本發(fā)明屬于檢測
技術領域：
，具體涉及基于UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS技術對石斛中生物堿成分的檢測方法。
背景技術：
：石斛為常用名貴中藥材，具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺止咳等功效。生物堿是石斛藥材中最重要的活性成分之一，在抗腫瘤、治療心血管及胃腸道疾病等方面具有明顯的療效。為明確藥效成分，對石斛中生物堿進行深入的化學成分分析具有重要意義。目前，石斛中研究較多的是總生物堿含量，例如徐寧等人報道了采用分光光度法對石斛中總生物堿含量進行了測定，但是該方法主要是對石斛中生物堿進行定量檢測，并且是對總生物堿的量進行的檢測，無法區(qū)分不同生物堿的種類。UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技術是一種較為有效地、可靠地分析化合物成分的技術，例如，謝彤等人報道了基于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS的黃芩中黃酮碳苷的結構表征及黃酮碳苷類成分的同分異構體的區(qū)分，為其他中藥的成分分析提供參考。另外，牛增元等人報道了采用UPLC-LTQ/OrbitrapMS技術測定化妝品中抗生素、激素、鄰苯二甲酸酯、農(nóng)藥以及孔雀石綠和結晶紫等5大類共89種化合物，說明該方法簡便、快速、可靠性高。但是該技術依托于待檢測樣品需經(jīng)過精細的預處理過程，去除待測物中雜質(zhì)的干擾才能得到目標物的分析結果。由于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技術非常靈敏，前期預處理過程中如果沒有完全去除非目標物，則容易造成分析產(chǎn)生誤差或錯誤的結論，因此，樣品的前期預處理是十分重要?，F(xiàn)有技術中，雖然有學者報道對丹參、黃芩等樣品進行預處理后采用UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技術對目標物進行檢測，但是，從丹參中提取鑒定丹參酮ⅡA及丹酚酸B，前期過程需要克服糖類脂類的物質(zhì)的干擾；從黃芩中分離檢測黃酮碳苷，提取的目的物為糖類，干擾物為蛋白脂類等物質(zhì)，可見目的物的提取方法不能通用?，F(xiàn)有技術中，還沒有針對UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技術對石斛中生物堿的種類進行預處理方法的報道。技術實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供基于UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS技術對石斛中生物堿成分的檢測方法，使所述方法具有快速、準確、批量檢測的特點。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：本發(fā)明提供了基于UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS檢測石斛生物堿成分的方法，包括以下步驟：1)將石斛待測樣品殺青后烘烤；2)將所述步驟1)烘烤后的石斛與有機溶劑混合后磨碎，得到石斛漿液；所述的有機溶劑包括甲醇、乙醚或丙酮；3)將所述步驟2)得到的石斛漿液進行超聲破碎，固液分離后，得到上清液；4)將所述步驟3)得到的上清液進行濃縮，得到提取物干粉；5)將所述步驟4)得到的提取物干粉與硫酸溶液混合，得到混合液，調(diào)節(jié)所述混合液的pH值至9.5～10.5，將得到的堿性混合液靜置；6)將所述步驟5)靜置后的堿性混合液與二氯甲烷混合，離心，得到二氯甲烷相；7)將所述步驟6)得到的二氯甲烷相濃縮，得到生物堿干粉；8)將所述生物堿干粉用甲醇復溶，固液分離后得到游離生物堿待測樣品；9)用超高效液相色譜分離所述游離生物堿待測樣品，將分離后的生物堿成分用質(zhì)譜檢測，得到生物堿成分物質(zhì)峰；10)用OSI/SMMS軟件對所述生物堿成分物質(zhì)峰進行定性分析。