本發(fā)明屬于植物形態(tài)學技術領域，涉及一種大麻品種間形態(tài)學差異性的評價方法。

背景技術：

大麻(Cannabis sativa L.)，又稱線麻、火麻等，是大麻科(Cannabinaceae)，大麻屬，一年生直立草本。原產(chǎn)錫金、不丹等國，現(xiàn)各國均有野生或栽培，我國各地也有栽培。根據(jù)植株中四氫大麻酚含量和用途劃分，可將大麻劃分為纖維用、籽用(THC＜0.3％)和藥用(THC＞0.3％)3類。大麻纖維是人類歷史上應用最早的纖維，其韌度高、可自然分解，是優(yōu)秀的紡織原料。用大麻纖維編織的衣物具有抑菌防臭、吸濕排汗、耐曬防腐、防紫外線效果好等優(yōu)良品質(zhì)。大麻籽油可通過壓榨或浸取等方法獲得，其在工業(yè)上可作為肥皂和油漆等產(chǎn)品的原料，經(jīng)精煉后亦可食用。除此之外，大麻還是板材等建筑材料的優(yōu)質(zhì)原料。大麻全草均可入藥，其主要活性成分包括：大麻酚(CDB)、大麻二酚(CBN)、大麻環(huán)萜酚(CBC)和四氫大麻酚(THC)等。在古代，草藥醫(yī)師就已經(jīng)開始用大麻止痛，治療慢性風濕性關節(jié)炎、驚厥等各種疾病。現(xiàn)代研究還表明大麻的部分成分對治療青光眼、多發(fā)性硬化癥、中風后遺癥、癌癥化療引起的惡心與嘔吐等有特效。

目前，大麻植物育種主要采用系統(tǒng)育種法和雜交育種法。種植資源主要來源于各科研機構間的相互交換或由烏克蘭、俄羅斯和波蘭等國引進。新品種通常也是利用這些種質(zhì)資源進行雜交選育和篩選后所得。但種質(zhì)資源引入時常無法得到引入品種親本信息，導致通過不同途徑所引入的大麻品種的外形和工藝性狀可能極為相似，甚至是同一品種的近緣種情況，給新品種選育工作帶來極大不便，而與之相對應也增加了科研資源的消耗。因此，為提高科研資源利用率、篩選合適親本、提高新品種選育效率，利用簡單、快速、低成本的評價方法對大麻品種間差異性進行初步評價的工作十分必要，但目前大麻品種間形態(tài)學差異性的評價方法尚未見報導。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種簡單、快速、低成本的大麻品種間差異性比較的形態(tài)學觀察方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種大麻品種差異性比較形態(tài)學觀察方法，包括如下步驟：

一、獲取觀察植株

選取相同栽培條件下種植的處于同一幼苗期、現(xiàn)蕾期、盛花期或工藝成熟期的大麻品種植株作為待比較植株；

二、收集植株形態(tài)學數(shù)據(jù)

(1)將取材部位分為如下4個區(qū)：

A區(qū)：大麻莖下1/3處；B區(qū)：大麻莖1/2處；C區(qū)：大麻莖上1/3處；D區(qū)：大麻莖頂端。

(2)外形數(shù)據(jù)觀測：

(a)幼苗期觀測指標：

株高、B區(qū)直徑、第一真葉葉長、葉片長、葉片寬、葉柄長。

(b)現(xiàn)蕾期、盛花期、工藝成熟期觀測指標：

株高、A區(qū)直徑、B區(qū)直徑、B區(qū)節(jié)長、C區(qū)直徑、葉長、中裂片長、中裂片寬、葉柄長。

(3)顯微結構數(shù)據(jù)觀測

(a)取材：

分別截取莖A、B、C區(qū)0.5～3cm長莖桿，D區(qū)截取從植株頂端至其下0.5～3cm處莖桿。

幼苗期取第一真葉，現(xiàn)蕾期、盛花期、工藝成熟期切取距離C區(qū)最近葉片中裂片中央?yún)^(qū)域2～4cm²葉片。

將上述材料置于FAA固定液或70～100％乙醇中固定24h以上。

(b)莖結構觀測：

取固定好的莖材料，用雙面刀片制作莖橫切面徒手切片將切片置于載玻片上，滴加蒸餾水或50％甘油，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察并測量。

