本發(fā)明涉及藥物分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種用高效液相色譜法測定鹽酸屈他維林注射液中有關(guān)物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：鹽酸屈他維林(Drotaverinehydrochloride)，化學(xué)名稱為：1-{(3,4-二乙氧基苯基)亞甲基}-6,7-二乙氧基-1,2,3,4-四氫異喹啉鹽酸鹽，商品名為諾仕帕(RNO-SPA)，是由法國賽諾菲公司在匈牙利的合資公司Chinoin藥廠研制開發(fā)的一種新型解痙攣藥。該藥是異喹啉類衍生物，與傳統(tǒng)山莨菪堿，阿托品等抗膽堿能解除痙攣藥不同，它直接作用于平滑肌細(xì)胞，其舒張平滑肌的作用機(jī)制為：作用于平滑肌細(xì)胞表面，改變細(xì)胞膜電位和通透性；抑制磷酸二酯酶，增加肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷腺苷(cAMP)水平；抑制細(xì)胞內(nèi)最初的鈣離子反應(yīng)，平滑肌舒張，解除痙攣。其特點是：(1)作用全面，療效持久，鹽酸屈他維林對平滑肌痙攣性收縮的每一環(huán)節(jié)都起作用，特別是高張力平滑肌有特效，其消除半衰期為9-11h，故有效期長；(2)不良反應(yīng)小，鹽酸屈他維林不影響自主神經(jīng)系統(tǒng)，對胃腸道正常的平滑肌無影響，沒有M受體拮抗劑的不良反應(yīng)。該藥的適應(yīng)癥包括冠脈功能不全、閉塞性動脈內(nèi)膜炎、心絞痛、胃腸道平滑肌痙攣、腸易激綜合征、膽絞痛、腎絞痛和泌尿道痙攣、子宮痙攣、痛經(jīng)等。其優(yōu)點在于無嚴(yán)重心血管反應(yīng)、無副交感神經(jīng)阻滯、無瞳孔放大、無青光眼的急性發(fā)作、無尿道膀胱的擴(kuò)張，起效快，不良反應(yīng)少。鹽酸屈他維林原料藥的成分是明確的，主要包含鹽酸屈他維林及2種相關(guān)雜質(zhì)(乙基罌粟堿、屈他維林酮)，將這2種物質(zhì)徹底的快速的分離十分重要。鹽酸屈他維林注射液國家局標(biāo)準(zhǔn)(YBH17602006)有關(guān)物質(zhì)高效液相分析方法參照鹽酸屈他維林注射液復(fù)核標(biāo)準(zhǔn)JX20000051、鹽酸屈他維林片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS-2127(X-184)-2002制定。國家局標(biāo)準(zhǔn)(YBH17602006)，采用磷酸鹽緩沖液(pH3.3±0.05)-乙腈-甲醇等度洗脫，分析時間周期較短，主峰約5～7分鐘出峰，有后拖尾現(xiàn)象，可能存在未知雜質(zhì)與主峰未有效分離的情況，各已知雜質(zhì)分離較好，但鹽酸屈他維林注射液經(jīng)提高滅菌工藝條件，有3個未知雜質(zhì)降解明顯，分離不理想，在保留時間約3～5分鐘之間某些雜質(zhì)相互重疊，測定不準(zhǔn)確，不能達(dá)到有關(guān)物質(zhì)檢查要求，不利于實際推廣應(yīng)用。因此，需要對鹽酸屈他維林注射液有關(guān)物質(zhì)分析方法進(jìn)行改進(jìn)，建立一個快速、有效的檢測方法，在滅菌工藝由100℃滅菌20分鐘，變?yōu)?21℃滅菌15分鐘后，能區(qū)分并檢測出鹽酸屈他維林原料藥內(nèi)的所有相關(guān)物質(zhì)，有利于提高鹽酸屈他維林注射液的產(chǎn)品質(zhì)量，提高患者用藥安全性。針對上述問題，特提出本發(fā)明。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是探索鹽酸屈他維林有關(guān)物質(zhì)高效液相色譜分析的各種條件，提供一個簡便、可靠的鹽酸屈他維林有關(guān)物質(zhì)高效液相色譜分析方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種用高效液相色譜法測定鹽酸屈他維林注射液中有關(guān)物質(zhì)的方法，該方法包括如下步驟：(1)配制供試樣品溶液：取鹽酸屈他維林用溶劑配制成供試樣品溶液；(2)配制對照品溶液：取鹽酸屈他維林、乙基罌粟堿和屈他維林酮用溶劑配制成對照品溶液；(3)配制系統(tǒng)適用性溶液：取鹽酸屈他維林、乙基罌粟堿和屈他維林酮用溶劑配制成系統(tǒng)適用性溶液；(4)進(jìn)行系統(tǒng)適用性實