本發(fā)明屬于檢驗檢疫領域，具體涉及一種實蠅幼蟲表皮碳氫化合物組分的分析方法。

背景技術：

實蠅類昆蟲繁殖力強、危害隱蔽且嚴重，是一類重要的檢疫性昆蟲，備受國內外檢疫部門關注。準確快速地識別實蠅，對口岸果蔬快速通關及阻止其入侵，避免農業(yè)生產受到重大經(jīng)濟損失具有重大意義。

在口岸檢疫過程中，對昆蟲的鑒定主要以傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定技術為主，一般通過昆蟲分類最基本和可靠的特征，例如，形態(tài)和大小、色澤、斑紋和刻紋等，直接用眼睛或借助光學顯微鏡觀察。傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定的缺點在于：由于實蠅的生活環(huán)境不同，實蠅的生態(tài)特征，如斑紋、顏色等也隨之發(fā)生變化，給形態(tài)學鑒定帶來了困難甚至錯誤，對一些隱種不能很好地鑒定區(qū)分，而且形態(tài)學上的鑒定需要專門的人員才能完成。同時，從受害的瓜果中截獲到的實蠅多數(shù)是卵、幼蟲和蛹，而多數(shù)的實蠅的卵，幼蟲和蛹在形態(tài)學上無明顯差別，難以鑒定到種。因此檢疫部門只能將截獲到的實蠅飼養(yǎng)到成蟲后，才可能基于其形態(tài)鑒別特征確定其種類。顯然，這一檢疫程序費時耗力，難以滿足進口瓜果快速鑒定通關的要求，同時也影響了下一步應急快速反應，預警測報和防治的效果。

除了使用形態(tài)學鑒定技術外，還可以通過分子生物學手段，如同工酶電泳技術、限制性片段長度多態(tài)性標記技術、隨機擴增多態(tài)性DNA技術、核酸序列及微衛(wèi)星DNA分析等技術。分子生物學手段缺點在于：利用這些方法存在著許多的缺陷，例如使用同工酶電泳技術時，其結果的重現(xiàn)性差，而且樣品酶易受昆蟲發(fā)育階段和保存條件的影響。對于一些實蠅的復合種或隱種的鑒定，分子生物學手段就存在著一些局限性，其能否對復合種進行鑒定還未見報道。此外，進行分子生物學實驗時需要進行大量的準備工作，操作復雜，而且費用相對較高。

最后，還有利用昆蟲表皮碳氫化合物作為昆蟲分類工具對昆蟲進行鑒定。

昆蟲的表皮碳氫化合物的組成具有種的特異性，不同昆蟲所產生的表皮碳氫化合物不同，是昆蟲的獨立和特異的表型特征。與形態(tài)分類特征相比，作為生化特征的表皮碳氫化合物是對生命本質不同側面的反映，具有很高的多態(tài)性可供選擇，是形態(tài)學鑒定的補充，尤其適用于形態(tài)相似的近緣種和隱種的鑒定。利用昆蟲表皮碳氫化合物鑒定昆蟲有其獨特的優(yōu)勢，①不受實驗樣品的限制，新鮮、干燥或冷凍標本均用于分析；②整體浸泡不損壞昆蟲的外部形態(tài)，可以繼續(xù)保存標本；③提取液性質穩(wěn)定，保存時間對實驗結果無影響；④實驗條件較簡單，費用相對較低，實驗周期短，實用性高。

利用氣相色譜質譜聯(lián)用(GC-MS)技術，對昆蟲表皮碳氫化合物(CHCs)進行分析，通過對CHCs的組分與含量的分析，找出特有峰來區(qū)分不同種的實蠅，并且建立相應的指紋圖譜，可以在檢驗檢疫過程中提供快速的鑒定方法。

分析昆蟲表皮碳氫化合物最常用的兩種方法為有機溶劑浸提法和固體進樣法。

現(xiàn)有技術中，有機溶劑浸提法分析實蠅幼蟲表皮碳氫化合物時多采用有機溶劑正己烷直接浸泡過夜提取，然后進行GC-MS分析，但是這種方法能萃取出的化合物的種類和含量偏少，特別是一些含量較少的物質尚無法檢測出，其結果不能真正反映幼蟲表皮的化合物特征屬性。此外，現(xiàn)有技術中的取樣浸提方法不僅操作復雜、耗時、不環(huán)保，難以提取出表皮碳氫化合物，而且提取的時間很難掌握，如果提取時間太短，由于表皮水分的封鎖，不能充分地提取昆蟲體表較深層的碳氫化合物；如果提取時間過長，由于昆蟲體內物質經(jīng)由口器或肛門逸出，可能把體內的物質也提取出來，兩種情況都會影響檢測結果。

