本公開涉及生物
技術領域：
，具體地，涉及一種人髓過氧化物酶免疫層析試紙條的制備方法。
背景技術：
：人髓過氧化物酶(myeloperoxidase，mpo)由中性粒細胞、單核細胞和某些組織的巨噬細胞分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶，是血紅素過氧化物酶超家族成員之一。mpo是中性粒細胞的功能標志和激活標志，活化的中性粒細胞釋放大量的mpo，影響多種疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化患者外周血中活化的中性粒細胞增加，mpo通過產(chǎn)生自由基和多種反應性物質(zhì)，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成并導致斑塊的不穩(wěn)定性增加，加速了動脈粥樣硬化的進程；mpo可用于區(qū)別診斷早期急性髓性白血病和急性淋巴細胞白血病。檢測mpo的濃度在疾病的診斷與疾病進展預警發(fā)明具有重要意義。目前，免疫層析試紙條為用來檢測mpo在血液中的濃度，但是傳統(tǒng)方法制備得到的免疫層析試紙條雖然使用簡易、快捷，但是存在準確度和靈敏度不夠的缺點。開發(fā)一種新的mpo的免疫層析試紙條的制備方法提高檢測的準確度和靈敏度是亟需的。技術實現(xiàn)要素：本公開的目的是提供一種人髓過氧化物酶免疫層析試紙條的制備方法，該制備方法可以提高檢測的準確度和靈敏度。為了實現(xiàn)上述目的，本公開提供一種人髓過氧化物酶免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述免疫層析試紙條包括依次相連接的樣品墊、標記抗體墊、抗體包被硝酸纖維素膜和吸收墊；所述標記抗體墊中含有60-80μg的膠體金或熒光標記的人髓過氧化物酶的第一單克隆抗體；所述制備方法包括抗體包被硝酸纖維素膜的制備和免疫層析試紙條的組裝，所述抗體包被硝酸纖維素膜的制備包括如下步驟：s1.將1-2mg/ml的人髓過氧化物酶的第二單克隆抗體溶液和0.3-0.7％(w/v)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸鹽緩沖液按照體積比1：(4-6)混合均勻，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液；s2.使用濃度為0.01-0.03m且ph值為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液稀釋兔抗鼠igg至0.5-1.0mg/ml，得到兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液；s3.將3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液使用定點噴膜儀均勻噴霧于硝酸纖維素膜上的一處作為檢測線，并且將兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液使用定點噴膜儀均勻噴霧于硝酸纖維素膜上的另一處作為質(zhì)控線，檢測線與質(zhì)控線之間間隔0.5cm-1.0cm，隨后置于36-38℃烘干1.5-2.5h，得到烘干后的硝酸纖維素膜；s4.烘干后的硝酸纖維素膜在室溫下依次置于0.01-0.03m且ph值為7.1-7.6的磷酸鹽緩沖液、0.4-0.6％(w/v)牛血清白蛋白和3-5％(w/v)蔗糖的磷酸鹽緩沖液、雙蒸水中處理，處理完成后于36-38℃通風干燥100-140min，得到抗體包被硝酸纖維素膜。本公開還提供了上述制備方法制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條。通過上述技術方案，3-氨基丙基三乙氧基硅烷用于硝酸纖維素膜上抗體的包被可以使抗體傾向于以fc區(qū)接近硝酸纖維素膜表面的羥基官能團，使fab區(qū)向外伸展，提高了抗體的利用率。通過本公開制備方法制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條靈敏度提高，可以快速準確的測定人髓過氧化物酶的濃度。本公開的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。附圖說明附圖是用來提供對本公開的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本公開，但并不構成對本公開的限制。