優(yōu)選的，所述步驟1)中殺青的溫度為100～110℃；殺青的時間為15～25min。優(yōu)選的，所述步驟1)中烘烤的溫度為50～65℃；所述烘烤至恒重。優(yōu)選的，所述步驟2)中石斛的質(zhì)量與有機溶劑的體積比為(50～80)mg：(1～2)mL。優(yōu)選的，所述步驟3)中超聲的溫度為25～30℃；超聲的時間20～40min；所述超聲的功率為100～150W。優(yōu)選的，所述步驟3)和步驟8)中所述固液分離采用離心的方法；所述離心的轉(zhuǎn)速為8000～12000rpm；所述離心的時間為10～15min。優(yōu)選的，所述步驟4)和步驟7)中濃縮獨立為氮氣吹干濃縮；所述濃縮的時間為40～100min。優(yōu)選的，所述步驟5)中提取物干粉的質(zhì)量與硫酸溶液的體積比為(7～11)mg：(1～2)mL；所述硫酸溶液的體積濃度為8％～12％。優(yōu)選的，所述步驟5)中靜置的時間為30～50min。優(yōu)選的，所述步驟6)中堿性混合液與二氯甲烷的體積比為2～3：1～2；所述步驟6)中所述離心的轉(zhuǎn)速為3500～5000rpm；所述步驟6)中所述離心時間為15～20min。優(yōu)選的，所述步驟9)中色譜分離條件包括如下參數(shù)：色譜柱為HypersilGOLD液相色譜柱；所述HypersilGOLD液相色譜柱的規(guī)格為2.1mm×100mm×1.9μm；柱溫為40℃；洗脫系統(tǒng)流動相A為體積濃度0.1％甲酸水溶液，流動相B為體積濃度0.1％甲酸乙腈溶液；洗脫的流速為0.35mL/min；進樣體積為5μL；流動相梯度洗脫程序：(0,1min)，流動相A與流動相B的體積比19：1的混合液；[1min,24min)，流動相A與流動相B的體積比為恒定值，所述恒定值的范圍為1：19～19：1；[24min,28min)，流動相A與流動相B的體積比為1：19；[28min,28.1min)，流動相A與流動相B的體積比為恒定值，所述恒定值的范圍為1：19～19：1；[28.1,30min]，流動相A與流動相B的體積比為19：1。優(yōu)選的，所述步驟9)中質(zhì)譜檢測條件包括以下參數(shù)：離子源為電噴霧離子源，正離子模式檢測；鞘氣，30自由單位；輔助氣，6自由單位；噴霧電壓，3.8kV；離子傳輸毛細管溫度為350℃，源加熱溫度為350℃；母離子掃描范圍：50-1000m/z，數(shù)據(jù)依賴的掃描模式，每次全掃描后采集最強的5個碎片圖譜進行二級質(zhì)譜掃描；碎裂方式：碰撞誘導解離，正態(tài)化能量30％，q值0.25，活化時間為30ms，動態(tài)排除時間為5s；一級質(zhì)譜在m/z400時分辨率為30000，二級質(zhì)譜在m/z400時分辨率為30000。本發(fā)明提供了基于UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS檢測石斛生物堿成分的方法，通過超聲提取，同時，根據(jù)多糖易溶于水而不溶于甲醇、乙醚、丙酮等有機溶劑的特點，用上述有機溶劑進行提取，避免了石斛中糖類物質(zhì)的浸出，更有利于痕量物質(zhì)生物堿成分的提取。本發(fā)明針對生物堿成分的化學性質(zhì)，采用酸水溶解甲醇提取物，并進一步堿化，使生物堿鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x的生物堿，利用二氯甲烷溶液進行萃取，去除其他水溶性雜質(zhì)淀粉、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、色素、無機鹽等，更有利于生物堿成分的分離和檢測。