固體進樣法通常被用于食品農殘檢測或揮發(fā)性氣體測定等。我們此前已經(jīng)報道了利用固體進樣法對桔小實蠅成蟲表皮碳氫化合物的圖譜分析(“一種可用于桔小實蠅表皮碳氫化合物分析的固體進樣技術”,昆蟲學報,2016,59(3):278-291)，探討了利用桔小實蠅成蟲附肢或蟲體的頭、胸、腹部等作為固體進樣樣品的可操作性。但口岸截獲的實蠅類昆蟲多為鉆蛀果蔬并在其內為害的幼蟲，而目前對于實蠅幼蟲的鑒定，仍存在技術問題，即使實蠅分類學家也不能準確對幼蟲做出鑒定，因此在多數(shù)情況下需將其飼養(yǎng)至成蟲，再根據(jù)成蟲形態(tài)特征進行種類鑒定，或者借助分子生物學技術。采用固體進樣法，則幼蟲體內的物質容易污染色譜柱，同時也影響物質的分析，此外只取幼蟲部分表皮并不能反應整個蟲體的化合物特征。

因此，實蠅幼蟲鑒定技術的缺乏，使得檢驗檢疫過程中鑒定的時效性受到影響。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種實蠅幼蟲表皮碳氫化合物組分的分析方法。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

一種實蠅幼蟲表皮碳氫化合物組分的分析方法，包括下列步驟：

1)將實蠅幼蟲沿著背側線從頭部或腹末肛門處將整個蟲體剪開，去除蟲體內含物，漂洗干凈，得到實蠅幼蟲表皮；

2)取實蠅幼蟲表皮添加適量有機溶劑，快速充分的研磨提取1-4min，然后再加入等量的有機溶劑，浸提1-5min，收集所有浸提液；

3)將浸提液加入分離柱中，利用有機溶劑洗脫，收集所有洗脫液，濃縮，保存?zhèn)溆茫?/p>

4)對濃縮洗脫液進行GC-MS分析。

本發(fā)明方法適用于實蠅所有種類的幼蟲，其中，包括桔小實蠅、瓜實蠅、南瓜實蠅、木瓜實蠅、番石榴實蠅等幼蟲。

優(yōu)選的，步驟1)中，實蠅幼蟲為2-3齡的實蠅幼蟲。

優(yōu)選的，步驟1)中，將實蠅幼蟲沿著背側線從頭部將整個蟲體剪開，采用鑷子直接將內含物拖出的方法去除蟲體內含物。

優(yōu)選的，步驟1)中，將實蠅幼蟲沿著背側線從腹末肛門處將整個蟲體剪開，采用扁頭鑷子刮去內含物的方法去除蟲體內含物。

蟲體內含物包括嗉囊、前胃、中腸、馬氏管、后腸等。幼蟲體內的物質容易污染色譜柱，同時也影響表皮物質的分析，采用本發(fā)明的方法可以較好地去除蟲體內含物。

優(yōu)選的，步驟1)中，去除蟲體內含物后，還需擠壓幼蟲表皮，盡可能除盡游離的脂肪體。

優(yōu)選的，步驟1)中漂洗時采用鑷子夾著蟲體，用洗瓶沖洗后，再置于培養(yǎng)皿中用蒸餾水漂洗干凈，得到實蠅幼蟲表皮。

本發(fā)明采用去除內含物、擠壓幼蟲表皮，并進一步漂洗干凈的方法，基本可以將幼蟲體內的物質去除干凈。如果還有微量的殘留物，可以通過本發(fā)明后續(xù)的過柱處理來去除。