在附圖中：圖1是抗體在硝酸纖維素膜上的包被示意圖。圖2是人髓過氧化物酶免疫層析試紙條結構圖。圖3是人髓過氧化物酶膠體金標記免疫層析試紙條陰性結果。圖4是人髓過氧化物酶膠體金標記免疫層析試紙條陽性結果。圖5是人髓過氧化物酶濃度定量檢測標準曲線。附圖標記說明1樣品墊2標記抗體墊3檢測線(t線)4抗體包被硝酸纖維素膜5質(zhì)控線(c線)6吸收墊7pvc板具體實施方式以下對本公開的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本公開，并不用于限制本公開。本公開第一方面：提供一種人髓過氧化物酶免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述免疫層析試紙條包括依次相連接的樣品墊、標記抗體墊、抗體包被硝酸纖維素膜和吸收墊；所述標記抗體墊中含有60-80μg的膠體金或熒光標記的人髓過氧化物酶的第一單克隆抗體；所述制備方法包括抗體包被硝酸纖維素膜的制備和免疫層析試紙條的組裝，所述抗體包被硝酸纖維素膜的制備包括如下步驟：s1.將1-2mg/ml的人髓過氧化物酶的第二單克隆抗體溶液和0.3-0.7％(w/v)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸鹽緩沖液按照體積比1：(4-6)混合均勻，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液；s2.使用濃度為0.01-0.03m且ph值為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液稀釋兔抗鼠igg至0.5-1.0mg/ml，得到兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液；s3.將3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液使用定點噴膜儀均勻噴霧于硝酸纖維素膜上的一處作為檢測線，并且將兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液使用定點噴膜儀均勻噴霧于硝酸纖維素膜上的另一處作為質(zhì)控線，檢測線與質(zhì)控線之間間隔0.5cm-1.0cm，隨后置于36-38℃烘干1.5-2.5h，得到烘干后的硝酸纖維素膜；s4.烘干后的硝酸纖維素膜在室溫下依次置于0.01-0.03m且ph值為7.1-7.6的磷酸鹽緩沖液、0.4-0.6％(w/v)牛血清白蛋白和3-5％(w/v)蔗糖的磷酸鹽緩沖液、雙蒸水中處理，處理完成后于36-38℃通風干燥100-140min，得到抗體包被硝酸纖維素膜。其中，免疫試紙的檢測原理包括：將待檢樣品滴入樣品墊中，若樣品中含有人髓過氧化物酶，待測樣品中的人髓過氧化物酶先和過量的膠體金或熒光標記的第一單克隆抗體結合，然后由于毛細管作用人髓過氧化物酶和膠體金或熒光標記的第一單克隆抗體形成的復合物沿著基膜向前泳動到達檢測線與硝酸纖維素基膜上的第二單克隆抗體相遇，形成“膠體金或熒光標記的第一單克隆抗體-人髓過氧化物酶-第二單克隆抗體”復合物富集在檢測線(t線)上顯出膠體金紅色或者熒光信號；剩余的膠體金或熒光標記的第一單克隆抗體到達質(zhì)控線與質(zhì)控線上的兔抗鼠igg抗體結合，并富集在質(zhì)控線上顯出膠體金紅色或者熒光信號，在檢測線與質(zhì)控線同時顯色的情況下判斷為陽性結果，如質(zhì)控線不顯色則判為檢測失敗，需要重新檢測。若樣品中無人髓過氧化物酶，無法形成復合物；沒有與人髓過氧化物酶結合的膠體金或熒光標記的第一單克隆抗體則直接通過檢測線(t線)到達質(zhì)控線與質(zhì)控線上的兔抗鼠igg抗體結合，形成igg-膠體金或熒光標記的第一單克隆抗體復合物富集在質(zhì)控線上，檢測線(t線)不顯色但質(zhì)控線(c線)顯色的情況下判斷為陰性結果，如果質(zhì)控線(c線)不顯色則判為檢測失敗，需要重新檢測。膠體金標記的人髓過氧化物酶免疫試紙條的陰性結果如圖2所示，陽性結果如圖3所示。其中使用熒光標記第一單克隆抗體的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條，可通過檢測熒光強度來即時快速測定人髓過氧化物酶在待檢測物中的濃度。通過上述技術方案，3-氨基丙基三乙氧基硅烷用于硝酸纖維素膜上抗體的包被可以使抗體傾向于以fc區(qū)接近硝酸纖維素膜表面的羥基官能團，使fab區(qū)向外伸展，提高了抗體的利用率。