本發(fā)明采用具有大規(guī)模代謝組快速、準確、批量定性分析的OSI/SMMS軟件，完成未知代謝物定性。本發(fā)明首次采用UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS技術對石斛中生物堿成分進行檢測并定性，共鑒定出22種生物堿成分，且均首次在石斛中被分離檢測出，進一步明確了石斛生物堿成分的類型，為研究其藥理作用奠定了理論基礎。附圖說明圖1為實施例1中鐵皮石斛類原球莖的提取物正離子模式下總離子流圖；圖2為實施例2中m/z225.19556提取離子流色譜圖；圖3為實施例2中m/z225.19556一級質(zhì)譜圖；圖4為實施例2中m/z225.19556二級質(zhì)譜圖。具體實施方式本發(fā)明提供了基于UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS檢測石斛生物堿成分的方法，包括以下步驟：1)將石斛待測樣品殺青后烘烤；2)將所述步驟1)烘烤后的石斛與有機溶劑混合后磨碎，得到石斛漿液；所述的有機溶劑包括甲醇、乙醚或丙酮；3)將所述步驟2)得到的石斛漿液進行超聲破碎，固液分離后，得到上清液；4)將所述步驟3)得到的上清液進行濃縮，得到提取物干粉；5)將所述步驟4)得到的提取物干粉與硫酸溶液混合，得到混合液，調(diào)節(jié)所述混合液的pH值至9.5～10.5，將得到的堿性混合液靜置；6)將所述步驟5)靜置后的堿性混合液與二氯甲烷混合，離心，得到二氯甲烷相；7)將所述步驟6)得到的二氯甲烷相濃縮，得到生物堿干粉；8)將所述生物堿干粉用甲醇復溶，固液分離后得到游離生物堿待測樣品；9)用超高效液相色譜分離所述游離生物堿待測樣品，將分離后的生物堿成分用質(zhì)譜檢測，得到生物堿成分物質(zhì)峰；10)用OSI/SMMS軟件對所述生物堿成分物質(zhì)峰進行定性分析。本發(fā)明將石斛待測樣品殺青后烘烤。本發(fā)明中，所述石斛的品種優(yōu)選為鐵皮石斛，霍山米斛或銅皮石斛。所述石斛優(yōu)選食用石斛原球莖。本發(fā)明中，所述殺青的方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的殺青方法即可。所述殺青的溫度優(yōu)選為100～110℃，更優(yōu)選為105℃；所述殺青的時間優(yōu)選為15～25min，更優(yōu)選為20min。所述殺青的目的是破壞鮮石斛材料中的酶活，從而保留功效物質(zhì)。本發(fā)明中，所述烘烤的溫度優(yōu)選為50～65℃，更優(yōu)選為60℃；所述烘烤的時間沒有特殊限制，烘烤的程度優(yōu)選烘烤至恒重。得到烘烤后的石斛后，本發(fā)明將所述烘烤后的石斛與有機溶劑混合后磨碎，得到石斛漿液；所述的有機溶劑包括甲醇、乙醚或丙酮。本發(fā)明中，所述石斛的質(zhì)量與有機溶劑的體積比優(yōu)選為(50～80)mg：(1～2)mL，更優(yōu)選為(50～65)mg：(1～1.5)mL。所述甲醇、乙醚或丙酮的質(zhì)量濃度優(yōu)選為100％。本發(fā)明中，所述磨碎的方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的磨碎方法即可。所述磨碎的程度優(yōu)選磨碎至100～300目。本發(fā)明實施例中，磨碎采用球磨儀磨碎。所述球磨儀的頻率為60～70HZ，所述球磨儀的磨碎時間為3～5min，更優(yōu)選為4min。得到石斛漿液后，本發(fā)明將所述石斛漿液進行超聲破碎，固液分離后，得到上清液。本發(fā)明中，所述超聲的方法沒有特殊限制采用本領域技術人員所熟知的超聲的技術方案即可。所述超聲的溫度優(yōu)選為25～30℃。超聲的時間優(yōu)選為20～40min，更優(yōu)選為30min。所述超聲的功率優(yōu)選為100～150W，更優(yōu)選為120W。本發(fā)明中，所述固液分離的方法沒有特殊限制采用本領域技術人員所熟知的固液分離的技術方案即可。