驗；(5)進(jìn)行檢測靈敏度實驗；用對照品溶液調(diào)節(jié)高效液相色譜儀的檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10-25％；(6)按照下列高效液相色譜條件進(jìn)行測定：流動相：以磷酸鹽緩沖液作為流動相A，以乙腈為流動相B，以甲醇為流動相C；所述磷酸鹽緩沖液為0.1％磷酸水溶液用三乙胺調(diào)節(jié)至pH＝3.3±0.05；紫外檢測器：檢測波長為200-400nm；色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流速：0.5-2.0mL/min；柱溫：20-60℃；(7)按外標(biāo)法，計算有關(guān)物質(zhì)的含量。優(yōu)選地，所述的紫外檢測器的檢測波長為200-300nm，更優(yōu)選的為244nm。優(yōu)選地，所述流速為1.0mL/min；所述柱溫為30-50℃，更優(yōu)選地為40℃。優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖液由0.1％磷酸水溶液用三乙胺調(diào)節(jié)pH3.3±0.05后制成。優(yōu)選地，所述供試樣品溶液的配制具體包括配制含鹽酸屈他維林0.8mg/mL的溶液，所述溶液的溶劑為流動相A、甲醇和乙腈形成的混合溶劑，所述混合溶劑為將甲醇和乙腈按體積比2:1混合后的混合液再與流動相A按體積比1:9混合。優(yōu)選地，所述對照品溶液的配制具體包括配制含鹽酸屈他維林、乙基罌粟堿和屈他維林酮的溶液，所述溶液中鹽酸屈他維林的濃度為4.0μg/mL；乙基罌粟堿的濃度為1.6μg/mL；屈他維林酮的濃度為4.0μg/mL；將鹽酸屈他維林、乙基罌粟堿和屈他維林酮先用甲醇與乙腈體積比為2:1的混合液溶解，然后加入流動相A、甲醇和乙腈形成的混合溶劑，所述混合溶劑為將甲醇和乙腈按體積比2:1混合后的混合液再與流動相A按體積比1:9混合。優(yōu)選地，所述系統(tǒng)適用性溶液的配制具體包括配制含鹽酸屈他維林、乙基罌粟堿和屈他維林酮的溶液，所述溶液中鹽酸屈他維林的濃度為0.8mg/mL；乙基罌粟堿的濃度為1.6μg/mL；屈他維林酮的濃度為4.0μg/mL；將鹽酸屈他維林、乙基罌粟堿和屈他維林酮先用甲醇與乙腈體積比為2:1的混合液溶解，然后加入流動相A、甲醇和乙腈形成的混合溶劑，所述混合溶劑為將甲醇和乙腈按體積比2:1混合后的混合液再與流動相A按體積比1:9混合。優(yōu)選地，所述系統(tǒng)適用性試驗是指取系統(tǒng)適用性溶液20μL注入液相色譜儀，鹽酸屈他維林與乙基罌粟堿的分離度大于3.0，各雜質(zhì)峰之間分離度符合要求，理論塔板數(shù)按鹽酸屈他維林計算，不低于3000。優(yōu)選地，以流動相A、流動相B和流動相C進(jìn)行梯度洗脫；所述的梯度為：本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明立足于高效液相色譜分析方法，針對現(xiàn)有技術(shù)存在的分離不徹底、峰形拖尾嚴(yán)重、包峰等缺點，采用新的緩沖液體系以及流動相比例，使雜質(zhì)能夠完全分離，解決了現(xiàn)有技術(shù)的相關(guān)問題；且本發(fā)明提供的方法經(jīng)專屬性、靈敏度等方法學(xué)研究及驗證，其驗證結(jié)果均在可接受范圍；本發(fā)明同現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行專屬性對比研究，證明其方法更能有效地控制鹽酸屈他維林注射液有關(guān)物質(zhì)；本發(fā)明方法還具有下述有益效果，1.流動相配制較為簡單易操作；2.能夠有效分離雜質(zhì)，主成分無拖尾，檢出的雜質(zhì)種類、數(shù)量均高于國家局標(biāo)準(zhǔn)(YBH17602006)方法，檢測準(zhǔn)確度高，提高產(chǎn)品的安全性，方法科學(xué)、可靠，可控；3.操作簡便，適于實際應(yīng)用和推廣。