(c)葉片毛狀體數(shù)量觀測：

將葉片腹面朝上置于載玻片上，滴加蒸餾水或50％甘油，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察并計數(shù)。

(d)幼苗期觀測指標：

B區(qū)髓直徑、B區(qū)髓腔直徑、葉片毛狀體數(shù)、乳汁管數(shù)量。

(e)現(xiàn)蕾期觀測指標：

A區(qū)髓直徑、A區(qū)初生纖維層厚度、B區(qū)髓直徑、B區(qū)初生纖維層厚度、B區(qū)初生纖維層面積、C區(qū)髓直徑、C區(qū)初生纖維層厚度、葉片毛狀體數(shù)、乳汁管數(shù)量。

(f)盛花期、工藝成熟期觀測指標：

A區(qū)髓直徑、A區(qū)初生纖維層厚度、A區(qū)次生纖維層厚度、B區(qū)髓直徑、B區(qū)初生纖維層厚度、B區(qū)初生纖維層面積、C區(qū)髓直徑、C區(qū)初生纖維層厚度、葉片毛狀體數(shù)、乳汁管數(shù)量。

三、數(shù)據(jù)變型

對上述獲得的大麻形態(tài)指標轉(zhuǎn)化為表1所示代碼作為參比特征，其中：

幼苗期參比特征：A、B、C、E、F、G、M、N；

現(xiàn)蕾期參比特征：A、B、C、D、E、F、G、H、J、K、L、M、O、P；

盛花期及工藝成熟期參比特征：A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、O、P。

四、大麻品種差異性比較

(1)差異顯著性分析

對處于同一發(fā)育時期的待比較品種，利用統(tǒng)計軟件對參比特征進行單因素方差分析。

(2)形態(tài)指標差異性評分

經(jīng)單因素方差分析后，差異不顯著計“0”分，差異顯著計“1”分，差異極顯著計“2”分；待完成所有形態(tài)指標的差異性評分后，計算總得分，分值越高則表示待比較植株在此發(fā)育時期的形態(tài)學差異性就越大，反之則小。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1、該方法適用于品種間差異性的快速比較。

2、實驗效率高、操作方法簡便，可操作性強。

3、實驗成本低，儀器方面僅需1套具有測量功能的顯微成像系統(tǒng)，實驗涉及工具及試劑僅有雙面刀片、乙醇、甲醛、冰醋酸、甘油和蒸餾水。

4、若用乙醇作為固定液，則整個實驗過程均未使用有毒藥品，安全性高。

附圖說明

圖1為材料取材區(qū)域劃分示意圖；

圖2為B區(qū)初生纖維層面積測量部位示意圖；

圖3為D區(qū)乳汁管數(shù)量統(tǒng)計位置示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍中。

具體實施方式一：本實施方式提供了一種大麻品種差異性比較形態(tài)學觀察方法，具體實施步驟如下：

1、獲取觀察植株

選取相同栽培條件下種植的處于同一發(fā)育時期待比較大麻品種植株(如外形和工藝性狀極為相似或需判斷是否是近緣種的大麻品種)各5株作為材料。發(fā)育時期可選擇，幼苗期(4～6葉期)、現(xiàn)蕾期、盛花期及工藝成熟期。

2、收集形態(tài)學數(shù)據(jù)