本發(fā)明中，所述固液分離優(yōu)選采用離心的方法。所述離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為8000～12000rpm，更優(yōu)選為9000～11000rpm，最優(yōu)選為10000rpm。在本發(fā)明中，所述離心的時間優(yōu)選為10～15min，更優(yōu)選為12min。本發(fā)明中，所述固液分離后得到的石斛殘渣優(yōu)選再次與有機溶劑混合后磨碎，得到的石斛漿液再進行超聲破碎，收集上清液。將本次得到的上清液與上次得到的上清液合并進入下步驟處理。本發(fā)明中，所述再次與有機溶劑混合的石斛殘渣與有機溶劑的混合比例與上述方案相同。所述超聲破碎的參數(shù)與上述步驟超聲破碎的參數(shù)均相同，在此不做贅述。得到上清液后，本發(fā)明將所述上清液進行濃縮，得到提取物干粉。本發(fā)明中，所述濃縮優(yōu)選為氮氣吹干濃縮。所述氮氣吹干濃縮的時間為40～100min，更優(yōu)選為60min。本發(fā)明中，所述氮氣吹干濃縮優(yōu)選采用氮氣吹干儀進行。所述氮氣吹干儀的來源沒有特殊限制，采用本領域所熟知的氮氣吹干儀即可。本發(fā)明實施例中，所述氮氣吹干儀購自杭州奧盛儀器有限公司。得到提取物干粉后，本發(fā)明將所述提取物干粉與硫酸溶液混合，得到混合液，調(diào)節(jié)所述混合液的pH值至9.5～10.5，將得到的堿性混合液靜置。本發(fā)明中，所述提取干粉與硫酸溶液混合的方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的混合的技術方案即可。所述混合按照提取物干粉的質(zhì)量與硫酸溶液的體積比優(yōu)選為(7～11)mg：(1～2)mL，更優(yōu)選為(8～9)mg：(1～1.5)mL。所述硫酸溶液的體積濃度優(yōu)選為8％～12％，更優(yōu)選為10％。本發(fā)明中，所述調(diào)整混合液的pH值優(yōu)選至10。所述調(diào)整pH的溶液優(yōu)選為氨水。所述氨水的質(zhì)量分數(shù)優(yōu)選為20～30％，更優(yōu)選為25％。本發(fā)明中，所述靜置的時間優(yōu)選為30～50min，更優(yōu)選為40min。所述靜置的目的是使生物堿鹽更加充分地轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x生物堿。所述靜置后，本發(fā)明將所述靜置后的堿性混合液與二氯甲烷混合，離心，得到二氯甲烷相。本發(fā)明中，所述堿性混合液與二氯甲烷的體積比優(yōu)選為(2～3)mL：(1～2)mL，更優(yōu)選為2～2.5：1～1.5。本發(fā)明中，所述離心得轉(zhuǎn)速優(yōu)選為3500～5000rpm，更優(yōu)選為4000rpm。本發(fā)明中所述離心的時間優(yōu)選為15～20min，更優(yōu)選為18min。離心后，小心收集二氯甲烷相至新的離心管中。本發(fā)明中，所述收集的方法優(yōu)選采用移液器吸取二氯甲烷相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。本發(fā)明中，得到二氯甲烷相后，優(yōu)選重復上述步驟，將剩余萃取液與純二氯甲烷混合，固液分離后，收集下層二氯甲烷相于新的離心管中，合并兩次下層溶液。所述混合優(yōu)選渦旋方法。所述渦旋的時間優(yōu)選為30～40s。得到二氯甲烷相后，本發(fā)明將所述二氯甲烷相濃縮，得到生物堿干粉。本發(fā)明中，所述濃縮優(yōu)選為氮氣吹干濃縮。所述氮氣吹干濃縮的時間為40～100min，更優(yōu)選為60min。本發(fā)明中，所述氮氣吹干濃縮優(yōu)選采用氮氣吹干儀進行。所述氮氣吹干儀的來源沒有特殊限制，采用本領域所熟知的氮氣吹干儀即可。本發(fā)明實施例中，所述氮氣吹干儀購自杭州奧盛儀器有限公司。