附圖說明圖1示出了本申請比較例1提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖2示出了本申請比較例2提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖3示出了本申請實施例1提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖4示出了本申請實施例2提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖5示出了本申請實施例3提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖6A示出了本申請比較例3提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖6B示出了本申請實施例4提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖7A示出了本申請比較例4提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖7B示出了本申請實施例5提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖8A示出了本申請比較例5提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖8B示出了本申請實施例6提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖9A示出了本申請比較例6提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖9B示出了本申請實施例7提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖10A示出了本申請比較例7提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖10B示出了本申請實施例8提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖11示出了本申請實施例14提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖12示出了本申請實施例14提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖13示出了本申請實施例14提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜；圖14示出了本申請實施例14提供的檢測結(jié)果的HPLC圖譜。具體實施方式下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。根據(jù)鹽酸屈他維林原料合成工藝路線及試驗，可以確定可能的有關(guān)物質(zhì)為:(1)起始物料：3，4-二乙氧基苯乙酸和3，4-二乙氧基苯乙胺；(2)合成中間體(縮合物)：N-(3，4-二乙氧基苯乙酰)-β-(3，4-二乙氧基苯)乙胺；(3)降解產(chǎn)物：乙基罌粟堿、屈他維林酮。起始物料和中間體在原料制備工藝中已經(jīng)加以控制，并制定內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。本方法重點關(guān)注2個已知降解產(chǎn)物乙基罌粟堿、屈他維林酮和滅菌過程中降解變大的3個未知雜質(zhì)。步驟1.配制供試樣品溶液：精密量取鹽酸屈他維林注射液適量，加溶劑2定量稀釋制成每1mL中約含鹽酸屈他維林0.8mg的溶液，作為供試品溶液；步驟2.配制對照品溶液：精密稱取鹽酸屈他維林、乙基罌粟堿與屈他維林酮各適量，加溶劑1適量溶解，再用溶劑2稀釋制成每1mL約含鹽酸屈他維林4.0μg、乙基罌粟堿1.6μg與屈他維林酮4.0μg的混合溶液，作為對照品溶液；步驟3.配制系統(tǒng)適用性溶液：精密稱取鹽酸屈他維林、乙基罌粟堿與屈他維林酮各適量，加溶劑1適量溶解，再用溶劑2稀釋成每1mL約含乙基罌粟堿1.6μg、屈他維林酮4.0μg與鹽酸屈他維林0.8mg的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液；步驟4.檢測：以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為色譜柱填料，以磷酸鹽緩沖液(0.1％磷酸水溶液用三乙胺調(diào)節(jié)pH3.3±0.05)作為流動相A、以乙腈作為流動相B，以甲醇作為流動相C，采用梯度洗脫法，檢測所述供試樣品溶液，檢測波長為244nm；柱溫為40℃，流速為1.0mL/分鐘。梯度條件見表1；表1步驟5.精密量取系統(tǒng)適用性溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。