優(yōu)選的，步驟2)中取1-3頭實蠅幼蟲表皮添加適量有機溶劑。

優(yōu)選的，步驟2)中取1頭實蠅幼蟲表皮添加適量有機溶劑。

優(yōu)選的，步驟2)中，有機溶劑的添加量為每頭實蠅幼蟲添加0.5-3ml的有機溶劑。

本發(fā)明的技術優(yōu)勢在于單頭幼蟲即可供鑒定，實驗所需的材料成本大大降低，而且時間縮短。

優(yōu)選的，步驟2)和步驟3)中，有機溶劑包括正己烷、正戊烷。

優(yōu)選的，提取和洗脫的所用的有機溶劑一致。

優(yōu)選的，步驟2)中，研磨時所使用的研缽的材質包括陶瓷，玻璃和瑪瑙，研磨時適當遮蓋，以防有機溶劑揮發(fā)。

優(yōu)選的，步驟3)中，分離柱中的固定相為硅鎂型吸附劑和無水硫酸鈉按照質量比為(2-5):(1-3)混合得到。

優(yōu)選的，步驟3)中，分離柱中的固定相為硅鎂型吸附劑和無水硫酸鈉按照質量比為3:2混合得到。

本發(fā)明中最少僅需取1頭實蠅的表皮碳氫化合物進行分析即可，所添加的溶劑不超過10ml，這里所搭配的分離柱管長為100mm，分離柱中的固定相為硅鎂型吸附劑和無水硫酸鈉按質量比混合，其中硅鎂型吸附劑0.3g，無水硫酸鈉0.2g。

過柱是為了去除有機溶劑提取出的一些非碳氫化合物的物質。我們優(yōu)選出的固定相不會對碳氫化合物產生影響，如果利用其他類型的固定相，可能會吸附碳氫化合物，影響實驗結果。

優(yōu)選的，步驟3)中，濃縮采用高純氮氣將洗脫液吹干后再添加適量有機溶劑溶解，得到濃縮后的洗脫液。

優(yōu)選的，步驟3)中，保存于-20度或-70度，時間不超過3d。

本發(fā)明的有益效果是：

本方法將活體實蠅幼蟲去除內臟，再進行研磨提取及過柱處理，這樣不僅可以增加有機溶劑與昆蟲表皮碳氫化合物的接觸面積，提高萃取碳氫化合物的質量，獲得了直接浸提方法所無法分離出的成分，能夠檢測出更多種類的碳氫化合物，以便對其更精確的研究和分析。

本發(fā)明方法改良了現(xiàn)有技術中關于實蠅幼蟲表皮碳氫化合物組分的分析方法，使得整個檢測時間從原來的12-24h縮短到2-3h，大大增強了時效性。此外，本發(fā)明方法可以浸提獲得種類更多的表皮碳氫化合物組分，為進一步鑒定實蠅的種類尤其是近緣種提供更為詳實而可靠的數(shù)據(jù)支持。

現(xiàn)有技術利用溶劑浸泡的方法所使用的實蠅幼蟲量通常較多。本發(fā)明中最少僅需取1頭實蠅的表皮碳氫化合物進行分析即可，所添加的溶劑不超過10ml，大大降低實驗所需的人力物力。

本發(fā)明中，固定相為硅鎂型吸附劑和無水硫酸鈉按照質量比為(2-5):(1-3)混合得到，通過過柱的方法，可以充分去除有機溶劑提取出的一些非碳氫化合物的物質，而且不會對碳氫化合物產生任何影響。正是由于充分去除內臟等內含物的影響，在分析樣品時，可以獲得更為精確的實驗結果，同時起到保護色譜柱的作用，間接的延長了色譜柱的使用壽命。

本發(fā)明方法可用于海關等部門的實蠅快速檢驗檢疫，實蠅近緣種的鑒定，以及實蠅幼蟲系統(tǒng)發(fā)育關系研究。本方法具有實驗操作簡便，費用少，時效性高的優(yōu)點，可為檢驗檢疫過程中提供快速的鑒定技術，滿足進口瓜果快速鑒定通關的要求，是近年來昆蟲分類方法的完善和補充。

附圖說明

圖1為GC-MS分析結果；

圖2為GC-MS分析結果；

圖3為GC-MS分析結果；

圖4為GC-MS分析結果；

圖5為GC-MS分析結果；

圖6為GC-MS分析結果；

圖7為GC-MS分析結果；

圖8為GC-MS分析結果；

上述圖片均為經(jīng)過m/z＝57特征離子提取之后的圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