通過本公開制備方法制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條靈敏度提高，可以快速準確的測定人髓過氧化物酶的濃度。根據(jù)本公開第一方面，為了保持免疫試紙條中檢測線的均一性，進一步地，步驟s3中所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液與兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液的噴涂速度可以為0.8-1.2μl/cm。根據(jù)本公開第一方面，為了清除硝酸纖維素膜表面多余的3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體，進一步地，步驟s4中使用所述0.01-0.03m且ph值為7.1-7.6的磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液漂洗2-4次。根據(jù)本公開第一方面，為了提高免疫試紙條使用中的準確性與靈敏度、減少非特異性相互作用，進一步地，步驟s4中使用含有0.4-0.6％(w/v)牛血清白蛋白和3-5％(w/v)蔗糖的磷酸鹽緩沖液處理10-20min。根據(jù)本公開第一方面，進一步地，步驟s4中使用雙蒸水漂洗2-4次。根據(jù)本公開第一方面，進一步地，所述樣品墊、標記抗體墊、抗體包被硝酸纖維素膜和吸收墊的長度比為(15-20):(10-12):(22-26):(18-22)。根據(jù)本公開第一方面，進一步地，本公開對所述樣品墊和標記抗體墊無特別限制，所述樣品墊可以為無紡布、聚酯膜、纖維素濾紙或玻璃纖維素膜；所述標記抗體墊為玻璃纖維素膜、聚酯膜、纖維素濾紙或無紡布；所述熒光標記為含鑭系元素聚苯乙烯熒光微球。根據(jù)本公開第一方面，進一步地，人髓過氧化物酶的第一單克隆抗體為購自hytest公司克隆號18b7的單克隆抗體；人髓過氧化物酶的第二單克隆抗體為購自hytest公司克隆號4b3的單克隆抗體。根據(jù)本公開第一方面，進一步地，為了提高吸收率、促進虹吸作用，所述吸收墊可以為吸水濾紙。本公開第二方面：提供了如上所述的制備方法制備得到的人髓過氧化物酶的免疫層析試紙條。下面通過實施例進一步說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不因此受到任何限制。本公開中，所述人髓過氧化物酶的第一單克隆抗體為購自hytest公司克隆號18b7的單克隆抗體；人髓過氧化物酶的第二單克隆抗體為購自hytest公司克隆號4b3的單克隆抗體；膠體金購自成都微森生物科技有限公司；含銪聚苯乙烯熒光微球購自美國bangs公司。實施例1取20ml40μg/ml膠體金溶液于50ml干凈的離心管中，恢復至室溫后，用0.2mol/lk2co3調(diào)整ph8.0，避光條件下以200轉/分鐘速率攪拌。將10μg人髓過氧化物酶第一單克隆抗體加入到0.5ml硼酸緩沖液中混勻后，緩慢滴加到膠體金中，繼續(xù)攪拌20min。然后緩慢滴加10％(w/v)的牛血清蛋白至終濃度為l％(w/v)，繼續(xù)攪拌1h。4℃靜置過夜，終止反應。反應結束后，4℃條件下15000轉/分鐘離心1h，棄上清液。將沉淀懸浮于原體積1/10的1％(w/v)的牛血清蛋白溶液中得到膠體金標記的含人髓過氧化物酶第一單克隆抗體的溶液，將所述溶液使用噴金點膜機均勻的以15μl/cm的噴涂速度均勻噴于玻璃纖維素膜上，于37℃干燥120min夠得到標記抗體墊。將6mg/ml的人髓過氧化物酶的第二單克隆抗體溶液和0.5％(w/v)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸鹽緩沖液按照體積比1：5混合均勻，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液；使用濃度為0.02m且ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋兔抗鼠igg至0.5mg/ml，得到兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液；將3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液使用定點噴膜儀以1.0μl/cm的噴涂速度均勻噴于硝酸纖維素膜上的一處作為檢測線，并且將兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液使用定點噴膜儀均勻噴霧于硝酸纖維素膜上的另一處作為質(zhì)控線，檢測線與質(zhì)控線之間間隔1.0cm，隨后置于37℃烘干2h，得到烘干后的硝酸纖維素膜；烘干后的硝酸纖維素膜在室溫下依次置于0.02m濃度的ph7.4磷酸鹽緩沖液中漂洗5次、含有0.5％(w/v)牛血清白蛋白和4％(w/v)蔗糖的磷酸鹽緩沖液處理15min、雙蒸水中漂洗3次，完成后于37℃放置120min干燥，得到抗體包被硝酸纖維素膜。