得到生物堿干粉后，本發(fā)明將所述生物堿干粉用無水甲醇復溶，固液分離后得到游離生物堿待測樣品。所述生物堿干粉的質(zhì)量與無水甲醇體積比優(yōu)選為(0.6～1.2)mg：(500～800)μL，更優(yōu)選為(0.8～1.0)mg：(500～600)μL。得到復溶的溶液后優(yōu)選將復溶液進行過濾。所述過濾優(yōu)選采用膜過濾。所述過濾膜的孔徑優(yōu)選為0.22μm。得到過濾的游離生物堿待測樣品，本發(fā)明用超高效液相色譜分離所述游離生物堿待測樣品，將分離后的生物堿成分用質(zhì)譜檢測，得到生物堿成分物質(zhì)峰。本發(fā)明中，所述色譜分離條件優(yōu)選包括如下參數(shù)：色譜柱為HypersilGOLD液相色譜柱；所述HypersilGOLD液相色譜柱的規(guī)格為2.1mm×100mm×1.9μm；柱溫為40℃；洗脫系統(tǒng)流動相A為體積濃度0.1％甲酸水溶液，流動相B為體積濃度0.1％甲酸乙腈溶液；洗脫的流速為0.35mL/min；進樣體積為5μL；流動相梯度洗脫程序：(0,1min)，流動相A與流動相B的體積比19：1的混合液；[1min,24min)，流動相A與流動相B的體積比為恒定值，所述恒定值的范圍為1：19～19：1；[24min,28min)，流動相A與流動相B的體積比為1：19；[28min,28.1min)，流動相A與流動相B的體積比為恒定值，所述恒定值的范圍為1：19～19：1；[28.1,30min]，流動相A與流動相B的體積比為19：1。本發(fā)明中，所述質(zhì)譜檢測條件優(yōu)選包括以下參數(shù)：離子源為電噴霧離子源(ESI)，正離子模式檢測；鞘氣，30自由單位；輔助氣，6自由單位；噴霧電壓，3.8kV；離子傳輸毛細管溫度為350℃，源加熱溫度為350℃；母離子掃描范圍：50-1000m/z，數(shù)據(jù)依賴的掃描模式，每次全掃描后采集最強的5個碎片圖譜進行二級質(zhì)譜掃描；碎裂方式：碰撞誘導解離，正態(tài)化能量30％，q值0.25，活化時間為30ms，動態(tài)排除時間為5s；一級質(zhì)譜在m/z400時分辨率為30000，二級質(zhì)譜在m/z400時分辨率為30000。得到生物堿成分物質(zhì)峰，本發(fā)明用OSI/SMMS軟件對所述生物堿成分物質(zhì)峰進行定性分析。本發(fā)明中，所述定性分析優(yōu)選方案步驟為：(1)從質(zhì)譜總離子流圖中提取出物質(zhì)峰，得到精確的分子量；(2)根據(jù)化合物峰的一級、二級質(zhì)譜離子碎片信息搜索數(shù)據(jù)庫，得到數(shù)據(jù)庫中與篩選的物質(zhì)相匹配的質(zhì)譜碎片信息；(3)將加合離子類別、分子量誤差、保留時間、相關文獻和步驟(2)中得到的質(zhì)譜碎裂信息結合分析，得到化合物的結構。本發(fā)明中，所述物質(zhì)峰是質(zhì)譜能夠檢測到的峰。本發(fā)明中，所述的數(shù)據(jù)庫包括HMDB、Metlin、Lipidmaps、MMCD等網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫和自建數(shù)據(jù)庫。本發(fā)明中，所述加合離子類別包括M+H，M+Na，M+NH4等。本發(fā)明中，所述分子量誤差為絕對值小于10mmu。下面結合實施例對本發(fā)明提供的基于UPLC/LTQ-OrbitrapVelosMS檢測石斛生物堿成分的方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。實施例11、儀器與試藥1.1儀器：UHPLC液相系統(tǒng)Ultimate3000(ThermoFisherScientific，Waltham，MA，USA)和質(zhì)譜LTQOrbitrapVelosPro(ThermoFisherScientific，Waltham，MA，USA)。