理論板數(shù)按鹽酸屈他維林計算，應(yīng)不低于3000，鹽酸屈他維林峰與乙基罌粟堿的分離度應(yīng)大于3.0，各雜質(zhì)峰之間分離度符合要求；步驟6.精密量取對照品溶液20μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10％-25％；步驟7.按外標(biāo)法，計算乙基罌粟堿、屈他維林酮、其他單個雜質(zhì)的含量；上述步驟1、2和3中，所述溶劑1為甲醇乙腈混合溶液(甲醇︰乙腈＝2︰1)；溶劑2為流動相A︰甲醇乙腈混合溶液(甲醇︰乙腈＝2︰1)＝9︰1。以下實施例和比較例中使用的實驗儀器均為安捷倫高效液相色譜儀；使用的色譜柱為COSMOSIL5C18-MS-Ⅱ250mm×4.6mm5μm；各實施例中，以磷酸鹽緩沖液(0.1％磷酸水溶液用三乙胺調(diào)節(jié)pH3.3±0.05)作為流動相A、以乙腈作為流動相B，以甲醇作為流動相C，溶劑1為甲醇乙腈混合溶液(甲醇︰乙腈＝2︰1)；溶劑2為流動相A︰甲醇乙腈混合溶液(甲醇︰乙腈＝2︰1)＝9︰1；檢測所述供試樣品溶液，檢測波長為244nm；柱溫為40℃，流速為1.0mL/分鐘，進(jìn)樣量：20μL。梯度洗脫按照表2進(jìn)行線性洗脫：表2雜質(zhì)信息見下表3：表3雜質(zhì)信息匯總實施例1-3系統(tǒng)適用性試驗實施例1，系統(tǒng)適用性溶液配制：分別取鹽酸屈他維林、已知雜質(zhì)屈他維林酮、已知雜質(zhì)乙基罌粟堿各適量，加溶劑1適量溶解，在用溶劑2稀釋制成每1mL約含屈他維林酮4.0μg(0.5％)、乙基罌粟堿1.6μg(0.2％)、鹽酸屈他維林0.8mg的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液；實施例2，供試品溶液配制：精密量取鹽酸屈他維林注射液適量，加溶劑2定量稀釋制成每1mL中約含鹽酸屈他維林0.8mg的溶液，作為供試品溶液；實施例3，選擇性溶液配制：分別取鹽酸屈他維林、已知雜質(zhì)屈他維林酮、已知雜質(zhì)乙基罌粟堿、屈他維林縮合物(中間體)、起始物料3，4-二乙氧基苯乙酸和3，4-二乙氧基苯乙胺各適量加溶劑1適量溶解，再用溶劑2稀釋制成每1mL約含屈他維林酮、屈他維林縮合物、3，4-二乙氧基苯乙酸、3，4-二乙氧基苯乙胺各4.0μg(0.5％)、乙基罌粟堿1.6μg(0.2％)、鹽酸屈他維林0.8mg的混合溶液，作為選擇性溶液；進(jìn)樣并記錄色譜圖。比較例1-2系統(tǒng)適用性試驗按鹽酸屈他維林注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)YBH17602006試驗；色譜條件：色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二銨13.2g，加水200mL使溶解，加85％的磷酸7.6mL，用水稀釋至1000mL，調(diào)節(jié)pH至3.3±0.05)-乙腈-甲醇(800∶400∶800)；溶劑：0.1mol/LHCl-甲醇-乙腈(8∶1∶1)；流速：1.0mL/min；波長：244nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL；比較例1，系統(tǒng)適用性溶液配制：分別取鹽酸屈他維林、已知雜質(zhì)屈他維林酮、已知雜質(zhì)乙基罌粟堿各適量加溶劑溶解稀釋制成每1mL約含屈他維林酮4.0μg(0.5％)、乙基罌粟堿1.6μg(0.2％)、鹽酸屈他維林0.8mg的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液；比較2，供試品溶液配制：精密量取鹽酸屈他維林注射液適量，加溶劑定量稀釋制成每1mL中約含鹽酸屈他維林0.8mg的溶液，作為供試品溶液；進(jìn)樣并記錄色譜圖。結(jié)論：比較例1和比較例2見圖1，圖2所示：系統(tǒng)適用性溶液中，乙基罌粟堿、屈他維林酮和主成分分離度較好，但主峰保留時間較短，有拖尾現(xiàn)象，存在未知雜質(zhì)與主峰未有效分離的情況；另外，溶劑峰后雜質(zhì)出峰時間較快，且未知雜質(zhì)分離不理想，在保留時間約3～5分鐘之間部分雜質(zhì)相互重疊，分離效果不能達(dá)到有關(guān)物質(zhì)檢查要求。