將300mm的無紡布作為吸收墊、300mm的標記抗體墊、300mm的抗體包被硝酸纖維素膜、300mm的吸水濾紙依次連接組裝起來，制備得到膠體金標記的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條。實施例2將含銪聚苯乙烯熒光微球使用0.02m濃度的ph7.4磷酸鹽緩沖液稀釋為0.04mg/ml濃度，然后加入終濃度為2mm的edc(碳化二亞胺)和終濃度為5mm的nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)室溫下反應15min后以15000轉/分離心去除上清液。向沉淀中加入1.7μl濃度為6mg/ml的人髓過氧化物酶的第一單克隆抗體，室溫下反應4h，然后加入含有2％(w/v)甘氨酸、1％(w/v)牛血清白蛋白的0.02m濃度的ph7.4磷酸鹽緩沖液處理30min，離心去除上清液，再向沉淀中加入1％(w/v)牛血清白蛋白的0.02m濃度的ph7.4磷酸鹽緩沖液懸浮得到含銪聚苯乙烯熒光微球標記的人髓過氧化物酶的第一單克隆抗體溶液。將所述溶液使用噴金點膜機均勻的以15μl/cm的噴涂速度均勻噴于玻璃纖維素膜上，于37℃干燥120min得到標記抗體墊。將6mg/ml的人髓過氧化物酶的第二單克隆抗體溶液和0.5％(w/v)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸鹽緩沖液按照體積比1：5混合均勻，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液；使用濃度為0.02m且ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋兔抗鼠igg至0.5mg/ml，得到兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液；將3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液使用定點噴膜儀以1.0μl/cm的噴涂速度均勻噴于硝酸纖維素膜上的一處作為檢測線，并且將兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液使用定點噴膜儀均勻噴霧于硝酸纖維素膜上的另一處作為質(zhì)控線，檢測線與質(zhì)控線之間間隔1.0cm，隨后置于37℃烘干2h，得到烘干后的硝酸纖維素膜；烘干后的硝酸纖維素膜在室溫下依次置于0.02m濃度的ph7.4磷酸鹽緩沖液中漂洗5次、含有0.5％(w/v)牛血清白蛋白和4％(w/v)蔗糖的磷酸鹽緩沖液處理15min、雙蒸水中漂洗3次，完成后于37℃放置120min干燥，得到抗體包被硝酸纖維素膜。將300mm的無紡布作為吸收墊、300mm的標記抗體墊、300mm的抗體包被硝酸纖維素膜、300mm的吸水濾紙依次連接組裝起來，制備得到人髓過氧化物酶含銪聚苯乙烯熒光微球標記的免疫層析試紙條。對比例1通過與實施例2相同的方法制備得到標記抗體墊。使用濃度為0.02m且ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋兔抗鼠igg至0.5mg/ml，得到兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液；將1mg/ml的人髓過氧化物酶的第二單克隆抗體溶液使用定點噴膜儀以1.0μl/cm的噴涂速度均勻噴于硝酸纖維素膜上的一處作為檢測線，并且將兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液使用定點噴膜儀均勻噴霧于硝酸纖維素膜上的另一處作為質(zhì)控線，檢測線與質(zhì)控線之間間隔1.0cm，隨后置于37℃烘干1.5h，得到烘干后的硝酸纖維素膜；烘干后的硝酸纖維素膜在室溫下依次置于0.02m濃度的ph7.4磷酸鹽緩沖液中漂洗5次、含有0.5％(w/v)牛血清白蛋白和4％(w/v)蔗糖的磷酸鹽緩沖液處理15min、雙蒸水中漂洗3次，完成后于37℃放置120min干燥，得到抗體包被硝酸纖維素膜。