(nèi)；b.加標(biāo)濃度為0.5-2.0μg/kg時(shí)，9種n-亞硝胺的回收率在60%-120%范圍內(nèi)，rsd≤10%。

根據(jù)待測(cè)樣液中的n-亞硝胺定量離子峰面積，結(jié)合實(shí)施例1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待測(cè)樣液中n-亞硝胺的含量cng/ml，并按以下公式計(jì)算得到肉制品加標(biāo)樣液中n-亞硝胺的含量xμg/kg。

x=c×5ml/10g=c/2

肉制品加標(biāo)樣重復(fù)步驟（3）連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定值以及回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算結(jié)果如下表所示：

從上表可得知肉制品加標(biāo)樣的回收率高于95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%范圍之內(nèi)，因此本方法具有很高的準(zhǔn)確度和精確度。