本發(fā)明屬于食品檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種快速檢測(cè)細(xì)交鏈格孢菌酮酸的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)交鏈格孢菌酮酸(tenμazonic acid，TA)是鏈格孢霉、稻瘟病霉、高粱點(diǎn)霉等在特定條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物之一，是繼交鏈孢酚(Alternariol,AOH)、交鏈孢酚單甲醚(Alternariol monomethyl ether，AME)后發(fā)現(xiàn)的一種鏈格孢霉毒素。TA是一種廣泛存在于谷物、蔬菜、水果中的天然毒物，它能在生長(zhǎng)、加工、貯藏等環(huán)節(jié)產(chǎn)生，在小麥、番茄醬、食用油、葡萄酒等農(nóng)產(chǎn)品中均曾發(fā)現(xiàn)過(guò)TA污染。各種鏈格孢霉毒素中，TA毒性最強(qiáng)，長(zhǎng)期食用被TA污染的食品，可能會(huì)嚴(yán)重危害人體健康。雄性小鼠經(jīng)口半致死量為182mg/kg，雌性小鼠經(jīng)口半致死量為81mg/kg。有研究報(bào)道指出，TA與某些其他真菌毒素復(fù)合污染時(shí)，會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)使毒性作用增強(qiáng)，加大對(duì)人體和動(dòng)物的健康威脅。由于TA具有多種生物學(xué)特性，在各種鏈格孢霉毒素中對(duì)哺乳類(lèi)動(dòng)物的毒性最大，是目前鏈格孢霉毒素中被研究最多的一種毒素。隨著人們安全意識(shí)的提高，對(duì)真菌毒素的檢測(cè)要求也越來(lái)越高。TA常用檢測(cè)方法有氣相色譜法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等，但這些方法對(duì)設(shè)備和人員的素質(zhì)要求較高、耗時(shí)長(zhǎng)、設(shè)備昂貴，不適合大批量和快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，所以急需一種簡(jiǎn)單快速高靈敏的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)細(xì)交鏈格孢菌酮酸的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、一種快速檢測(cè)細(xì)交鏈格孢菌酮酸的方法，包括如下步驟：

(1)取酶標(biāo)板，每孔加入細(xì)交鏈格孢菌酮酸與BSA的偶聯(lián)物，孵育后洗板，拍干，然后向每孔加入封閉液進(jìn)行封閉，再洗板，拍干，得到細(xì)交鏈格孢菌酮酸與BSA的偶聯(lián)物包被的酶標(biāo)板；

(2)將固體糧食粉碎后過(guò)40～60目篩，獲得固體糧食顆粒，將所述固體糧食顆粒加入甲醇溶液中，渦旋震蕩后離心，取上清液與NaCl溶液混合后加入PBS進(jìn)行稀釋?zhuān)频么郎y(cè)樣品溶液；

(3)將細(xì)交鏈格孢菌酮酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成一系列的濃度梯度，然后將不同濃度的細(xì)交鏈格孢菌酮酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別加入步驟(1)中的酶標(biāo)板的標(biāo)準(zhǔn)孔中，將步驟(2)中制得的待測(cè)樣品溶液加入所述酶標(biāo)板的樣品孔中，然后向所述酶標(biāo)板的每孔加入細(xì)交鏈格孢菌酮酸抗體，孵育后洗板，拍干；再向所述酶標(biāo)板的每孔加入酶標(biāo)二抗，孵育后洗板，拍干；最后向所述酶標(biāo)板的每孔加入化學(xué)發(fā)光液，輕拍混勻，利用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定各孔的發(fā)光值RLU；

(4)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析，即得樣品中細(xì)交鏈孢菌酮酸的含量。

進(jìn)一步優(yōu)化，包括如下步驟：

(1)取酶標(biāo)板，每孔加入經(jīng)碳酸鹽緩沖液稀釋后的細(xì)交鏈格孢菌酮酸與BSA的偶聯(lián)物，4℃孵育12h后以PBST緩沖液洗板，拍干，然后按200μL/孔向每孔加入封閉液在37℃下封閉60min，PBST緩沖液洗板，拍干，得到細(xì)交鏈格孢菌酮酸與BSA偶聯(lián)物包被的酶標(biāo)板，包被濃度為0.5～4.0μg/mL，包被量為100μL/孔；所述碳酸鹽緩沖液濃度為0.05mol/L，pH為9.6；所述PBST緩沖液濃度為0.01mol/L，pH為7.4；