將300mm的無紡布作為吸收墊、300mm的標記抗體墊、300mm的抗體包被硝酸纖維素膜、300mm的吸水濾紙依次連接組裝起來，制備得到人髓過氧化物酶含銪聚苯乙烯熒光微球標記的免疫層析試紙條。對比例2通過與實施例2相同的方法制備得到標記抗體墊。將6mg/ml的人髓過氧化物酶的第二單克隆抗體溶液和0.5體積％的edc(碳化二亞胺)磷酸鹽緩沖液按照體積比1：5混合均勻，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液；使用濃度為0.02m且ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋兔抗鼠igg至0.5mg/ml，得到兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液；將edc(碳化二亞胺)/抗體包被溶液使用定點噴膜儀以1.0μl/cm的噴涂速度均勻噴于硝酸纖維素膜上的一處作為檢測線，并且將兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液使用定點噴膜儀均勻噴霧于硝酸纖維素膜上的另一處作為質(zhì)控線，檢測線與質(zhì)控線之間間隔1.0cm，隨后置于37℃烘干2h，得到烘干后的硝酸纖維素膜；烘干后的硝酸纖維素膜在室溫下依次置于0.02m濃度的ph7.4磷酸鹽緩沖液中漂洗5次、含有0.5％(w/v)牛血清白蛋白和4％(w/v)蔗糖的磷酸鹽緩沖液處理15min、雙蒸水中漂洗3次，完成后于37℃放置120min干燥，得到抗體包被硝酸纖維素膜。將300mm的無紡布作為吸收墊、300mm的標記抗體墊、300mm的抗體包被硝酸纖維素膜、300mm的吸水濾紙依次連接組裝起來，制備得到人髓過氧化物酶含銪聚苯乙烯熒光微球標記的免疫層析試紙條。對比例3通過與實施例2相同的方法制備得到標記抗體墊。將6mg/ml的人髓過氧化物酶的第二單克隆抗體溶液和0.2％(w/v)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸鹽緩沖液按照體積比1：5混合均勻，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液；使用濃度為0.02m且ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋兔抗鼠igg至0.5mg/ml，得到兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液；將3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液使用定點噴膜儀以1.0μl/cm的噴涂速度均勻噴于硝酸纖維素膜上的一處作為檢測線，并且將兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液使用定點噴膜儀均勻噴霧于硝酸纖維素膜上的另一處作為質(zhì)控線，檢測線與質(zhì)控線之間間隔1.0cm，隨后置于37℃烘干2h，得到烘干后的硝酸纖維素膜；烘干后的硝酸纖維素膜在室溫下依次置于0.02m濃度的ph7.4磷酸鹽緩沖液中漂洗5次、含有0.5％(w/v)牛血清白蛋白和4％(w/v)蔗糖的磷酸鹽緩沖液處理15min、雙蒸水中漂洗3次，完成后于37℃放置120min干燥，得到抗體包被硝酸纖維素膜。將300mm的無紡布作為吸收墊、300mm的標記抗體墊、300mm的抗體包被硝酸纖維素膜、300mm的吸水濾紙依次連接組裝起來，制備得到人髓過氧化物酶含銪聚苯乙烯熒光微球標記的免疫層析試紙條。對比例4通過與實施例2相同的方法制備得到標記抗體墊。將6mg/ml的人髓過氧化物酶的第二單克隆抗體溶液和1％(w/v)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸鹽緩沖液按照體積比1：5混合均勻，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液；使用濃度為0.02m且ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋兔抗鼠igg至0.5mg/ml，得到兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