為便于描述，將取材部位分為4個區(qū)。A區(qū)：大麻莖下1/3處；B區(qū)：大麻莖1/2處；C區(qū)：大麻莖上1/3處；D區(qū)：大麻莖頂端。幼苗葉特征為第一真葉特征?，F(xiàn)蕾期、盛花期及工業(yè)成熟期葉特征為C區(qū)葉特征或距離C區(qū)最近葉特征。具體區(qū)域劃分如圖1所示。

(1)外形數(shù)據(jù)觀測方法及部位

(a)外形數(shù)據(jù)觀測方法：

外形數(shù)據(jù)用卷尺及游標卡尺測量。

(b)幼苗期觀測指標：

株高、B區(qū)直徑、第一真葉葉長、葉片長、葉片寬、葉柄長。

(c)現(xiàn)蕾期觀測指標：

株高、A區(qū)直徑、B區(qū)直徑、B區(qū)節(jié)長、C區(qū)直徑、葉長、中裂片長、中裂片寬、葉柄長。

(d)盛花期觀測指標：

同現(xiàn)蕾期。

(e)工藝成熟期觀測指標：

同現(xiàn)蕾期。

(2)顯微結構數(shù)據(jù)觀測方法及部位

(a)取材：

分別截取莖A、B、C區(qū)0.5～3cm長莖桿，D區(qū)截取從植株頂端至其下0.5～3cm處莖桿。切取距離C區(qū)最近葉片中裂片(幼苗期取第一真葉)中央?yún)^(qū)域2～4cm²葉片。將上述材料置于FAA固定液(甲醛、冰醋酸、70％乙醇，按照1:1:18體積比混合而成)或70～100％乙醇(85％以上乙醇固定的葉片，在觀察前需用蒸餾水浸泡5min)中固定24h以上。

(b)莖結構觀測方法：

取固定好的莖材料，用雙面刀片制作莖橫切面徒手切片，切片厚度10～500μm均可。將切片置于載玻片上，滴加蒸餾水或50％甘油，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察并測量。

(c)葉片毛狀體數(shù)量觀測方法：

將葉片腹面朝上置于載玻片上，滴加蒸餾水或50％甘油，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察并計數(shù)。

(d)幼苗期觀測指標：

B區(qū)髓直徑；B區(qū)髓腔直徑；葉片毛狀體數(shù)；乳汁管數(shù)量。

(e)現(xiàn)蕾期觀測指標：

A區(qū)髓直徑；A區(qū)初生纖維層厚度；B區(qū)髓直徑；B區(qū)初生纖維層厚度；B區(qū)初生纖維層面積；C區(qū)髓直徑；C區(qū)初生纖維層厚度；葉片毛狀體數(shù)；乳汁管數(shù)量。

(f)盛花期觀測指標：

A區(qū)髓直徑；A區(qū)初生纖維層厚度；A區(qū)次生纖維層厚度；B區(qū)髓直徑；B區(qū)初生纖維層厚度；B區(qū)初生纖維層面積；C區(qū)髓直徑；C區(qū)初生纖維層厚度；葉片毛狀體數(shù)；乳汁管數(shù)量。

(e)工藝成熟期觀測指標：

同盛花期。

(f)觀測指標補充說明：

①所有觀測數(shù)值均為所觀測部位各指標最大值(例如，大麻莖橫切面外圍輪廓似橢圓形時，該部位直徑為橢圓形的長軸長度)。

②初生纖維層厚度：莖橫切面隨機測得5個初生纖維層厚度的平均值。

③次生纖維層厚度：莖橫切面隨機測量5個次生纖維層厚度的平均值。

④初生纖維層面積：以B區(qū)莖橫切面中心為原點，將莖按照輻射狀均等分割為12份，若莖橫切面近圓形，則隨機選取其中一份，用顯微成像系統(tǒng)直接測量初生纖維層橫切面面積。若莖橫切面近橢圓形，則測量橢圓形最短軸附近初生纖維層面積，具體取樣位置如圖2所示。