(2)將固體糧食粉碎后過(guò)40目篩，獲得固體糧食顆粒，按料液比(g/mL)1:15將所述固體糧食顆粒加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50～100％甲醇溶液中，渦旋震蕩5min后以4000r/min離心10min，取上清液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的NaCl溶液等體積混合后加入PBS緩沖液稀釋25倍，制得待測(cè)樣品溶液；所述PBS緩沖液濃度為0.01mol/L，pH為5.8～8.0；

(3)以步驟(2)中PBS緩沖液將濃度為1.0mg/mL細(xì)交鏈格孢菌酮酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成0.018、0.054、0.164、0.494、1.481、4.444、13.333、40ng/mL 7個(gè)濃度，然后將不同濃度的細(xì)交鏈格孢菌酮酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液各取50μL分別加入步驟(1)中的酶標(biāo)板的標(biāo)準(zhǔn)孔中，取50μL步驟(2)中制得的待測(cè)樣品溶液加入所述酶標(biāo)板的樣品孔中，然后向所述酶標(biāo)板的每孔加入50μL細(xì)交鏈格孢菌酮酸抗體，37℃下孵育15～60min后以步驟(1)中PBST緩沖液洗板，拍干；再向所述酶標(biāo)板的每孔加入100μL酶標(biāo)二抗，37℃下孵育60min后以步驟(1)中PBST緩沖液洗板，拍干；最后向所述酶標(biāo)板的每孔加入50～150μL化學(xué)發(fā)光液，輕拍混勻，利用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定各孔的發(fā)光值RLU；所述細(xì)交鏈格孢菌酮酸抗體經(jīng)步驟(2)中PBS緩沖液稀釋40000～100000倍；所述酶標(biāo)二抗經(jīng)步驟(2)中PBS緩沖液稀釋4000～10000倍；

(4)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析，即得樣品中細(xì)交鏈孢菌酮酸的含量。

進(jìn)一步優(yōu)化，包括如下步驟：

(1)取酶標(biāo)板，每孔加入經(jīng)碳酸鹽緩沖液稀釋后的細(xì)交鏈格孢菌酮酸與BSA的偶聯(lián)物，4℃孵育12h后以PBST緩沖液洗板，拍干，然后按200μL/孔向每孔加入封閉液在37℃下封閉60min，PBST緩沖液洗板，拍干，得到細(xì)交鏈格孢菌酮酸與BSA的偶聯(lián)物包被的酶標(biāo)板，包被濃度為2μg/mL，包被量為100μL/孔；所述經(jīng)碳酸鹽緩沖液濃度為0.05mol/L，pH為9.6；所述PBST緩沖液濃度為0.01mol/L，pH為7.4；

(2)將固體糧食粉碎后過(guò)40目篩，獲得固體糧食顆粒，按料液比(g/mL)1:15將所述固體糧食顆粒加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50～100％甲醇溶液中，渦旋震蕩5min后以4000r/min離心10min，取上清液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的NaCl溶液等體積混合后加入PBS緩沖液稀釋25倍，制得待測(cè)樣品溶液；所述PBS緩沖液濃度為0.01mol/L，pH為7.4；