其中，實施例1、實施例2和實施例4的實蠅同為鏃果實蠅亞屬，實施例3的實蠅為離腹寡毛屬。

實施例1

材料：南瓜實蠅(鏃果實蠅亞屬)老熟幼蟲(活蟲)；由卵孵化5-7d，3齡。

1.樣品制備：

步驟1：幼蟲去除內臟：取實蠅幼蟲若干頭置于培養(yǎng)皿內，用無菌水漂洗3次，將蟲體表面漂洗干凈。置于帶水培養(yǎng)皿內，防止其逃逸，并于4℃條件下暫存?zhèn)溆?建議不超過1-2h)。取一頭幼蟲，在體視顯微鏡下(10×目鏡，再調至圖像清晰)，利用尖頭鑷子固定蟲體，然后用手術解剖剪刀沿幼蟲的背側線剪開，去除蟲體內含物(包括嗉囊、前胃、中腸、馬氏管、后腸等)，用鑷子輕輕擠壓表皮，盡可能除盡游離的脂肪體，用鑷子夾著蟲體，用洗瓶沖洗后，再置于培養(yǎng)皿中用無菌水反復漂洗5次，得到實蠅幼蟲表皮。

步驟2：研磨：將1頭幼蟲表皮置于直徑為5cm的陶瓷研缽(研缽用色譜純正己烷浸泡1h后取出，烘干)中，在通風櫥內，加入色譜純正己烷(西格瑪)1ml，快速充分的研磨提取1min，以增加有機溶劑與表皮的接觸面積。之后再加入1ml正己烷，浸提1min，收集所有浸提液。

步驟3：過柱處理：將浸提液倒入自制的分離柱(固定相：硅鎂型吸附劑0.3g，無水硫酸鈉0.2g)中，以2ml正己烷洗脫，去除殘留于正己烷中的油脂類雜質，收集所有洗脫液，在高純氮氣中濃縮至20μl，將浸提液移至150μL玻璃內插管(安捷倫公司，美國)，再將內插管放入1.5mL進樣瓶中，擰緊瓶蓋置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.分析：采用Combi PAL自動進樣器(CTC公司，瑞士)進樣，每個供試樣品進樣2μl。在自動進樣過程中，以正己烷為清洗溶劑，分別在進樣前后清洗進樣針3次和2次。供試樣品利用氣相色譜GC7890A-質譜MS-5975C聯(lián)用儀(安捷倫公司，美國)分析，色譜柱為石英毛細管柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；起始溫度為50℃，以22℃/min升至270℃，再以2℃/min升至300℃，保留5min。載氣為高純氦氣，載氣流速1mL/min，柱頭壓為7.652psi。電子轟擊離子源(EI)，電子能量70eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，掃描范圍50～550amu。進樣口溫度290℃，不分流模式。溶劑延遲3min。

對照用現(xiàn)有技術中使用正己烷直接浸泡過夜提取南瓜實蠅幼蟲表皮碳氫化合物，進行GC-MS分析結果。結果見圖1和圖2。

圖1為對照，即采用現(xiàn)有技術使用正己烷直接浸泡過夜提取南瓜實蠅表皮碳氫化合物的GC-MS分析結果。經(jīng)過m/z＝57的特征離子提取發(fā)現(xiàn)在保留時間13-19min內均未萃取出相應的化合物(注釋：m/z＝57是碳氫化合物的特征離子碎片，圖1-6均為經(jīng)過m/z＝57特征離子提取之后的圖)，而保留時間在3-12min為非目標峰，因為前3-12min內出來的化合物分子量小，不穩(wěn)定，不適合作為表皮碳氫化合物的種類的分析。

圖2為本發(fā)明的使用正己烷提取經(jīng)去除內臟經(jīng)研磨和過柱后的碳氫化合物的GC-MS分析(m/z＝57特征離子提取)結果。與圖1相比，圖2顯示，本發(fā)明的分析方法可以獲得南瓜實蠅老熟幼蟲的表皮化合物，其中保留時間在3-12min為非目標峰。在保留時間13-19min時的碳氫化合物峰值增高、種類多。此外，圖2在保留時間13-19min萃取出的化合物為碳氫化合物，每一個峰代表一種或一類化合物。與圖1相比，圖2在保留時間13-19min萃取出的化合物種類增加，而且豐度較高，說明萃取出的量較大。