液；將3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗體包被溶液使用定點噴膜儀以1.0μl/cm的噴涂速度均勻噴于硝酸纖維素膜上的一處作為檢測線，并且將兔抗鼠igg磷酸鹽緩沖液使用定點噴膜儀均勻噴霧于硝酸纖維素膜上的另一處作為質(zhì)控線，檢測線與質(zhì)控線之間間隔1.0cm，隨后置于37℃烘干2h，得到烘干后的硝酸纖維素膜；烘干后的硝酸纖維素膜在室溫下依次置于0.02m濃度的ph7.4磷酸鹽緩沖液中漂洗5次、含有0.5％(w/v)牛血清白蛋白和4％(w/v)蔗糖的磷酸鹽緩沖液處理15min、雙蒸水中漂洗3次，完成后于37℃放置120min干燥，得到抗體包被硝酸纖維素膜。將300mm的無紡布作為吸收墊、300mm的標記抗體墊、300mm的抗體包被硝酸纖維素膜、300mm的吸水濾紙依次連接組裝起來，制備得到人髓過氧化物酶含銪聚苯乙烯熒光微球標記的免疫層析試紙條。測試實施例1本測試實施例用于實施例1-2中制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條和對比例1中制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條的陰陽性檢測試驗。分別滴加含有10ng/ml人髓過氧化物酶的pbs溶液作為陽性溶液，不含有人髓過氧化物酶的pbs溶液作為陰性溶液在實施例和對比例中制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條的樣品吸收墊上，水平靜置15min后，檢測免疫層析試紙條的檢測線(t線)和質(zhì)控線(c線)狀態(tài)。其中，人髓過氧化物酶含銪聚苯乙烯熒光微球標記的免疫層析試紙條于熒光檢測裝置下檢測其狀態(tài)。實驗結果的判斷：免疫層析試紙條t線處出現(xiàn)紅色條帶或熒光條帶為陽性，記為“+”；t線處不出現(xiàn)紅色條帶或熒光條帶，c線處出現(xiàn)紅色條帶或熒光條帶為陰性，記為“－”。具體結果見表1。表1含有人髓過氧化物酶不含有人髓過氧化物酶實施例1+-實施例2+-對比例1--對比例2--對比例3--對比例4++經(jīng)表1中實施例1-2與對比例1-4比較可以看出，本公開制備得到的免疫層析試紙條，可以對10ng/ml的人髓過氧化物酶pbs溶液呈現(xiàn)出陽性反應，靈敏性好。測試實施例2本測試實施例用于檢測實施例1-2中制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條和對比例1中制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條的特異性。分別滴加含有10ng/ml人髓過氧化物酶、含有60mg/ml人血清白蛋白、100ng/ml癌胚抗原、1.6mg/ml高密度脂蛋白hdl的溶液在實施例和對比例中制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條的樣品吸收墊上，水平靜置15min后，檢測免疫層析試紙條的檢測線(t線)和質(zhì)控線(c線)狀態(tài)。其中，人髓過氧化物酶含銪聚苯乙烯熒光微球標記的免疫層析試紙條于熒光檢測裝置下檢測其狀態(tài)。實驗結果的判斷：免疫層析試紙條t線處出現(xiàn)紅色條帶或熒光條帶為陽性，記為“+”；t線處不出現(xiàn)紅色條帶或熒光條帶，c線處出現(xiàn)紅色條帶或熒光條帶為陰性，記為“－”。具體結果見表2。表2人髓過氧化物酶人血清白蛋白癌胚抗原高密度脂蛋白hdl實施例1+－－－實施例2+－－－對比例1－－－－對比例2－－－－對比例3－－－－對比例4+－－+經(jīng)表2中實施例1-2與對比例1-4比較可以看出，本公開制備得到的免疫層析試紙條的具有極好的特異性，不結合其他非目標蛋白。測試實施例3本測試實施例用于檢測實施例1-2中制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條和對比例1中制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條的敏感性。將100ng/ml人髓過氧化物酶的標準溶液分別稀釋為1/2、1/8、1/16、1/32標準溶液。分別滴加不同濃度的人髓過氧化物酶的溶液在實施例和對比例中制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條的樣品吸收墊上，水平靜置15min后，檢測免疫層析試紙條的檢測線(t線)和質(zhì)控線(c線)狀態(tài)。