(3)以步驟(2)中PBS緩沖液將濃度為1.0mg/mL細(xì)交鏈格孢菌酮酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成0.018、0.054、0.164、0.494、1.481、4.444、13.333、40ng/mL 7個(gè)濃度，然后將不同濃度的細(xì)交鏈格孢菌酮酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液各取50μL分別加入步驟(1)中的酶標(biāo)板的標(biāo)準(zhǔn)孔中，取50μL步驟(2)中制得的待測(cè)樣品溶液加入所述酶標(biāo)板的樣品孔中，然后向所述酶標(biāo)板的每孔加入50μL細(xì)交鏈格孢菌酮酸抗體，37℃下孵育30min后以步驟(1)中PBST緩沖液洗板，拍干；再向所述酶標(biāo)板的每孔加入100μL酶標(biāo)二抗，37℃下孵育60min后以步驟(1)中PBST緩沖液洗板，拍干；最后向所述酶標(biāo)板的每孔加入125μL化學(xué)發(fā)光液，輕拍混勻，利用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定各孔的發(fā)光值RLU；所述細(xì)交鏈格孢菌酮酸抗體經(jīng)步驟(2)中PBS緩沖液稀釋80000倍；所述酶標(biāo)二抗經(jīng)步驟(2)中PBS緩沖液稀釋8000倍；

(4)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析，即得樣品中細(xì)交鏈孢菌酮酸的含量。

進(jìn)一步優(yōu)化，步驟(1)中，所述酶標(biāo)板為96孔可拆化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板。

進(jìn)一步優(yōu)化，步驟(1)中，所述封閉液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0％的脫脂奶粉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.0％的脫脂奶粉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的BSA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0％的BSA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的OVA或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0％的OVA中的一種。

進(jìn)一步優(yōu)化，步驟(3)中，所述細(xì)交鏈格孢菌酮酸抗體為細(xì)交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體。

進(jìn)一步優(yōu)化，步驟(3)中，所述酶標(biāo)二抗為辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG。

進(jìn)一步優(yōu)化，步驟(3)中，所述化學(xué)發(fā)光物質(zhì)為ECL發(fā)光試劑。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)細(xì)交鏈格孢菌酮酸的方法，該方法為以辣根過(guò)氧化酶催化魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光體系的icCLEIA分析方法檢測(cè)谷物中細(xì)交鏈格孢菌酮酸含量，該方法的檢測(cè)范圍為0.032ng/mL～30.244ng/mL，IC₅₀為0.973ng/mL，最低檢出限為0.010ng/mL，線性回歸方程為y＝49.82-20.14x，R²＝0.9966。通過(guò)對(duì)面粉和燕麥進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)面粉樣品的平均加標(biāo)回收率為82.43％-96.09％，燕麥樣品的平均加標(biāo)回收率為81.53％-93.41％，批間變異系釋與批內(nèi)變異系數(shù)均小于12％；與農(nóng)產(chǎn)品中常見(jiàn)的重點(diǎn)真菌毒素交叉反應(yīng)率均小于1％，表明方法特異性良好。該方法與UPLC-MS/MS準(zhǔn)確度一致，可滿足谷物中細(xì)交鏈格孢菌酮酸的快速檢測(cè)。傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫方法的OD值在2.0左右，本方法魯米諾發(fā)光強(qiáng)度為5個(gè)量級(jí)，發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度大，發(fā)光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)細(xì)交鏈格孢菌酮酸檢測(cè)更加靈敏，為制備檢測(cè)細(xì)交鏈格孢菌酮酸殘留化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒提供基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說(shuō)明：

圖1為實(shí)施例1中多克隆抗體效價(jià)變化圖；

圖2為實(shí)施例3中PBS緩沖液的pH值對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響圖；

圖3為實(shí)施例4中TAO-BSA的包被濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響圖；

圖4為實(shí)施例5中不同封閉液對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響圖；

圖5為實(shí)施例6中細(xì)交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體稀釋倍數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響圖；

圖6為實(shí)施例7中競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響圖；

圖7為實(shí)施例8中羊抗小鼠IgG-HRP稀釋倍數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響圖；

圖8為實(shí)施例9中ECL發(fā)光試劑添加量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響圖；

圖9為實(shí)施例10中標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖10為實(shí)施例11中其他毒素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫反應(yīng)結(jié)果圖；

圖11為實(shí)施例13中化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫方法與UPLC-MS/MS兩者檢測(cè)結(jié)果的線性回歸分析圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