⑤乳汁管數(shù)量：以D區(qū)莖橫切面近橢圓形，中心為原點，將莖按照輻射狀均等分割為12份，測量橢圓形最短軸附近1份區(qū)域中乳汁管數(shù)量，具體取樣位置如圖3所示。

⑥葉片毛狀體數(shù)：葉片腹面中隨機選取3個視野(避開葉脈)，利用顯微成像系統(tǒng)對每個視野中1mm²面積中的毛狀體數(shù)量進行統(tǒng)計，取平均值。

3、數(shù)據(jù)變型

除株高、葉長及乳汁管數(shù)量3個指標直接使用外，其余測量數(shù)據(jù)需進行變型處理，并用字母A、B、C……作為直接使用指標及變型后新形成指標的代碼，具體內(nèi)容見表1。

表1大麻形態(tài)指標匯總表

4、大麻品種差異性比較

(1)差異顯著性分析

對處于同一發(fā)育時期的待比較品種，利用SPSS、DPS或EXCEL等統(tǒng)計軟件對表1中的指標進行單因素方差分析(不同發(fā)育時期參比特征不盡相同，具體內(nèi)容如下，幼苗期參比特征：A、B、C、E、F、G、M、N；現(xiàn)蕾期參比特征：A、B、C、D、E、F、G、H、J、K、L、M、O、P；盛花期及工藝成熟期參比特征：A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、O、P)。

(2)形態(tài)指標差異性評分

處于相同發(fā)育時期不同品種的同一指標，經(jīng)單因素方差分析后，差異不顯著計“0”分，差異顯著計“1”分，差異極顯著計“2”分。

待完成所有形態(tài)指標的差異性評分后，計算總得分。此得分既為此2個品種的形態(tài)學差異性得分。分值越高則表示此不同植株在此發(fā)育時期的形態(tài)學差異性就越大，反之則小。在雜交育種選擇親本時建議先選擇工藝性狀好，且形態(tài)學差異性大的品種作為雜交育種的父母本。

具體實施方式二：本實施方式提供了一種大麻品種差異性比較形態(tài)學觀察方法，具體實施步驟如下：

1、獲取觀察植株

采集相同栽培條件下種植的大麻品種“火麻1號”及“Silesia”盛花期植株各5株。

2、收集形態(tài)學數(shù)據(jù)

(1)外形數(shù)據(jù)觀測方法及指標

(a)外形數(shù)據(jù)觀測方法：

外形數(shù)據(jù)用卷尺及游標卡尺測量。

(b)觀測指標：

株高、A區(qū)直徑、B區(qū)直徑、B區(qū)節(jié)長、C區(qū)直徑、葉長、中裂片長、中裂片寬、葉柄長。

(2)顯微結構數(shù)據(jù)觀測方法及指標

(a)取材：

分別截取莖A、B、C區(qū)3cm長莖桿，D區(qū)截取從植株頂端至其下3cm處莖桿。

切取距離C區(qū)最近葉片中裂片中央?yún)^(qū)域4cm²葉片。

將上述材料置于FAA固定液(甲醛、冰醋酸、70％乙醇，按照1:1:18體積比混合而成)中固定24h以上。

(b)莖結構觀測方法：

取固定好的莖材料，用雙面刀片制作莖橫切面徒手切片。將切片置于載玻片上，滴加蒸餾水，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察并測量。

(c)葉片毛狀體數(shù)量觀測方法：

將葉片腹面朝上置于載玻片上，滴加蒸餾水上蓋玻片，顯微鏡下觀察并計數(shù)。

(d)觀測指標：

A區(qū)髓直徑；A區(qū)初生纖維層厚度；A區(qū)次生纖維層厚度；B區(qū)髓直徑；B區(qū)初生纖維層厚度；B區(qū)初生纖維層面積；C區(qū)髓直徑；C區(qū)初生纖維層厚度；葉片毛狀體數(shù)；乳汁管數(shù)量。