其中，人髓過氧化物酶含銪聚苯乙烯熒光微球標記的免疫層析試紙條于熒光檢測裝置下檢測其狀態(tài)。實驗結果的判斷：免疫層析試紙條t線處出現(xiàn)紅色條帶或熒光條帶為陽性，記為“+”；t線處不出現(xiàn)紅色條帶或熒光條帶，c線處出現(xiàn)紅色條帶或熒光條帶為陰性，記為“－”。具體結果見表3。表311/21/81/161/32實施例1++++－實施例2++++－對比例1++－－－對比例2++－－－對比例3++－－－對比例4++－－－經(jīng)表3中實施例1-2、對比例1-4比較可以看出，本公開制備得到的免疫層析試紙條靈敏度達到了6.25ng/ml，遠低于使用其他方法制備得到的免疫層析試紙條，同時3-氨基丙基三乙氧基硅烷的使用量也是影響免疫層析試紙條靈敏度的重要因素。測試實施例4本測試實施例用于檢測實施例1-2中制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條和對比例1中制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條的穩(wěn)定性。分別取4個不同批次生產(chǎn)的實施例1-2、對比例1中制備方法制備的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條置于4℃保存，隔4周后檢測陽性溶液和陰性溶液各5份。實驗結果的判斷：免疫層析試紙條t線處出現(xiàn)紅色條帶或熒光條帶為陽性，記為“+”；t線處不出現(xiàn)紅色條帶或熒光條帶，c線處出現(xiàn)紅色條帶或熒光條帶為陰性，記為“－”。具體結果見表4。表4經(jīng)表4中實施例1-2、對比例1-4中不同方法制備得到的不同批次的免疫層析試紙條的比較可以看出，本公開制備方法得到的免疫層析試紙條具有較好的穩(wěn)定性，有效控制了批間差。測試實施例5本測試實施例用于說明實施例2中人髓過氧化物酶免疫層析試紙條用于測定未知溶液中人髓過氧化物酶的濃度。標準曲線繪制：將25μg/ml人髓過氧化物酶的標準溶液分別稀釋為10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml人髓過氧化物酶標準溶液。分別滴加不同濃度的人髓過氧化物酶的溶液在實施例和對比例中制備得到的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條的樣品吸收墊上，水平靜置15min后，使用熒光檢測裝置檢測免疫層析試紙條的檢測線(t線)和質(zhì)控線(c線)熒光強度并繪制出標準曲線，標準曲線以t線/c線熒光強度的比值為縱坐標，人髓過氧化物酶標準溶液的濃度為橫坐標，建立方程并擬合標準曲線，將標準曲線整合于熒光檢測裝置熒光強度分析軟件中。樣品檢測：將待測樣品滴加到免疫層析試紙條，水平靜置15min。然后用熒光檢測裝置檢測，根據(jù)已整合儀器軟件的標準曲線計算得出所述的樣品中的人髓過氧化物酶的濃度。檢測結果驗證：將待測樣品使用人髓過氧化物酶(酶聯(lián)免疫法)濃度測定試劑盒(購自北京協(xié)和洛克生物技術有限責任公司)測定濃度，使用方法見說明書。具體結果見表5。表5樣品1樣品2樣品3酶聯(lián)免疫法檢測25.5±1.0ng/ml100.7±2.0ng/ml400.8±4.5ng/ml本法驗證結果26.5±1.2ng/ml104.5±2.5ng/ml405.0±4.0ng/ml誤差4％3.8％1.0％經(jīng)表5中數(shù)據(jù)可以看出本公開制備的含銪熒光微球標記的人髓過氧化物酶免疫層析試紙條可以用于測定未知溶液中人髓過氧化物酶的濃度，并且經(jīng)驗證證明本公開免疫層析試紙條檢測出的濃度和誤差小于5％。以上詳細描述了本公開的優(yōu)選實施方式，但是，本公開并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本公開的技術構思范圍內(nèi)，可以對本公開的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本公開的保護范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合。為了避免不必要的重復，本公開對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應當視為本公開所公開的內(nèi)容。當前第1頁12