材料與試劑：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Desoxynivalenol,DON)、T-2毒素(T-2toxin,T-2)、展青霉素(Patulin,PAT)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)、鏈格孢霉毒素鏈格孢酚(Alternariol，AOH)(新加坡Pribolab公司)；黃曲霉毒素B₁(Aflatoxin B₁,AFB₁)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、雞卵白蛋白(Ovalbumin from egg,OVA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(美國(guó)sigma公司)；脫脂奶粉(伊利有限公司)；高靈敏ECL發(fā)光試劑(A液：穩(wěn)定劑，B液：增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑)(上海生工生物有限公司)；羊抗小鼠IgG-HRP(武漢博士德公司)；TA與血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)的偶聯(lián)物：免疫原TAO-KLH、TA與BSA的偶聯(lián)物：包被原TAO-BSA(實(shí)驗(yàn)室自制)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純；面粉，燕麥(均購(gòu)買(mǎi)于當(dāng)?shù)爻?。

移液器(德國(guó)eppendorf公司)；DHP-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；Syneng H1MG酶標(biāo)儀(Gene Company Limited公司)；96孔可拆化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板(上海生工生物有限公司)；JS系列電子天平(精度0.0001g，上海精天電子儀器有限公司)。Waters Quatrro-Premier XE超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有Acquity UPLC BEH C₁₈色譜柱(50mm×2.1mm，1.7μm))(美國(guó)Waters公司)。

SPF級(jí)6-8周齡雌性Balb/c小鼠(重慶騰鑫生物技術(shù)公司)

實(shí)施例1

細(xì)交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體

取6-8周齡Balb/c雌性小鼠，采用頸背部皮下注射免疫。首次免疫采用TAO-KLH與等體積弗氏完全佐劑混合并完全乳化后免疫；21d后加強(qiáng)免疫，用上述TAO-KLH與弗氏不完全佐劑混合乳化免疫；每間隔2周加強(qiáng)免疫一次，第5次免疫后7d眼眶取血。離心取上清液與甘油等體積混合后-20℃冰箱保存。

細(xì)交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

免疫注射后間隔7天，斷尾取血，用間接ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)。以O(shè)D_450nm值接近1.0時(shí)的稀釋倍數(shù)作為血清效價(jià)。效價(jià)變化如圖1所示，由圖1可知，免疫次數(shù)增加，血清效價(jià)不斷提高，五免后效價(jià)均大于10000，說(shuō)明免疫效果好，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用2號(hào)鼠五免后的抗血清。

實(shí)施例2

(1)取酶標(biāo)板，每孔加入經(jīng)碳酸鹽緩沖液稀釋后的細(xì)交鏈格孢菌酮酸與BSA偶聯(lián)物(TAO-BSA)，4℃孵育12h后以PBST緩沖液洗板2次，拍干，然后按200μL/孔向每孔加入5.0％脫脂奶粉在37℃下封閉60min，PBST洗板2次，拍干；得到TAO-BSA包被的酶標(biāo)板，包被濃度為1.0μg/mL，包被量為100μL/孔；所述碳酸鹽緩沖液濃度為0.05mol/L，pH為9.6；所述PBST緩沖液濃度為0.01mol/L，pH為7.4；

(2)以PBS緩沖液將濃度為1.0mg/mL細(xì)交鏈格孢菌酮酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成0.018、0.054、0.164、0.494、1.481、4.444、13.333、40ng/mL 7個(gè)濃度，然后將不同濃度的細(xì)交鏈格孢菌酮酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液各取50μL分別加入步驟(1)中的酶標(biāo)板的標(biāo)準(zhǔn)孔中，然后向所述酶標(biāo)板的每孔加入50μL實(shí)施例1中制備的細(xì)交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體，37℃下孵育后以步驟(1)中PBST緩沖液洗板2次，拍干；再向所述酶標(biāo)板的每孔加入100μL辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(羊抗小鼠IgG-HRP)，37℃下孵育60min后以步驟(1)中PBST緩沖液洗板6次，拍干；最后向所述酶標(biāo)板的每孔加入100μL ECL發(fā)光試劑，輕拍混勻，利用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定各孔的發(fā)光值RLU；所述細(xì)交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體經(jīng)PBS緩沖液稀釋40000倍；所述辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG經(jīng)步驟(2)中PBS緩沖液稀釋4000倍；所述PBS緩沖液的濃度為0.01mol/L，pH為5.8。