3、數(shù)據(jù)變型

依據(jù)表1內(nèi)容，對觀測數(shù)據(jù)進行變型處理，保留A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、O、P代碼指標。

4、大麻品種差異性比較

(1)差異顯著性分析

利用SPSS、DPS或EXCEL等統(tǒng)計軟件對處于盛花期的大麻品種“火麻1號”及“Silesia”的A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、O、P指標分別進行單因素方差分析。

(2)形態(tài)指標差異性評分

處于盛花期的大麻品種“火麻1號”及“Silesia”的A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、O、P指標，經(jīng)單因素方差分析后，差異不顯著計“0”分，差異顯著計“1”分，差異極顯著計“2”分。

待完成所有形態(tài)指標的差異性評分后，計算總得分。此得分既為“火麻1號”及“Silesia”盛花期形態(tài)學差異性得分，結果如表2所示，“火麻1號”與“Silesia”在盛花期的差異性得分為“22”分。

表2差異性評價得分表

具體實施方式三：本實施方式提供了一種大麻品種差異性比較形態(tài)學觀察方法，具體實施步驟如下：

1、獲取觀察植株

采集相同栽培條件下種植的大麻品種“Silesia”及“格里昂”現(xiàn)蕾期植株各5株。

2、收集形態(tài)學數(shù)據(jù)

(1)外形數(shù)據(jù)觀測方法及指標

(a)外形數(shù)據(jù)觀測方法：

外形數(shù)據(jù)用卷尺及游標卡尺測量。

(b)觀測指標：

株高、A區(qū)直徑、B區(qū)直徑、B區(qū)節(jié)長、C區(qū)直徑、葉長、中裂片長、中裂片寬、葉柄長。

(2)顯微結構數(shù)據(jù)觀測方法及指標

(a)取材：

分別截取莖A、B、C區(qū)3cm長莖桿，D區(qū)截取從植株頂端至其下2cm處莖桿。

切取距離C區(qū)最近葉片中裂片中央?yún)^(qū)域3cm²葉片。

將上述材料置于70％乙醇中固定24h以上。

(b)莖結構觀測方法：

取固定好的莖材料，用雙面刀片制作莖橫切面徒手切片。將切片置于載玻片上，滴加50％甘油，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察并測量。

(c)葉片毛狀體數(shù)量觀測方法：

將葉片腹面朝上置于載玻片上，滴加50％甘油，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察并計數(shù)。

(d)觀測指標：

A區(qū)髓直徑、A區(qū)初生纖維層厚度、B區(qū)髓直徑、B區(qū)初生纖維層厚度、B區(qū)初生纖維層面積、C區(qū)髓直徑、C區(qū)初生纖維層厚度、葉片毛狀體數(shù)、乳汁管數(shù)量。

3、數(shù)據(jù)變型

依據(jù)表1內(nèi)容，對觀測數(shù)據(jù)進行變型處理，保留A、B、C、D、E、F、G、H、J、K、L、M、O、P代碼指標。

4、大麻品種差異性比較

(1)差異顯著性分析

利用SPSS、DPS或EXCEL等統(tǒng)計軟件對處于盛花期的大麻品種“Silesia”及“格里昂”的A、B、C、D、E、F、G、H、J、K、L、M、O、P指標分別進行單因素方差分析。

(2)形態(tài)指標差異性評分

處于盛花期的大麻品種“Silesia”及“格里昂”的A、B、C、D、E、F、G、H、J、K、L、M、O、P指標，經(jīng)單因素方差分析后，差異不顯著計“0”分，差異顯著計“1”分，差異極顯著計“2”分。

待完成所有形態(tài)指標的差異性評分后，計算總得分。此得分既為“Silesia”及“格里昂”現(xiàn)蕾期形態(tài)學差異性得分，結果如表3所示，“Silesia”及“格里昂”在現(xiàn)蕾期的差異性得分為“11”分。

表3差異性評價得分表