1.2試藥：鐵皮石斛類原球莖材料由安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院提供，甲醇、乙腈為色譜級，其他試劑為分析純。石斛材料的預處理取石斛類原球莖于105℃烘箱中殺青20min后，于60℃烘箱中烘干至恒重。石斛生物堿類成分的提取(1)取烘干的石斛樣品50～80mg于2mL離心管中，加入1mL純甲醇溶液后用球磨儀磨碎。(2)25～30℃超聲提取30min，11000rpm離心10～15min，取上清700～800μL上清于新的離心管中。(3)重復上述步驟，向沉淀中加入1mL純甲醇溶液，渦旋30～45s，25～30℃超聲提取30min(超聲功率120w)，取800～900μL上清于新的離心管中，合并兩次上清溶液。(4)上清溶液用氮氣吹干后，加入1～2mL10％硫酸溶液(v/v)，渦旋1～2min后用25％的氨水(m/m)調(diào)節(jié)pH至10，室溫下靜置30～50min。(5)加入1mL純二氯甲烷溶液，渦旋30～40s后，4000rpm離心15～20min，取下層二氯甲烷相溶液700～800μL于新的離心管中。(6)重復上述步驟，向剩余萃取液中加入1mL純二氯甲烷溶液，渦旋30～40s后，4000rpm離心15～20min，取下層二氯甲烷相溶液800～900μL于新的離心管中，合并兩次下層溶液。(7)二氯甲烷相溶液用氮氣吹干后，加入500～600μL純甲醇溶液復溶后，11000rpm離心10～15min，過0.22μm濾膜后即可進行分析。4.樣品的分離和檢測色譜條件：色譜柱為HypersilGOLD液相色譜柱(C18，2.1mm×100mm×1.9μm)；柱溫為40℃；洗脫系統(tǒng)為正離子模式下流動相A為0.1％(v/v)甲酸水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；流速為0.35mL/min；進樣體積5μL；梯度洗脫程序如表1所示表1流動相梯度洗脫參數(shù)時間(min)流動相A(％)流動相B(％)09551955240952809528.195530955質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源，正離子模式檢測；鞘氣，30自由單位；輔助氣，6自由單位；噴霧電壓，3.8kV；離子傳輸毛細管溫度為350℃，源加熱溫度為350℃，使用前經(jīng)標準校正液校正。母離子掃描范圍：50-1000m/z，數(shù)據(jù)依賴的掃描模式，每次全掃描后采集最強的5個碎片圖譜進行二級質(zhì)譜掃描。碎裂方式：碰撞誘導解離，正態(tài)化能量30％，q值0.25，活化時間為30ms，動態(tài)排除時間為5s。MS1在m/z400時分辨率為30000，MS2在m/z400時分辨率為30000。5.石斛新類型生物堿成分的定性分析采用多層次定性體系的代謝小分子化合物快速鑒定分析系統(tǒng)(OSI/SMMS)對生物堿成分物質(zhì)峰進行定性。共分離鑒定出22種生物堿成分，包括莨菪烷生物堿2種，單萜生物堿1種，單萜吲哚生物堿2種，吡咯烷生物堿3種，異喹啉生物堿4種，二萜生物堿1種，喹諾里西啶型生物堿3種，哌啶生物堿1種，甾體生物堿2種，其他生物堿3種。具體結果如表2所示。以喹諾里西啶型生物堿Luciduline為例，從總離子流圖中(圖1)提取出m/z225.19556(圖2)。在正離子模式下，一級質(zhì)譜準分子離子峰為m/z225.19556[M+NH4]+(圖3)，二級質(zhì)譜中存在m/z100.11213、m/z143.11813等離子碎片(圖4)。根據(jù)分子量、離子碎片信息及化合物數(shù)據(jù)庫推測該化合物為Luciduline，其分子式為C13H21NO。表2鐵皮石斛類原球莖中新類型生物堿成分以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3