實(shí)施例3

PBS緩沖液的pH值對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

由于反應(yīng)體系的pH能直接影響抗原抗體間的結(jié)合，進(jìn)而影響方法的檢測(cè)限及靈敏度，將PBS緩沖液稀的pH分別調(diào)至5.8、6.4、7.4、8.0，其余步驟按照實(shí)施例2操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，由圖2可知，IC₅₀隨pH增大先緩慢下降后上升，RLU_max先上升后下降，RLU_max/IC₅₀在pH為7.4時(shí)最高，故選擇PBS緩沖液pH為7.4。

實(shí)施例4

TAO-BSA的包被濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

包被抗原的使用濃度過(guò)高，既浪費(fèi)抗原，又可使本底增高；包被原濃度過(guò)低，固相載體上有大量微孔不能與抗原結(jié)合，增加了非特異性反應(yīng)，影響檢測(cè)的敏感性。將TAO-BSA的濃度分別調(diào)至4.0、2.0、1.0、0.5μg/mL，PBS緩沖液pH為7.4，其余步驟按照實(shí)施例2操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，TAO-BSA包被濃度越小，TA標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性抗血清越多，洗板后殘留的抗體越少，抗體結(jié)合的羊抗小鼠IgG-HRP量少，HRP催化魯米諾產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度越低，IC₅₀隨TAO-BSA包被濃度減少先下降后上升，RLU_max/IC₅₀在包被濃度為2.0μg/mL時(shí)最大，IC₅₀越低，RLU_max/IC₅₀越大，說(shuō)明方法的檢測(cè)效果越好，故選擇TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL。

實(shí)施例5

不同封閉液對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

抗原在包被的時(shí)候濃度較低，固相載體表面尚有未被結(jié)合的位點(diǎn)，封閉就是讓大量的不相關(guān)蛋白質(zhì)占據(jù)固相載體上暴露的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)穩(wěn)定結(jié)合的抗原分子，從而阻止一抗和二抗與固相載體非特異性結(jié)合，產(chǎn)生高背景值，降低特異性與敏感性。在高靈敏的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中背景值尤為重要。

分別以5.0％脫脂奶粉、10.0％脫脂奶粉、0.5％BSA、1.0％BSA、0.5％OVA、1.0％OVA為封閉液，PBS緩沖液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，其余步驟按照實(shí)施例2操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，由圖4可知，未封閉時(shí)高背景會(huì)掩蓋檢測(cè)物的發(fā)光信號(hào)，故RLU_max較封閉組低。蛋白的種類(lèi)不同可能與酶標(biāo)板及后續(xù)抗體的作用效果有差異，5％脫脂奶粉、10％脫脂奶粉和1％BSA為封閉液時(shí)，發(fā)光值較其他組更高，但I(xiàn)C₅₀值也較高，敏感性較差，1.0％OVA的RLU_max/IC₅₀明顯高于其他組，且IC₅₀值最低，靈敏度高，故選擇1.0％OVA為封閉液。

實(shí)施例6

細(xì)交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體稀釋倍數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

細(xì)交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體與羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合率有關(guān)，將細(xì)交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體分別稀釋40000、60000、80000、100000倍，PBS緩沖液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，其余步驟按照實(shí)施例2操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，由圖5可知，多克隆抗體稀釋倍數(shù)越大濃度越低，與羊抗小鼠IgG-HRP特異性結(jié)合減少，魯米諾發(fā)光信號(hào)降低，故RLU_max隨多克隆抗體的稀釋倍數(shù)增加而不斷降低；IC₅₀值先降低，在80000倍時(shí)達(dá)到最小值后緩慢上升，且RLU_max/IC₅₀在稀釋80000倍時(shí)最高，故選擇多克隆抗體稀釋80000倍。