實施例2

材料：瓜實蠅(鏃果實蠅亞屬)老熟幼蟲(活蟲)；由卵孵化5-7d，3齡。

1.樣品制備：

步驟1：幼蟲去除內臟：取實蠅幼蟲若干頭置于培養(yǎng)皿內，用無菌水漂洗3次，將蟲體表面漂洗干凈。置于帶水培養(yǎng)皿內，防止其逃逸，并于4℃條件下暫存?zhèn)溆?建議不超過1-2h)。取1頭幼蟲，在體視顯微鏡下(10×目鏡，再調至圖像清晰)，利用尖頭鑷子固定蟲體，然后用手術解剖剪刀沿幼蟲的背側線剪開，用扁頭鑷子刮去蟲體內含物(包括嗉囊、前胃、中腸、馬氏管、后腸等)，用鑷子輕輕擠壓表皮，盡可能除盡游離的脂肪體，用鑷子夾著蟲體，用洗瓶沖洗后，再置于培養(yǎng)皿中用無菌水反復漂洗5次，得到實蠅幼蟲表皮。

步驟2：研磨：將2頭幼蟲表皮置于直徑為5cm的陶瓷研缽(研缽用色譜純正己烷浸泡1h后取出，烘干)中，在通風櫥內，加入色譜純正己烷(西格瑪)1.6ml，快速充分的研磨提取2min，以增加有機溶劑與表皮的接觸面積。之后再加入1ml正己烷，浸提1min，收集所有浸提液。

步驟3：過柱處理：將浸提液倒入自制的分離柱(固定相：硅鎂型吸附劑0.5g，無水硫酸鈉0.2g)中，以3ml正己烷洗脫，去除殘留于正己烷中的油脂類雜質，收集所有洗脫液，利用高純氮氣沿著瓶口吹，形成氣旋加快吹干，待吹干后重新加入20μl的有機溶劑，溶解，得到濃縮洗脫液，將浸提液移至150μL玻璃內插管(安捷倫公司，美國)，再將內插管放入1.5mL進樣瓶中，擰緊瓶蓋置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、分析方法同“實施例1”。

對照用現(xiàn)有技術中使用正己烷直接浸泡瓜實蠅老熟幼蟲過夜，提取得到表皮碳氫化合物，進行GC-MS分析結果。結果見圖3和圖4。

圖3為對照，即采用現(xiàn)有技術使用正己烷直接浸泡過夜提取瓜實蠅幼蟲表皮碳氫化合物的GC-MS分析結果。經(jīng)過m/z＝57特征離子提取發(fā)現(xiàn)在保留時間13-19min內均未萃取出相應的化合物，而保留時間在3-12min為非目標峰。

圖4為本發(fā)明使用正己烷提取經(jīng)去除內臟經(jīng)研磨和過柱后的碳氫化合物的GC-MS分析(m/z＝57特征離子提取)結果。

與圖3相比，圖4中本發(fā)明的分析方法可以獲得南瓜實蠅老熟幼蟲的表皮化合物，其中保留時間在3-12min為非目標峰，在保留時間13-19min時的碳氫化合物峰值增高、種類多。圖4在保留時間13-19min萃取出的化合物均為碳氫化合物，每一個峰代表一種或一類化合物。與圖3相比，圖4在保留時間13-19min萃取出的化合物種類增加，而且豐度較高，說明萃取出的量較大。

實施例3

材料：桔小實蠅(離腹寡毛屬)老熟幼蟲(活蟲)；由卵孵化5-7d，3齡。

1、樣品制備：

步驟1：幼蟲去除內臟：取實蠅幼蟲若干頭置于培養(yǎng)皿內，用無菌水漂洗3次，將蟲體表面漂洗干凈。置于帶水培養(yǎng)皿內，防止其逃逸，并于4℃條件下暫存?zhèn)溆?建議不超過1-2h)。取1頭幼蟲，在體視顯微鏡下(10×目鏡，再調至圖像清晰)，利用尖頭鑷子固定蟲體，然后用手術解剖剪刀沿幼蟲的背側線從頭部將整個蟲體剪開，利用鑷子直接將內含物拖出來去除蟲體內含物(包括嗉囊、前胃、中腸、馬氏管、后腸等)，用鑷子輕輕擠壓表皮，盡可能除盡游離的脂肪體，用鑷子夾著蟲體，用洗瓶沖洗后，再置于培養(yǎng)皿中用無菌水反復漂洗5次，得到實蠅幼蟲表皮。

步驟2：研磨：將1頭幼蟲表皮置于直徑為5cm的陶瓷研缽(研缽用色譜純正己烷浸泡1h后取出，烘干)中，在通風櫥內，加入色譜純正己烷(西格瑪)1.5ml，快速充分的研磨提取1min，以增加有機溶劑與表皮的接觸面積。之后再加入1.5ml正己烷，浸提1min，收集所有浸提液。