實施例1-3結(jié)果見圖3、圖4所示：乙基罌粟堿、屈他維林酮和主成分分離度較好，且主成分保留時間適中，無拖尾現(xiàn)象；另外，溶劑峰后各未知雜質(zhì)分離效果較好；圖5所示：選擇性溶液中，加入起始物料、中間體、已知雜質(zhì)考察分離度，結(jié)果顯示，鹽酸屈他維林與3，4-二乙氧基苯乙酸、3，4-二乙氧基苯乙胺、屈他維林縮合物、乙基罌粟堿、屈他維林酮5個雜質(zhì)的分離度均大于3.0，分離效果能達(dá)到有關(guān)物質(zhì)檢查要求。實施例4-8破壞性試驗供試品溶液制備實施例4，破壞前溶液：取鹽酸屈他維林注射液1mL(約相當(dāng)于鹽酸屈他維林20mg)置于25mL容量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，搖勻，作為未破壞溶液。實施例5，高溫破壞溶液：取鹽酸屈他維林注射液1mL(約相當(dāng)于鹽酸屈他維林20mg)置于25mL容量瓶中，100℃加熱8h，冷卻至室溫，溶劑2稀釋至刻度，搖勻，作為高溫破壞溶液。實施例6，光照破壞溶液：取鹽酸屈他維林注射液1mL(約相當(dāng)于鹽酸屈他維林20mg)，置于25mL容量瓶中，紫外燈下光照15h，溶劑2稀釋至刻度，作為光照破壞溶液。實施例7，堿破壞溶液：取鹽酸屈他維林注射液1mL(相當(dāng)于鹽酸屈他維林約20mg)，置于25mL容量瓶中，加1mol/L氫氧化鈉1mL，60℃破壞1.5h后，加1mol/L鹽酸1mL中和，溶劑2稀釋至刻度，搖勻，作為堿破壞溶液。實施例8，氧化破壞溶液：取鹽酸屈他維林注射液1mL(約相當(dāng)于鹽酸屈他維林20mg)，置于25mL容量瓶中，加30％的雙氧水2mL，60℃破壞8h，溶劑2稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞溶液。進(jìn)樣并記錄色譜圖。比較例3-7破壞性試驗按鹽酸屈他維林注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)YBH17602006實驗，色譜條件：色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二銨13.2g，加水200mL使溶解，加85％的磷酸7.6mL，用水稀釋至1000mL，調(diào)節(jié)pH至3.3±0.05)-乙腈-甲醇(800∶400∶800)；溶劑：0.1mol/LHCl溶液-甲醇-乙腈(8∶1∶1)；流速：1.0mL/min；波長：244nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL；供試品溶液制備：比較例3，破壞前溶液：取鹽酸屈他維林注射液1mL(約相當(dāng)于鹽酸屈他維林20mg)置于25mL容量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為未破壞溶液；比較例4，高溫破壞溶液：取鹽酸屈他維林注射液1mL(約相當(dāng)于鹽酸屈他維林20mg)置于25mL容量瓶中，100℃加熱8h，冷卻至室溫，溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為高溫破壞溶液。比較例5，光照破壞溶液：取鹽酸屈他維林注射液1mL(約相當(dāng)于鹽酸屈他維林20mg)，置于25mL容量瓶中，紫外燈下光照15h，溶劑稀釋至刻度，作為光照破壞溶液。比較例6，堿破壞溶液：取鹽酸屈他維林注射液1mL(相當(dāng)于鹽酸屈他維林約20mg)，置于25mL容量瓶中，加1mol/L氫氧化鈉1mL，60℃破壞1.5h后，加1mol/L鹽酸1mL中和，溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為堿破壞溶液。比較例7，氧化破壞溶液：取鹽酸屈他維林注射液1mL(約相當(dāng)于鹽酸屈他維林20mg)，置于25mL容量瓶中，加30％的雙氧水2mL，60℃破壞8h，溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞溶液。結(jié)論：比較例3-7結(jié)果見圖6A，7A，8A，9A，10A所示：各降解條件下，除已知雜質(zhì)乙基罌粟堿和屈他維林酮外，其它降解雜質(zhì)均在主峰出峰時間(RT＝6.1)之前，且在保留時間約3～5分鐘之間有重疊，分離度較差，影響檢測結(jié)果。