實(shí)施例7

競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)是包被原與毒素標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)與細(xì)交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體特異性結(jié)合，將競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)定為15、30、45、60min，PBS緩沖液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，其余步驟按照實(shí)施例2操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，由圖6可知，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，與包被原結(jié)合的多克隆抗體越多，與羊抗小鼠IgG-HRP特異性結(jié)合增加，RLU_max有逐漸上升趨勢(shì)，在30min與45min上升較為緩慢，可能反應(yīng)已達(dá)到平衡，整體IC₅₀值差異較小，但在30min時(shí)RLU_max/IC₅₀值最大，故選擇競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為30min。

實(shí)施例8

羊抗小鼠IgG-HRP稀釋倍數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

羊抗小鼠IgG-HRP濃度過(guò)高，本底增加；濃度過(guò)低，魯米諾發(fā)光信號(hào)不強(qiáng)，敏感性差。將羊抗小鼠IgG-HRP分別稀釋4000、6000、8000、10000倍，PBS緩沖液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為30min，其余步驟按照實(shí)施例2操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，由圖7可知，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋倍數(shù)越高，HRP的濃度越低，催化魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光體系由化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能的效率降低，RLU_max逐漸降低，IC₅₀先降低后上升，在稀釋度為8000倍時(shí)RLU_max/IC₅₀值遠(yuǎn)高于其他稀釋度且敏感性高，故選擇羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000。

實(shí)施例9

ECL發(fā)光試劑添加量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

將ECL發(fā)光試劑的添加量分別調(diào)至50、75、100、125、150μL/孔，PBS緩沖液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為30min，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000，其余步驟按照實(shí)施例2操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，由圖8可知，ECL發(fā)光試劑添加量越大，HRP催化魯米諾產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度越高，RLU_max不斷增大，背景值也不斷加大；IC₅₀先下降后上升，每孔添加125μL時(shí)IC₅₀最小，且RLU_max/IC₅₀值最大，故選擇添加量125μL/孔。

實(shí)施例10

PBS緩沖液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為30min，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000，ECL發(fā)光試劑添加量125μL/孔，其余步驟按照實(shí)施例2操作，以細(xì)交鏈格孢菌酮酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的對(duì)數(shù)值lgC為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品孔發(fā)光強(qiáng)度RLU與最大發(fā)光值RLU_max的比值為縱坐標(biāo)，每個(gè)梯度做4個(gè)重復(fù)，繪制細(xì)交鏈格孢菌酮酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖9所示，由圖9可知，其線性回歸方程為y＝49.82-20.14x，R²＝0.9966，根據(jù)檢測(cè)線計(jì)算得到檢測(cè)的線性范圍0.032ng/mL～30.244ng/mL，IC₅₀為0.973ng/mL。

PBS緩沖液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為30min，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000，ECL發(fā)光試劑添加量125μL/孔，其余步驟按照實(shí)施例2操作，測(cè)定10個(gè)不同批次的空白標(biāo)準(zhǔn)品的RLU值，計(jì)算平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，按照公式LOD％＝(X-3SD)/X×100％進(jìn)行計(jì)算，得出最低檢出限為0.010ng/mL。

實(shí)施例11

細(xì)交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體與細(xì)交鏈格孢菌酮酸特異性結(jié)合測(cè)試

以交叉反應(yīng)率來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體的特異性，交叉反應(yīng)率越低特異性越好。將AFB₁、DON、T-2、PAT、ZEN、OTA和AOH真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為0.061、0.122、0.244、0.488、0.977、1.953、3.906、7.813、15.625、31.250、62.5、125、250、500ng/mL14個(gè)濃度，設(shè)置PBS緩沖液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為30min，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000，ECL發(fā)光試劑添加量125μL/孔，其余步驟按照實(shí)施例2，分別作分析物及其類(lèi)似物的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，如圖10所示，得出各毒素的IC₅₀值，并計(jì)算交叉反應(yīng)率，計(jì)算公式如下：