步驟3：過柱處理：將浸提液倒入自制的分離柱(固定相：硅鎂型吸附劑0.4g，無水硫酸鈉0.3g)中，以2ml正己烷洗脫，去除殘留于正己烷中的油脂類雜質，收集所有洗脫液，在高純氮氣中濃縮至20μl，將浸提液移至150μL玻璃內插管(安捷倫公司，美國)，再將內插管放入1.5mL進樣瓶中，擰緊瓶蓋置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、分析方法同“實施例1”。

對照用現(xiàn)有技術中使用正己烷直接浸泡桔小實蠅老熟幼蟲過夜，提取得到表皮碳氫化合物，進行GC-MS分析(m/z＝57特征離子提取)結果。結果見圖5和圖6。

圖5為對照，即采用現(xiàn)有技術使用正己烷直接浸泡過夜提取桔小實蠅幼蟲表皮碳氫化合物的GC-MS分析結果。經(jīng)過m/z＝57特征離子提取發(fā)現(xiàn)在保留時間13-19min內均未萃取出相應的化合物，而保留時間在3-12min為非目標峰。

圖6為本發(fā)明使用正己烷提取經(jīng)去除內臟經(jīng)研磨和過柱后的碳氫化合物的GC-MS分析結果。

與圖5相比，圖6中本發(fā)明的分析方法可以獲得桔小實蠅老熟幼蟲的表皮化合物，其中保留時間在3-12min為非目標峰，在保留時間13-19min時的碳氫化合物峰值增高、種類多。圖6在保留時間13-19min萃取出的化合物均為碳氫化合物，每一個峰代表一種或一類化合物。與圖5相比，圖6在保留時間13-19min萃取出的化合物種類增加，而且豐度較高，說明萃取出的量較大。

對實施例1-3的實蠅幼蟲的表皮碳氫化合物進行綜合分析。根據(jù)本專利方法獲得的色譜圖(圖2、4和6)可知，三種實蠅的幼蟲表皮碳氫化合物主要集中在13-19min，具體結果見表1。并且可以根據(jù)這段時間出現(xiàn)的色譜峰的保留時間及色譜峰的峰面積大小來區(qū)分三種實蠅幼蟲(表1)。

表1三種實蠅幼蟲表皮碳氫化合物組成

注：各色譜峰的百分含量以means±SE表示，“—”表示未檢測到該物質。"Me"表示單甲基，"diMe"表示二甲基。

表1結果顯示，保留時間為15.993min的正三十烷烴只出現(xiàn)在桔小實蠅的幼蟲中，并且保留時間為17.318min的正三十一烷烴在桔小實蠅中占50％左右，而在南瓜實蠅和瓜實蠅中占6.54-8.34％。而保留時間為15.696的3-甲基二十九烷烴在南瓜實蠅的含量比瓜實蠅中高約2倍。說明實蠅亞屬之間，其幼蟲的表皮碳氫化合物存在差異，優(yōu)勢碳氫化合物的種類和含量都有區(qū)別，所以可以根據(jù)保留時間在13-19min的色譜峰的保留時間及色譜峰的峰面積大小來區(qū)分三種實蠅幼蟲。

實施例4重復性實驗

用本專利的方法(實施例1和實施例2)，分析了采自海南的南瓜實蠅(圖7)和瓜實蠅(圖8)幼蟲表皮碳氫化合物，結果見圖7和圖8。

將圖7的結果與圖2(實施例1)的結果進行比較，將圖8的結果與圖4(實施例2)進行比較，經(jīng)過分析可知，不同產地所獲得的同種亞屬的實蠅，其表皮碳氫化合物相當穩(wěn)定，通過特征離子提取之后，獲得的各碳氫化合物的種類和含量幾乎一致。

由以上實施例可知，本發(fā)明方法通過對樣品制備方法的改進，使實驗周期縮短，通過去除內臟去除了大部分的幼蟲體內的物質對分析的影響，經(jīng)過充分的研磨，可以加大了有機溶劑與表皮的接觸面積；提取完后，再對溶解物進行過柱處理，可以進一步的去除昆蟲體內的內含物影響，能夠提取出常規(guī)方法無法提取出的表皮碳氫化合物種類，且樣品過柱純化，進一步減少了樣品中含有的雜質，起到保護氣相色譜儀中色譜柱的作用。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。