實施例4-8結(jié)果見圖6B，7B，8B，9B，10B所示：可以得知(1)供試品在各種破壞條件下的降解產(chǎn)物保留時間均大于3.0分鐘，各破壞降解產(chǎn)物與溶劑峰及主峰均能很好分離，溶劑不干擾有關(guān)物質(zhì)測定；各雜質(zhì)峰分離度均大于3.0；(2)鹽酸屈他維林注射液經(jīng)破壞性試驗，與未破壞相對比，乙基罌粟堿：高溫、堿和氧化破壞條件下含量變化較大，光照破壞未見明顯變化；屈他維林酮：堿破壞含量變化明顯，高溫破壞和光照破壞含量變化較大，氧化破壞未見明顯變化；未知雜質(zhì)：均有不同程度降解產(chǎn)生，光照、氧化較為明顯；(3)除高溫破壞溶液外，其他破壞溶液和破壞前溶液雜質(zhì)個數(shù)均比國家局標(biāo)準(zhǔn)(YBH17602006)方法檢查雜質(zhì)數(shù)多，屈他維林酮含量、最大單雜含量和雜質(zhì)總量均高于國家局標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)檢查方法結(jié)果。綜上所述，本發(fā)明有關(guān)物質(zhì)檢查方法測得破壞前溶液和破壞溶液雜質(zhì)數(shù)，屈他維林酮含量、其他最大單雜含量和雜質(zhì)總量均高于國家局標(biāo)準(zhǔn)(YBH17602006)檢查方法結(jié)果。因此，修改后有關(guān)物質(zhì)檢查方法的專屬性和分離效能優(yōu)于現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)檢查方法。以下為本發(fā)明鹽酸屈他維林注射液有關(guān)物質(zhì)檢查方法驗證：實施例9檢測限和定量限取專屬性項下鹽酸屈他維林(濃度：4μg/mL)、乙基罌粟堿(濃度：1.6μg/mL)、屈他維林酮(濃度：4μg/mL)的單一定位溶液，用稀釋法測其定量限(S/N≥10)、檢測限(S/N≥3)，結(jié)果見表4表4檢測限和定量限結(jié)論：本色譜條件下，鹽酸屈他維林、乙基罌粟堿和屈他維林酮的定量限與檢測限均符合接受限度。實施例10標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍精密稱取鹽酸屈他維林、屈他維林酮標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，分別置于100mL容量瓶中，加溶劑1溶解用溶劑2稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸屈他維林、屈他維林酮儲備液；精密稱取乙基罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品20mg，置50mL容量瓶中，加溶劑1溶解用溶劑2稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液5mL置50mL容量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，搖勻，作為乙基罌粟堿儲備液。精密量取適量鹽酸屈他維林、乙基罌粟堿、屈他維林酮儲備液，加溶劑2制成每1mL中含鹽酸屈他維林0.16、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0μg；乙基罌粟堿0.048、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4μg；屈他維林酮0.32、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0μg的6份溶液。精密量取上述溶液各20μL分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積，以峰面積A為縱坐標(biāo)、濃度C為橫坐標(biāo)作線性回歸。結(jié)果見表5，表5鹽酸屈他維林和已知雜質(zhì)的HPLC線性名稱線性方程相關(guān)系數(shù)線性范圍μg/mL鹽酸屈他維林A＝29.120C+0.5168R2＝0.99930.16～6.0乙基罌粟堿A＝107.38C+0.8246R2＝0.99990.048～2.4屈他維林酮A＝23.756C+0.0453R2＝0.99960.32～6.0結(jié)論：結(jié)果表明，鹽酸屈他維林在0.16～6.0μg/mL、乙基罌粟堿在0.048～2.4μg/mL、屈他維林酮在0.32～6.0μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與測定濃度呈良好線性關(guān)系。