通過(guò)計(jì)算可知，AFB₁、DON、T-2、PAT、ZEN、OTA和AOH真菌毒素的IC₅₀值都大于500ng/mL，交叉反應(yīng)率計(jì)算結(jié)果均小于1％，無(wú)明顯交叉反應(yīng)，說(shuō)明制備的多克隆抗體與TA毒素可特異性結(jié)合，其他6種農(nóng)產(chǎn)品中重點(diǎn)毒素對(duì)細(xì)交鏈格孢菌酮酸檢測(cè)的干擾程度很小，該方法具有較好的特異性。

實(shí)施例12

(1)稱(chēng)取2.0g面粉于50mL離心管中，加入30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70％甲醇溶液中，渦旋震蕩5min后以4000r/min離心10min，取1mL上清液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的NaCl溶液等體積混合后加入PBS緩沖液稀釋25倍，制得待測(cè)樣品溶液；所述PBS緩沖液濃度為0.01mol/L，pH為7.4；設(shè)置測(cè)試條件：PBS緩沖液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為30min，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000，ECL發(fā)光試劑添加量125μL/孔，取50μL該待測(cè)樣品溶液加入酶標(biāo)板的樣品孔中，其余步驟按照實(shí)施例2操作。

(2)稱(chēng)取2.0g粉碎后的燕麥片于50mL離心管中，加入30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100％甲醇溶液中，渦旋震蕩15min后以4000r/min離心10min，取上清液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的NaCl溶液等體積混合后加入PBS緩沖液稀釋25倍，制得待測(cè)樣品溶液；所述PBS緩沖液濃度為0.01mol/L，pH為7.4；設(shè)置測(cè)試條件：PBS緩沖液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為30min，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000，ECL發(fā)光試劑添加量125μL/孔，取50μL該待測(cè)樣品溶液加入酶標(biāo)板的樣品孔中，其余步驟按照實(shí)施例2操作。

(3)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析，即得樣品中細(xì)交鏈孢菌酮酸的含量，計(jì)算公式如下：

C(樣品)＝N×10^{(49.82-r)/20.14}

N：樣品稀釋總倍數(shù)

r：樣品孔發(fā)光強(qiáng)度RLU與0標(biāo)準(zhǔn)品孔的發(fā)光值RLUmax的比值，RLU/RLUmax

(4)取不同批次化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，分別向面粉樣品和燕麥樣品中添加細(xì)交鏈格孢菌酮酸，添加量分別為5.0、10.0、20.0ug，按照(1)、(2)中的方法，每個(gè)添加量做3次重復(fù)，每次做7個(gè)重復(fù)孔，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)。變異系數(shù)(Coefficient of variation,CV)計(jì)算公式為：

CV(％)＝(SD/X)×100

結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 面粉、小麥樣品添加回收試驗(yàn)結(jié)果表

由表1可知，面粉樣品的平均回收率為82.43％-96.09％，燕麥樣品的平均回收率為81.53％-93.41％。面粉樣品的批內(nèi)變異系數(shù)為4.08％-5.02％，批間變異系數(shù)為8.33％-11.37％；燕麥樣品的批內(nèi)變異系數(shù)為2.61％-4.83％，批間變異系數(shù)為9.56％-10.32％，均小于15％，說(shuō)明以本發(fā)明中的方法檢測(cè)細(xì)交鏈格孢菌酮酸的精密度高。

實(shí)施例13

分別向面粉和燕麥樣品中添加細(xì)交鏈格孢菌酮酸，添加量分別為5.0、10.0、20.0ug，分別采用UPLC-MS/MS和實(shí)施例12中(1)方法進(jìn)行檢測(cè)，以UPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果為橫坐標(biāo)，以化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)結(jié)果為縱坐標(biāo)做線性回歸分析，結(jié)果如圖11所示，由圖11可知，線性回歸方程為：y＝0.825x-0.073，R²＝0.9984，說(shuō)明icCLEIA與UPLC-MS/MS方法具有良好的一致性和準(zhǔn)確度。

本發(fā)明中的方法不僅可以用于面粉和燕麥中細(xì)交鏈格孢菌酮酸的檢測(cè)，還可以用于大米、小麥、玉米、各種米粉等糧食中細(xì)交鏈格孢菌酮酸的檢測(cè)。

最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。