實施例11供試品溶液穩(wěn)定性試驗取鹽酸屈他維林注射液照有關(guān)物質(zhì)檢查方法，配制供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12h進(jìn)樣，考察乙基罌粟堿、屈他維林酮峰面積、其他最大單雜和雜質(zhì)總量的變化。結(jié)果見表6，表6供試品溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果結(jié)論：12h內(nèi)，乙基罌粟堿含量RSD為0.89％，屈他維林酮含量RSD為5.43％，其他最大單雜含量RSD為1.78％，總雜含量RSD為2.51％。從以上測定數(shù)據(jù)可以看出，供試品溶液在12h內(nèi)各雜質(zhì)和總雜無明顯變化，穩(wěn)定性良好。實施例12重復(fù)性試驗取鹽酸屈他維林注射液，照有關(guān)物質(zhì)檢查方法，平行配制6份供試品溶液，每份各測定1次，計算各雜質(zhì)含量。結(jié)果見表7，表7重復(fù)性試驗結(jié)果結(jié)論：6份供試品溶液測定結(jié)果符合要求，重復(fù)性良好。實施例13準(zhǔn)確度試驗分別取鹽酸屈他維林注射液1mL，置25mL容量瓶中，共9份，每3份為一組，分別精密加入乙基罌粟堿、屈他維林酮雜質(zhì)儲備液各0.5mL(限度50％)、1.0mL(限度100％)、1.5mL(限度150％)，加溶劑2稀釋至刻度，作為低、中、高三組濃度供試品溶液，依法測定，計算回收率及RSD。結(jié)果見表8和表9，表8乙基罌粟堿準(zhǔn)確度試驗結(jié)果表9屈他維林酮準(zhǔn)確度試驗結(jié)果實施例14耐用性試驗有關(guān)物質(zhì)耐用性主要從流動相不同磷酸濃度、不同pH、不同流速和不同色譜柱等幾個方面驗證。結(jié)果見表10，表10耐用性試驗結(jié)果耐用性試驗條件對比圖譜見圖11-14，結(jié)論：綜上耐用性試驗結(jié)果表明，本方法色譜條件參數(shù)對鹽酸屈他維林注射液有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)分離與檢查沒有明顯影響。實施例15有關(guān)物質(zhì)檢查分別取變更滅菌工藝前、后樣品各三批和原研產(chǎn)品，按照國家標(biāo)準(zhǔn)和本發(fā)明方法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，并進(jìn)行對比研究，綜合評估變更滅菌工藝前后樣品的雜質(zhì)變化，新老方法的檢測性能。結(jié)果見表11，表11滅菌工藝變更前后的鹽酸屈他維林注射液與原研產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)比較結(jié)論：1、滅菌工藝變更前后各三批樣品與原研產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)對比：(1)滅菌工藝變更后的鹽酸屈他維林注射液中有1個雜質(zhì)在原研產(chǎn)品中未出現(xiàn)，含量在0.02％左右；原研產(chǎn)品中有3個雜質(zhì)在自制樣品中未出現(xiàn)；(2)滅菌工藝變更后的鹽酸屈他維林注射液中雜質(zhì)種類和雜質(zhì)個數(shù)均少于原研產(chǎn)品，自制樣品和原研產(chǎn)品中均含有乙基罌粟堿和屈他維林酮，自制樣品中乙基罌粟堿和屈他維林酮含量均不高于原研產(chǎn)品，自制樣品中其他最大單雜含量和雜質(zhì)總量均不高于原研產(chǎn)品，相同未知雜質(zhì)均小于原研產(chǎn)品。其他最大單質(zhì)均小于0.1％。自制品質(zhì)量不低于原研產(chǎn)品。2、滅菌工藝變更后三批樣品和變更前三批樣品對比，雜質(zhì)種類和個數(shù)均一致，乙基罌粟堿和屈他維林酮含量無明顯變化，其他最大單雜和雜質(zhì)總量無明顯變化。本發(fā)明方法和國家局標(biāo)準(zhǔn)(YBH17602006)方法對比如下表12所示：表12本發(fā)明方法和國家局標(biāo)準(zhǔn)對比結(jié)果采用本發(fā)明的原料藥鹽酸屈他維林有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，梯度洗脫，充分揭示了鹽酸屈他維林注射液的雜質(zhì)，提高產(chǎn)品的安全性,方法科學(xué)、可靠，操作簡便，可控，適于實際應(yīng)用和推廣。最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3